La généalogie de trente proposants atteints de la mutation dite canadienne-française (délétion de 10Kb) de l'hypercholestérolémie familiale a été reconstruite. Les proposants, leurs parents et leurs grands-parents montrent une concentration géographique croissante dans les régions de la Côte-du-Sud et du Bas-Saint-Laurent. Les parents présumés porteurs de la mutation sont plus apparentés entre eux que les parents présumés sains. Vingt-quatre ancêtres communs à toutes les généalogies ont été identifiés. Parmi ceux-ci, six souches familiales différentes sont communes à toutes les généalogies des parents présumés porteurs et viennent principalement des provinces de l'ouest de la France. Ces ancêtres ont donc pu avoir introduit la mutation au Québec.

L’identification des gènes de maladies Mendeliennes été rendue possible dans les années 1980. Le séquençage du génome humain dans les années 2000, et l’arrivée du séquençage haut débit dans les années 2010 ont permis une progression phénoménale du rythme de ces découvertes génétiques. Cependant, ces techniques ont permis d’élucider les maladies les plus accessibles, de par leur homogénéité génétique, leur forte pénétrance pour les maladies dominantes, et leur prévalence élevée. Aujourd’hui, la communauté génétique se heurte à des difficultés de plus en plus nombreuses pour identifier les maladies non monogéniques, hétérogènes, ou très rares : recruter des familles porteuses d’une maladie très rare et cliniquement bien caractérisée, ou de grandes cohortes de patients atteints de maladies communes à composante génétique, nécessite un effort clinique, logistique et financier important. De plus, le séquençage d’exome pris isolément ne permet généralement pas l’élucidation de ces pathologies. Cet outil bien que puissant trouve ses limites dans les modèles génétiques sus-cités. La réussite des approches récentes vient de son utilisation en association avec d’autres techniques, adaptées aux caractéristiques des maladies comme la rareté, la dimension polygénique, ou l’hétérogénéité génétique. J’ai utilisé le séquençage d’exome dans l’identification de gènes de maladies cardiovasculaires rares, par trois stratégies combinées différentes. La première pathologie appelée stomatocytose héréditaire, est rare, relativement homogène mais présente des difficultés de phénotypage. Elle a été caractérisée par séquençage d’exome en association avec une analyse de liaison traditionnelle et l’identification d’une endophénotype fiable. Cette approche a été appliquée avec succès dans ce modèle relativement peu complexe de maladie. La seconde pathologie étudiée, l’anévrysme de l’aorte abdominale (AAA), est une maladie commune à forte composante héréditaire, avec de rares formes dominantes à pénétrance élevée. J’ai associé séquençage d’exome en modèle dominant et recherche de variants rares dans une cohorte de cas sporadiques afin d’identifier un gène de susceptibilité à la pathologie. Cette approche s’est révélée plus complexe à mettre en place, et son efficacité peut être discutée dans le cas d'une étude d'association centrée sur un gène candidat. Enfin, la troisième partie de ce travail est consacrée à la dysplasie fibromusculaire (DFM), maladie très hétérogène sur le plan génétique, peu pénétrante, et d’endophénotype peu accessible. J’ai appliqué dans cette troisième étape le séquençage d’exome à plus grande échelle (30 individus), en association à des stratégies de filtres sophistiqués exploitant tous les types de transmission Mendélienne. J'y ai aussi associé l'utilisation des outils bioinformatiques et bases de données biologiques accessibles à la communauté scientifique. Les résultats obtenus par cette dernière approche sont prometteurs, probablement du fait des caractéristiques inhérentes de cette pathologie. L’utilisation de ces trois stratégies très différentes, adaptées aux contraintes de chaque pathologie, permet d’évaluer la puissance et l’efficacité des approches combinées utilisant le séquençage d’exome. Leurs difficultés inhérentes, leur inadaptation à certaines situations génétiques, ainsi que les pistes d’amélioration nécessaires pour l’élucidation des maladies génétiques de cause inconnue sont aussi abordés. / Identifying genes of Mendelian disorders has started within the eighties. The pace of new genes discovery has been dramatically accelerated by the availability of the human genome sequence in the 2000s, and the next-generation sequencing technologies in the 2010s. However, a majority of the elucidated conditions so far correspond to relatively simplified situations, where the prevalence and the