De par leurs propriétés, les nanoparticules suscitent des sentiments très contrastés. Elles sont considérées comme prometteuses dans de nombreux champs d’application, notamment dans le domaine médical. Beaucoup d’approches thérapeutiques utilisent aujourd’hui des nanoparticules comme par exemple, pour soigner les cancers. Cependant, les nanoparticules sont également vues comme une source potentielle de danger pour la santé humaine, en particulier lorsque l’on considère les crises sanitaires historiques liées à l’inhalation répétée de particules de silice cristalline ou de fibres d’amiante qui provoque de graves maladies telles que la silicose et l’asbestose. Les macrophages alvéolaires sont aujourd’hui connus pour jouer un rôle central dans l’évolution de ces deux maladies. Nous nous sommes donc intéressés aux aspects à la fois positifs et négatifs des nanoparticules. Dans un premier projet, afin de répondre à un problème de santé public, nous avons étudié l’effet de différents types de nanoparticules de silices amorphes sur la dérégulation des fonctionnalités principales des macrophages. Les principaux tests effectués ont montré un effet important sur les macrophages lorsque les nanoparticules de silice sont à des concentrations subtoxiques (dose létale 20), en revanche nous avons seulement observé un léger effet lorsque les macrophages sont exposés à des doses journalières équivalentes aux normes d’expositions imposées. Dans un deuxième projet, nous avons développé une stratégie de cheval de Troie dans laquelle des macrophages différenciés in vitro servent à véhiculer une grande quantité de nanoparticules d’oxyde de fer photoactivables au niveau des sites tumoraux. Cela afin d’améliorer les radiothérapies actuelles. Les premiers tests ont démontré que le Ferinject® était peu toxique pour les macrophages même à de fortes concentrations. Ensuite, les expérimentations pré-cliniques effectuées sur la souris ont validé notre concept puisque les macrophages injectés dans la circulation sanguine sont capables de migrer vers la tumeur. / Because of their properties, nanoparticles have generated opposed views. They are perceived as promising in many fields of application, particularly in medicine. Nanoparticles are currently used in many therapeutic approaches such as cancer therapy. However, in view of past health crises related to the repeated inhalation of crystalline silica particles and asbestos fibers, nanoparticles are also viewed as a source of potential risks for human health. Alveolar macrophages are now known to play a major role in the evolution of these two diseases. We thus chose to study both the positive and negative aspects of nanoparticles. In order to address a public health issue, our first project focused on the effect of different types of amorphous silica nanoparticles on the disruption of the main functionalities of macrophages. The main tests performed showed a significant effect on macrophages when amorphous silica nanoparticles were tested at subtoxic concentrations (lethal dose 20). However, we only observed minor effects when macrophages were exposed to a daily dose equivalent to the safety standards. For the second project we developed a Trojan horse strategy using macrophages to bring a significant quantity of photoactivatable nanoparticles to the tumor site so as to improve current radiotherapies. The first assays proved that Ferinject® was not toxic to macrophages even at high concentrations. Then, the pre-clinical experiments performed on mice validated our strategy because macrophages injected into the bloodstream were able to migrate toward the tumor.

L'hydrolyse de l'ATP en ADP constitue la principale source d'énergie de la cellule. Le transport de ce nucléotide depuis son lieu de synthèse vers le cytosol est essentiel pour la plupart des réactions métaboliques et nécessite un passage à travers les membranes. Ainsi, un grand nombre de transporteurs d'ATP/ADP sont présents dans les différents organites tels que les mitochondries, les chloroplastes, et autres types de plastides mais aussi chez les bactéries pathogènes (Rickettsia prowazekii, Protoclamydiae amoebophila) (Trentmann et al, 2007).L'équipe s'intéresse principalement à 2 types de transporteurs d'ADP et d'ATP, la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) et la famille des NTT (plastes et bactéries). Malgré des fonctions similaires, ces 2 familles de transporteurs possèdent des propriétés biochimiques et structurales différentes. De nos jours, il n'existe aucune information structurale disponible sur la famille des NTTs. La détermination de cette structure pourrait permettre de comprendre le mécanisme de transport de ces transporteurs mais plus généralement comprendre le transport de l'ATP et ADP dans les cellules.Une étude a été initiée sur la structure et la fonction de la famille des NTT plus particulièrement des transporteurs chloroplastiques d'Arabidopsis thaliana mais aussi des transporteurs bactériens. Toutefois, ma thèse concerne principalement les transporteurs chloroplastiques NTT1 et NTT2. Ces 2 isoformes sont localisées dans la membrane interne des chloroplastes et permettent de pourvoir le stroma en ATP lorsque la photosynthèse ne peut pas avoir lieu par manque de lumière.Nous avons déterminé et optimisé les conditions de surexpression des 2 isoformes dans un système hétérologue puis de purification en détergent). Nous avons mis au point des méthodes permettant de caractériser le transporteur