Made available in DSpace on 2016-08-19T12:56:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao Francisco.pdf: 2147558 bytes, checksum: b0b562717d876cfad47f45868c73ab80 (MD5) Previous issue date: 2013-12-20 / Tiquira, a strong content beverage from Maranhão ( Brazil ), obtained from cassava (Manihot esculenta Crantz.) has its production concentrated in several counties of the State, through a handmade process , rather primitive, in which the conversion of starch cassava is taken into fermentable sugars by fungi which is found on the native beijus of manioc where strains are picked at random. Alcoholic fermentation is also made by yeasts found in the environment. Its commercialization is practiced informally, making it difficult to record statistical data of production and the number of producers in the Ministry of Agriculture. In order to optimize this process, commercial enzymes, strains of fungi (Aspergillus niger), were used to in order to convert starch into fermentable wort and pressed yeasts for fermentation. The processes proposed here follow three steps: gelation of starch scarification and subsequent dextrinization the sugars, alcoholic fermentation and distillation of fermented wine. Substituting the mold for commercial enzymes in the proposed circumstances, the manufacturing of tiquira was performed in just 25 hours, whereas when using fungi isolated, the production of tiquira took approximately 136 hours for its processing. As one can see, there was a considerable reduction of time in the two cases presented here in relation to the traditional process, which takes approximately 20 days to achieve the distillate. It was also found that the fermentation and destillation of the wort resulting from the scarification of cassava is equivalent to that of cane sugar, and both processes can be processed with the same equipment by tiquira producers. It was shown that the concentrations of copper and ethyl carbamate were visibly reduced in comparison to the traditional process, enabling a better quality of the beverage, as well as reducing the risks to consumer health. From the experiments it can be concluded that the replacement of the traditional process by commercial enzymes, fungi isolated and pressed yeast are highly and technically recommended primarily to small producers. / A tiquira é uma bebida típica do Maranhão (Brasil), obtida a partir de mandioca (Manihot esculenta, Crantz.), sua produção se concentra em diversos municípios do Estado, através de um processo artesanal, bastante primitivo, no qual a conversão do amido de mandioca em açúcares fermentescíveis é feita por bolores nativos que surgem sobre os beijus de massa de mandioca, onde as cepas são colhidas ao acaso. A fermentação alcoólica também é feita por leveduras selvagens. Tem sua comercialização praticada de modo informal, dificultando o registro de dados estatísticos de produção e número de produtor no Ministério da Agricultura. Com o objetivo de otimizar o referido processo, utilizaram-se, enzimas comerciais, cepas de fungos (Aspergillus níger), para a conversão do amido em mosto fermentescíveis e leveduras prensadas para fermentação. Os processos aqui propostos seguiram três etapas: gelificação do amido com a posterior dextrinização e sacarificação a açúcares, fermentação alcoólica e destilação do vinho fermentado. Substituindo-se os bolores por enzimas comerciais nas circunstâncias propostas, a fabricação da tiquira foi realizada em apenas 25 horas, enquanto que ao utilizar fungos isolados, a produção do aguardente demorou, aproximadamente, 136 horas para o seu processamento. Evidenciou-se assim, uma considerável redução de tempo, nos dois processos aqui apresentados em relação ao processo tradicional, que demora, aproximadamente, 20 dias para a consecução do destilado. Verificou-se também que os processos de fermentação e destilação do mosto oriundos da sacarificação da massa de mandioca são equivalentes ao da cana-de-açúcar, podendo ser processados com os mesmos equipamentos, por pequenos produtores de tiquira. Comprovou-se que as concentrações de cobre e carbamato de etila foram visivelmente reduzidas nos processos propostos em relação ao processo tradicional, possibilitando uma melhor qualidade da bebida, assim como reduzindo os riscos à saúde dos consumidores. A partir dos experimentos realizados conclui-se que a substituição do processo tradicional por enzimas comerciais, fungos isolados e levedura prensada se mostra tecnicamente possível e recomendada, primordialmente, aos pequenos produtores.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4514.pdf: 2385637 bytes, checksum: 89b533535415a993d655f83f1387c6f0 (MD5) Previous issue date: 2012-06-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / The selection of cellulase-producing fungi is one of the possible estrategies for obtaining necessary enzymes to hydrolyze the lignocellulosic material of plant biomass and thereby contribute to the viability of cellulosic ethanol production. The aim of this study was achive a screening of isolated fungi from the Amazon region to assess the production of enzymes related to plant biomass degradation, in order to select a line for production, purification and biochemical, kinetical and and structural biology characterizationof the ß-Galactosidase enzyme. Therefore, this work was undertaken in three stages, first of all it was performed a