penetrance of the condition are high and the genetic heterogeneity is low. Nowadays, geneticists meet more and more situations where gene identification in unknown disorders can be tricky. Heritable conditions that are very rare, heterogenous or with imperfect Mendelian transmission can only be elucidated using large cohorts of patients, with a very well-characterized phenotype. This requires clinical, financial and logistical efforts to be made by the research teams. Generally, using exome sequencing alone is not efficient enough to elucidate these types of conditions. The power of recently developed strategies comes from its association with other genetic analysis tools, that have been specifically developed in the context of rare, heterogenous, or polygenic disorders. I employed exome sequencing in the identification of cardiovascular genetic conditions, using three different strategies. In the first condition, called hereditary xerocytosis, using linkage analysis together with exome sequencing of distant relatives was successful in identifying the causative gene. This was made possible by the identification of a reliable endophenotype, and the relative genetic homogeneity of the disorder. The second condition I studied is the abdominal aortic aneurysm (AAA), a common disorder with a strong hereditary component and rare situations of fully penetrant, dominant inheritance. I combined exome sequencing in a family with dominant inheritance with rare variants analysis of the candidate gene in a large cohort of sporadic AAA. This analysis is more complex and can be hazardous in the context of a candidate gene approach. The third strategy was developed for the study of fibromuscular dysplasia (FMD) which is a very heterogenous condition with low penetrance and no specific endophenotype. I combined exome sequencing in a group of 30 cases and relatives with filtering strategies for any type of Mendelian inheritance. I also used available bioinformatics tools and databases for refining the candidate genes filtering. This strategy provided promising results, probably due to the genetic characteristics of this condition. In each of these examples, I adapted the analysis strategy to the peculiarities of the disorder. The results presented here enable to evaluate the efficiency of combined approaches using exome sequencing. Their specificities, limits, and the optimization that need to be done to elucidate the remaining unsolved genetic conditions are discussed.

Les duplications de gènes contribuent grandement à l'augmentation de la complexité des organismes en fournissant du nouveau matériel brut sur lequel agit la sélection naturelle. De ces duplications, c’est la duplication de génome qui a l’impact le plus important dû à la quantité de gènes impliqués. Plusieurs événements de duplication de génome ont eu lieu au fil de l'évolution de nombreuses lignées d'organismes. Une grande partie des gènes dupliqués créés lors de ces événements accumuleront des mutations délétères et seront inactivés ou disparaîtront du génome complètement, mais d'autres seront retenus. La rétention de certains gènes a été liée à divers facteurs comme le dosage génique et le niveau d'expression. Ce projet se concentre sur l’impact de la participation à des complexes protéiques sur la rétention des copies créés par des événements successifs de duplication de génome chez Paramecium tetraurelia. Nous avons d’abord prédit la composition de 885 complexes protéiques à travers les relations d'orthologie avec cinq espèces modèles. Ces complexes nous ont ensuite permis de déterminer que les gènes impliqués dans ces complexes avaient des niveaux d’expression plus élevés et plus corrélés, facteurs ayant déjà été associés avec un taux de rétention plus élevé. Nous avons également décelé une plus grande rétention d’un nombre pair de copies chez les gènes participant à des complexes protéiques, observation potentiellement reliée aux propriétés structurales des complexes. Parallèlement, nous avons noté un effet similaire à la participation à des complexes protéiques chez les gènes possédant des orthologues chez toutes les espèces modèles utilisées, démontrant que cet effet de conservation pouvait s’ajouter à celui de la participation à des complexes pour augmenter le niveau d’expression des gènes impliqués et le garder plus corrélé. Ensemble, ces facteurs présentent une image complexe de facteurs interreliés qui peuvent s’additionner pour influencer le sort des copies au fil de l’évolution / Gene duplications contribute greatly to the increase in organismal complexity by providing new