en solution et de mesurer son activité dans le but d'aboutir à une étude structurale. Des pistes de cristallisation ont également étaient obtenues. / ATP is the main energy currency in the cell and its transport across membranes is essential for most of the metabolic reactions. A large number of ATP/ADP transporters are present in the different cell organelles such as mitochondria, chloroplasts, other types of plastids and some are also found in bacteria (Rickettsia prowazekii, Protoclamydiae amoebophila) (Trentmann et al, 2007). The team is mainly interested in two distinct transporters families, the mitochondrial carrier family (MCF) and the NTT family. Despite similar function, mitochondrial ADP/ATP transporters (Pebay-Peyroula et al, 2003) and NTT proteins exhibit different structural and biochemical properties. To date no structural information is available on the NTT family. The determination of a structure would help for understanding the transport mechanism of these carriers and more generally the different mechanisms of the transport of ADP and ATP within the cell.We initiated a structure-function study on the NTT family focusing on chloroplast transporters from Arabidopsis thaliana and also from bacteria. My thesis is focused on chloroplast NTT1 and NTT2. These isoforms are localized in the inner membrane of chloroplast. They transport ATP inside the chloroplast in order to supply the different reactions occurring in the stroma when the photosynthesis does not occur.We have determined and optimized conditions to overexpress these 2 isoforms in heterologous systems and to purify the protein in detergents. We have also set up tools to characterize the carrier in solution and to measure its transport activity opening the way to functional and structural studies. We obtained promising crystallization hits.

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T23:13:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jorge_SusanElisabethDominguesCosta_D.pdf: 8714965 bytes, checksum: 3191d67be1e9be2f9782ce3483bcfd3a (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Le déficit en 21-hydroxylase est la cause la plus fréquente des hyperplasies congénitales des surrénales. Un grand nombre de nouvelles mutations a été trouvé dans le laboratoire qui centralise la plus grande cohorte de familles au niveau international et l’évaluation de leur sévérité était primordiale pour optimiser la prise en charge des patients (thérapeutique, conseil génétique). Grâce à l’analyse approfondie du phénotype des patients et au développement d’études fonctionnelles (in vitro, in silico), nous avons pu évaluer le retentissement de la plupart des 85 nouvelles mutations ; nous avons choisi comme témoins des mutations fréquentes de sévérité connue et nous avons comparé nos résultats avec ceux de la littérature. L’analyse plus approfondie d’une quinzaine de mutations rares a confirmé l’existence de bonnes corrélations phénotype-génotype comme ceci est décrit dans cette pathologie. Par ailleurs, les études structurales que nous avons développées ont permis d’améliorer les connaissances sur les relations structure-fonction des cytochromes P450 en général. / Steroid 21-hydroxylase deficiency is the most common enzymatic defect causing congenita ladrenal hyperplasia. A large number of new mutations has been detected in the laboratory, which centralizes the biggest cohort of families in the world, and evaluation of their severity wasessential to optimize the care of the patients (treatment, genetic counselling). Thanks to detailed analysis of the patients phenotype and to the development of functional studies (in vitro, in silico), we were able to evaluate the severity of most of the 85 novel mutations; we decided touse as controls frequent known mutations and to compare our results with those of literature. Themore detailed analysis of about fifteen rare mutations confirmed the existence of goodcorrelations phenotype-genotype as this is described in this pathology. Moreover, the structural studies we developed led to improve the knowledge on structure-function relationship of theP450 cytochromes family.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est responsable d’environ 25% de l’ensemble des cancers pédiatriques. Chez 85% des enfants diagnostiqués, la LLA entraîne une prolifération massive et incontrôlée de lymphocytes immatures de type précurseurs B dans la moelle osseuse (LLA pré-B). Des avancées intéressantes ont été faites au cours des trente dernières années et ont mené à une augmentation de l’efficacité des traitements thérapeutiques. Plus de 80% des enfants atteints de LLA seront guéris de cette maladie. Malheureusement, ces traitements manquent de spécificité à cause du manque de connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués durant l’initiation et le développement de la LLA pré-B pédiatrique. En d’autres termes, nous connaissons peu de chose sur l’étiologie de cette maladie. Plus de 25% des enfants atteints de la LLA pré-B présentent la translocation chromosomique t(12;21)(p13;q22) qui implique les gènes ETV6 et AML1. Celle-ci est formée in utero et mène à l’expression de la protéine chimère transcriptionnelle ETV6-AML1, dont la présence seule ne suffit pas au développement de la LLA pré-B. Ainsi, d’autres événements génétiques sont nécessaires au développement de cette leucémie. La délétion de l’allèle résiduel de ETV6 est un événement génétique fréquemment rencontré au moment du diagnostic