screening of 40 fungal strains isolated from the Amazon region through the cultivation in solid state fermentation (FES) at 35ºC for 240 hours, using as substrate wheat bran. It was evaluated the production of xylanase, endoglucanase, FPase, pectinase, ß-Glicosidase and total protein, and the fungi that stood out were: P6B2, the best producer of xylanase, P47C3 (Aspergillus niger), the best producer endoglucanase and ß-Glicosidase and P40B3, the best producer of FPase. These three fungi were selected for the second phase of this work for assessment in the production of xylanase, FPase, endoglucanase, ß-Glicosidase and total protein by submerged fermentation (FSm). The fermentation took place for 5 days at 30ºC and 200 rpm with a source of carbon: 1% of wheat bran washed and nutrient medium. The fungi P47C3, which was identified as Aspergillus niger, showed the best production of these enzymes, being selected for the third stage of this project. This last step involved the selection of an enzyme that has not been elucidated its structural biology. Given this fact, we carried out a study of selection of the medium, purification and biochemicalkinetical characterization of ß-Galactosidase. The Aspergillus niger (P47C3) was subjected to submerged for 5 days at 200 rpm at 30ºC. Purification occured in three steps using: ion exchange column SP-Sephadex C-50 and SP TSK-5PW column, and gelfiltration, with the resin Sephacryl S-200. The enzyme ß-Galactosidase showed a molecular weight of 125 kDa, being stable at pH 4,0, with anoptimum temperature of 55ºC. It was evaluated theKmap e Vmáxap of two substrates, PNPG and lactose, being: 2,204 mM-0,285 mM/min and 2,101 mM-0,75mM/min, respectively. The inhibition of hydrolasis of the substrate PNPG by ß-Galactosidase in the presence of galactose inhibitor product showed a Ki value of 5,01 mM. Finally, the ß-Galactosidase was subjected to crystallization conditions, the best conditions occurred in buffer 0,2M Tris- HCl, with the precipitation agent, 12% PEG 4000 at pH 8,6. Therefore, the unpublished protocol for purification of ß-Galactosidase was efficient and it is possible to crystallize this enzyme of isolated fungi from the Amazon region, which showed great potencial for the production of this enzyme and that the future can be used in industrial application and biotechnological innovations. / A seleção de fungos produtores de celulases é uma das possíveis estratégias para a obtenção das enzimas necessárias para hidrolisar o material lignocelulósico da biomassa vegetal e com isso contribuir para a viabilização da produção de etanol celulósico. O objetivo desse trabalho foi realizar um screening dos fungos isolados da região amazônica para a avaliação da produção de enzimas relacionadas à degradação da biomassa vegetal, a fim de selecionar uma linhagem para produção, purificação e caracterização bioquímica, cinética e biologia estrutural da enzima ß-Galactosidase. Dessa forma, esse trabalho foi realizado em três etapas, primeiramente foi realizado um screening de 40 linhagens fúngicas isoladas da região amazônica, através do cultivo em fermentação em estado sólido (FES), a 35°C, por 240 horas, utilizando como substrato o farelo de trigo. Avaliou-se a produção de xilanase, endoglucanase, FPase, pectinase, ßglicosidase e proteínas totais, sendo que os fungos que mais se destacaram foram o: P6B2, melhor produtor de xilanase, P47C3 (Aspergillus niger), melhor produtor de endoglucanase e ß-glicosidase e o P40B3, melhor produtor de FPase. Esses três fungos, foram selecionados para a segunda fase do trabalho para avaliação na produção de xilanase, FPase, endoglucanase, ß-glicosidase e proteínas Totais por fermentação submersa (FSm). A fermentação ocorreu por 5 dias, à 30ºC e 200 rpm tendo como fonte de carbono: 1% de farelo de trigo lavado e meio nutriente. O fungo P47C3, identificado como Aspergillus niger, apresentou melhor produção dessas enzimas, sendo selecionado para a terceira etapa desse projeto. Essa última etapa, envolveu a escolha de uma enzima que não estivesse sua biologia estrutural elucidada. Diante desse fato, realizou-se um estudo de seleção do meio de cultivo, purificação e caracterização bioquimico-cinética da ß-Galactosidase. O fungo Aspergillus niger (P47C3) foi submetido a fermentação submersa, durante 5 dias, à 200 rpm em 30ºC. A purificação ocorreu em três etapas utilizando: colunas de troca iônica SP - Sephadex C-50 e a coluna SP -TSK 5PW; e gel filtração, com a resina Sephacryl S-200. A enzima ß-Galactosidase apresentou uma massa molecular de 125 kDa, sendo estável em pH 4,0, e com temperatura ótima de 55ºC. Avaliou-se a Kmap e Vmáxap de dois substratos, o PNPG e a lactose, sendo: 2,204 mM - 0,285 mM/min e 2,101 mM 0,750 mM/min, respectivamente. A inibição da hidrólise do substrato PNPG pela ß-Galactosidase na presença do produto inibidor galactose apresentou um valor de Ki de 5,01 mM. Por fim, a ß-Galactosidase foi submetida a condições de cristalização, as melhores condições ocorreram em tampão 0,2M Tris-HCl, tendo como agente precipitante, PEG 4000 12% em pH 8,6. Portanto, o protocolo inédito de purificação da ß-Galactosidase foi eficiente, sendo possível cristalizar essa enzima do fungo isolado da região amazônica, o qual apresentou grande potencial para a produção dessa enzima e que futuramente possa ser utilizado em aplicações industriais e inovações biotecnológicas.