material for natural selection to act upon. Of these duplication events, whole-genome duplication has a major impact due to the sheer amount of gene copies produced. Several events of whole-genome duplication have occurred throughout the evolutionary history of many lineages. The greater part of the duplicated genes created during these events will accumulate deleterious mutations, become inactivated and will disappear completely from the genome, but some will be maintained over time. Several factors have been linked to the retention of certain genes such as gene dosage or the level of expression. This project focuses on the impact of participation in a protein complex on the retention of copies created during several successive events of whole-genome duplication in the ciliate Paramecium tetraurelia. First, we predicted the composition of 885 protein complexes through orthologous relationships with five model species. Those protein complexes then allowed us to determine that genes participating in those complexes had higher and more correlated expression, both factors previously linked in the literature with a higher retention rate. We also observed a greater retention of even numbers of copies for genes participating in protein complexes, observation which might be connected to structural properties of protein complexes. At the same time, we noted an effect similar to protein complex participation in genes with orthologs in all our model species used and determined that this might partially be caused by an overlap between the genes participating in protein complexes and those being conserved in all the model species However, we also showed that the effect of widespread conservation was independent of that of complex participation. Together, those factors paint a complex picture of interconnected factors that can interact to influence the fate of copies through the course of evolution. / Duplication génique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La pollinisation et la fécondation induisent, dans le pistil, l'expression de nombreux messagers. Certains de ceux-ci sont nouvellement produits tandis que d'autres voient leur expression augmenter. Ce mémoire expose les résultats obtenus pour trois de ces gènes induits par la pollinisation et/ou la fécondation chez Solanum chacoense Bitt., une pomme de terre sauvage. Le premier, SPP2, est une désoxygénase de fonction inconnue de la famille des 2-oxoglutarate dépendantes, que les identités de séquence rapprochent d'enzymes impliquées dans les voies de biosynthèse d'alcaloïdes. Ce clone fut isolé simultanémment de deux banques d'ADNc construites à partir de pistils pollinisés depuis 48 heures (banque PP48) et 96 heures (banque 0v96), par la méthode d'hybridation soustractive. Le second gène, l'ACC oxydase qui est l'enzyme responsable de transformer l'ACC en éthylène, fut isolé dans la banque d'ADNc PP48 par la méthode du criblage différentiel. Le corps de ce mémoire traite principalement de ces deux premiers gènes, le troisième nommé SPP30 étant présenté en annexe sous forme d'article manuscrit, afin de mieux cerner la discussion. Ce troisième gène, SPP30, est très fortement homologue à un antigène de surface de Plasmodium falciparum, l'agent causal de la malaria, et fut isolé dans la banque d'ADNc PP48 par hybridation soustractive. L'ACC oxydase est un gène qui a déjà été caractérisé chez un grand nombre d'espèces de plantes. Depuis longtemps déjà il est établi que l'ACC oxydase est une importante enzyme de la voie de biosynthèse de l'éthylène, et que ce dernier est connu pour ses effets au niveau de la sénescence des pièces florales, sénescence qu'induisent les événements de pollinisation et de fécondation chez les végétaux. Pour cette raison, nous n'avons pas poussé très avant sa caractérisation. Une hybridation d'ARN de type northern démontre tout de même que, chez Solanum chacoense, l'expression de l'ACC oxydase augmente fortement dans le pistil suite à une pollinisation de 48 heures. L'intérêt du clone SPP2, quant à lui, nous est apparu grandissant au fur et à mesure que sa caractérisation progressait. Nous avons réussi, par le biais de nombreuses expérimentations, a démontrer que les ARNm de la désoxygénase SPP2 sont non seulement induits dans les ovaires matures par la pollinisation (compatible ou non), mais également par la fécondation et la blessure du style. On ne peut détecter les ARNm de SPP2 dans le style des fleurs matures, car son patron d'expression régresse de l'extrémité du style jusqu'à l'ovaire, et cela en fonction du développement floral. On constate aussi que