de la LLA pré-B t(12;21)+. Cette délétion entraîne l’inactivation complète de ETV6 dans les lymphocytes pré-B leucémiques. ETV6 est un répresseur transcriptionnel de la famille Ets. Mon hypothèse de recherche est que ETV6 agit comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. L’inactivation de ETV6 causerait une dérégulation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles et, par le fait même, favoriserait l’initiation et le déroulement de la leucémogenèse pédiatrique. Dans le cadre de mon projet, comme peu de cibles transcriptionnelles de ETV6 sont connues, j’ai effectué des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine et des essais luciférases qui ont permis d’identifier six nouvelles cibles transcriptionnelles: TP53 (p53 et Δ133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 et LUM. J’ai démontré que la régulation transcriptionnelle médiée par ETV6 requiert la présence de ses deux domaines fonctionnels: PNT (interactions protéiques) et ETS (liaison à l’ADN). Ces domaines favorisent la reconnaissance d’un site EBS consensus dans une région située près du promoteur de base. Ce mécanisme peut dépendre du promoteur régulé par ETV6, mais également du contexte cellulaire. Des études fonctionnelles réalisées sur des lymphocytes pré-B leucémiques ont permis de mesurer l’impact de la dérégulation de l’expression des cibles transcriptionnelles de ETV6 sur trois voies biologiques: la prolifération cellulaire, l’apoptose induite par un stress génotoxique et la migration cellulaire dirigée par la voie de signalisation CXCL12/CXCR4. Ceci a permis de démontrer l’implication des gènes SPHK1, IL-18 et PTGER4 durant la leucémogenèse pédiatrique. Cette étude est une des premières à suggérer le rôle de ETV6 comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. Suite à l’inactivation du répresseur transcriptionnel ETV6, l’augmentation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles favoriserait la prolifération et la survie des lymphocytes pré-B leucémiques dans la moelle osseuse. L’identification de nouveaux gènes impliqués dans le développement de la LLA pré-B pédiatrique ouvre la porte au développement de nouveaux traitements thérapeutiques qui pourront présenter une meilleure spécificité envers l’étiologie de la maladie. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) accounts for approximately 25% of all paediatric cancers. Approximately 85% of ALL cases happen in immature B precursors lymphocytes (pre-B ALL). Pre-B ALL is a sporadic cancer that leads to the massive proliferation of leukemia pre-B lymphocytes in the bone marrow. During the past 30 years, the scientific community has developed efficient therapeutic treatments against paediatric ALL, reaching more than 80% cure rate. However, these treatments lack specificity because of the lack of knowledge regarding the molecular mechanisms involved in the initiation and progression of paediatric pre-B ALL. In other words, we know little about the aetiology of this disease. Approximately 25% of children affected with pre-B ALL carry the chromosomal translocation t(12;21)(p13;q22) involving the ETV6 and AML1 genes. This translocation originates in utero and leads to the expression of the transcriptional chimera ETV6-AML1, which alone is insufficient to trigger the development of pre-B ALL. Therefore, other genetic events would be required to initiate paediatric leukemogenesis. The deletion of the residual allele of ETV6 is frequently observed at the diagnosis of pre-B ALL t(12;21)+. This leads to the complete inactivation of ETV6 in leukemia pre-B lymphocytes. ETV6 is a transcriptional repressor of the Ets family. My research hypothesis is that ETV6 acts as a tumour suppressor gene in paediatric pre-B ALL. The inactivation of ETV6 would lead to the deregulated expression of its transcriptional targets and, consequently, would favour the initiation and progression of paediatric leukemogenesis. Given the fact that only very few ETV6 transcriptional targets are known, I initially performed chromatin immunoprecipitation experiments and luciferase assays that enabled the identification of six novel transcriptional targets: TP53 (p53 and Δ133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 and LUM. The ETV6-mediated transcriptional regulation involves both functional domains: PNT (protein interactions) and ETS (DNA-binding domain). These functional domains facilitate the recognition of consensus EBS sites located in a region close to the basal promoter, a molecular mechanism used according to the target promoter and cellular context. Functional studies using leukemia pre-B lymphocytes were useful to understand the role of the ETV6 transcriptional targets during cell proliferation, induction of apoptosis and cell migration through the CXC12/CXCR4 signalling pathway. These functional studies showed the implication of SPHK1, IL-18 and PTGER4 genes during paediatric leukemogenesis. This study is one of the first to support the role of ETV6 as a tumour suppressor gene in paediatric pre-B ALL. Once ETV6 is inactivated, the increased expression of its transcriptional targets favours the proliferation and survival of leukemia pre-B lymphocytes in the bone marrow. The identification of new genes involved in the development of paediatric pre-B ALL opens new doors to the development of therapeutic treatments with a better specificity toward the aetiology of the disease.

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