l'augmentation de l'expression de SPP2 que l'on peut observer dans les ovaires matures de S. chacoense suite à la pollinisation et la fécondation, n'est pas le résultat du développement floral normal des fleurs. De plus, la période durant laquelle l'expression de SPP2 est maximale, correspond en fait à la période de réceptivité de la fleur à la fécondation. Finalement, le patron d'expression de SPP2 coïncide avec la zone d'abcission du style. Le patron d'expression de SPP2 nous laisse penser que cette enzyme pourrait être impliquée dans la voie de biosynthèse de métabolites secondaires pouvant jouer un rôle dans le guidage et la croissance des tubes polliniques vers les ovules. Aussi, la forme que prend l'expression des ARNm de SPP2 au niveau de la base du style, nous laisse penser que SPP2 pourrait également jouer un rôle de marqueur cellulaire entre le style et l'ovaire. Finalement, on sait que SPP2 est principalement exprimée au niveau du pistil, des feuilles et des fruits, et que son expression coïncide (dans les fleurs) avec la période pendant laquelle les fleurs de S. chacoense sont réceptives à la pollinisation et à la fécondation, alors que sa diminution coïncide avec la période à partir de laquelle la fécondation ne peut plus avoir lieu chez les fleurs. Tout ceci nous laisse penser que notre désoxygénase (présente de façon constitutive et induite par la pollinisation, la fécondation ou la blessure), pourrait être impliquée dans la voie de biosynthèse d'un métabolite secondaire tels qu'un alcaloïde possédant des propriétés anti-microbiennes ou encore, anti-herbivores.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram négatif possédant un métabolisme très versatile lui permattant de proliférer dans plusieurs types environnements. Sa capacité à produire plusieurs facteurs de virulence lui permet de causer des infections opportunistes tel que des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique. Notre équipe a développé la mutagénèse à étiquette, basée sur la PCR (PCR based Siggnature-tagged mutagenesis), permettant de cribler une banque de 7968 mutants. Cette technique a permis la sélection de 214 mutants représentant des évènements d’insertion d’un mini-transposon dans 148 gènes différents. De ces nouveaux gènes essentiels à l’infection par P. aeruginosa, nous avons choisi de caractériser le gène PA3498. Nous avons conclu que la protéine codée par ce gène est nécessaire à l’initiation et/ou au maintien du pathogène in vivo ainsi qu’à la maturation des protéases sécrétées par P. aeruginosa et qu’elle est homologue à l’oxydoréductase PDR de Burkholderia cepacia. / Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacteria causing chronic pulmonary infections in cystic fibrosis patients. Virulence factors of this pathogen facilitate the colonization of the pulmonary tract and lungs of cystic fibrosis patients. Our team has developed a PCR-based signature-tagged mutagenesis technique permitting the screening of a collection of 7968 mutants. A total of 214 mutants, representing transposition events into 148 open reading frames, were shown to be attenuated in lung infection and were retained for further analysis. Of these genes, we chose PA3498 for its characterization. We have concluded that this gene is coding for an oxydoreductase sharing homology with a familly of oxydoreductases including PDR protein of Burkholderia cepacia. Finally, PA3498 protein is needed to initiate or/and to maintain the pathogen in vivo and this protein plays a role in the maturation and processing of the P. aeruginosa exoproteases.

Certaines mutations de rôle inconnu dans le gène UL97 du cytomégalovirus humain ont été retrouvées dans une étude clinique comparant l'efficacité du ganciclovir et du valganciclovir oral administrés chez des patients transplantés d'organe solide. Sans isolât clinique, il est difficile de distinguer les mutations associées à la résistance, les mutations associées au polymorphisme viral et les mutations compensatrices. L'objectif de ce projet de maîtrise consiste à caractériser les mutations détectées dans le gène UL97 à l'aide de la technologie des chromosomes bactériens artificiels. Pour évaluer le rôle de ces mutations, une méthode a été développée pour générer des virus recombinants mutants. Des cellules humaines permissives ont été transfectées avec l'ADN de virus recombinants mutants clones dans un chromosome bactérien artificiel. La sensibilité au ganciclovir des virus reconstitués a ensuite été évaluée. Les mutations de rôle inconnu retrouvées dans l'étude clinique semblent associées au polymorphisme viral.

Nous essayons de trouver de nouvelles interactions géniques pouvant donner une résistance ou une susceptibilité pour développer la schizophrénie. Nous avons donc fait l’enrichissement de voies en utilisant GSEA et Biofilter. Nous avons ensuite cherché de nouvelles interactions avec la méthode JE et la régression logistique parmi les paires de gènes identifiées. De plus, nous avons obtenu plus de résultats statistiquement significatifs qu’une sélection se basant sur les valeurs d’association marginale. Par ailleurs, les résultats pointent certains candidats intéressants comme le gène NRXN1 qui code pour une protéine d’adhésion cellulaire du système nerveux et qui aurait une interaction causant une susceptibilité avec le gène ROBO1, un gène impliqué dans la guidance des axones, et une autre avec le gène CDH13, un gène jouant le rôle de régulateur négatif dans la croissance des axones. Ces trois gènes sont déjà liés à la schizophrénie dans la littérature et pourraient servir de biomarqueurs.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Les leishmanioses se caractérisent par divers symptômes allant de lésions cutanées guérissant spontanément, causées surtout par L. major, . à des infections viscérales potentiellement mortelles causées par le complexe L. donovani/L. infantum. Malgré des génomes presque identiques, des analyses comparatives sur biopuces ont révélé d'importantes différences d'expression génique entre l~s deux stades de vie, promastigotes et amastigotes chez ces deux espèces, ce qui pourrait contribuer aux différences dans les manifestations cliniques. Chez Leishmania, le contrôle de l'expression génique s' effectue au niveau posttranscriptionnel et implique surtout des séquences cis régulatrices situées dans les séquences 3' non-traduites (3 'UTRs) des transcrits. Jusqu'à maintenant, quelques séquences régulatrices seulement ont été caractérisées et les mécanismes contrôlant l'expression génique entre les différents stades et différentes espèces de Leishmania sont peu connus. Ce projet visait à mieux comprendre les voies exploitées par Leishmania pour pallier au manque .de contrôle transcriptionnel et contrôler globalement l'expression génique afin de s'adapter à ses différents environnements. Nous avons identifié deux nouvelles grandes familles de courts rétroposons éteints nommées SIDER1 (Short Interspersed DEgenerated Retroposons; 785 copies) et SIDER2 (1 073 copies), situés presqu'exclusivement dans les régions 3'UTRs. Nous avons caractérisé la famille SIDER2 et démontré qu'elle réprime l'expression génique en déstabilisant spécifiquement les transcrits portant ces éléments. La dégradation rapide des transcrits instables contenant un élément SIDER2 est amorcée par un clivage endonucléolytique séquence-spécifique sans raccourcissement préalable de la séquence poly(A). Le clivage se produit dans une région riche en C d'environ 20 nt) au début de la seconde séquence signature de 79 nt, qui est hautement conservée parmi les SIDER2 et essentielle pour l'instabilité de l'ARNm. Nous suggérons -l'hypothèse que Leishmania exploite les SIDER2 pour réprimer de manière coordonnée l'expression des transcrits devant être faiblement exprimés. L'effet répressif de SIDER2 est bloqué chez les amastigotes de L. infantum, possiblement pour produire une quantité suffisante de certains ARNm ou protéines. Cette inactivation sélective des SIDER2 chez L. infantum contribue aux différences d'expression génique chez les différentes espèces et différents stades de Leishmania. À notre connaissance, ceci est le premier exemple chez les eucaryotes d'une famille entière d' éléments mobiles domestiqués pour participer au contrôle posttranscriptionnel de l'expression génique.

Note sur les annexes : 1 document de format excel regroupant les tableaux supplémentaires accompagnant le mémoire / The Flavobacterium genus contains diverse species, including a few colonizing the fish environment. Some of these are pathogens. The genetic diversity of flavobacteria is not well studied, even though there are some phylogenetic trees constructed with 16S rRNA sequences. Although these trees are very useful for first classification, it does not accurately capture the molecular evolution of flavobacteria. Thus, the evolution of flavobacteria colonizing the fish microbiota and the genetic characteristics favorizing this selection are yet to be determined. Likewise, the taxonomy of isolates is based upon 16S rRNA sequences,complemented by other methodologies. These analyses carry certain limitations, especially on precision.To address these issues, two research hypotheses were formed. A genetic specificity shouldexist among the flavobacteria colonizing the fish environment. Furthermore, a genomic approach can constitute a more precise taxonomic alternative. For the first hypothesis, aphylogenetic tree was constructed using whole-genome sequences of a majority of flavobacteria species. Then, the pangenome and the core genome were analyzed to find genetic markers to a clade of interest, CII. These markers are not gene uniquely present orabsent of said clade, but precisely on 13 amino acid changes on 10 common proteins, whichwere further discussed to find enrichments that could explain their selection throughout CII.For the second hypothesis, 16 isolates from collections and research laboratories were collected, all identified using diverse methodologies. A proposed taxonomy was tested basedon genotyping using gyrA and gyrB genes, and Average Nucleotide Identity. Although thistaxonomy represents a strong alternative, the results also show that six isolates were misclassified.This study shows that whole-genome phylogeny can help in detailing the evolution of certainkey species, in this case flavobacteria colonizing the fish microbiome. Furthermore, the newproposed taxonomy should be able to identify new isolates, notably in Québec aquacultures. / Le genre Flavobacterium comprend plusieurs espèces diversifiées. Certaines se retrouvent chez les poissons, dont quelques-unes sont pathogènes. La diversité génétique des flavobactéries est peu étudiée, malgré la présence de certains arbres phylogénétiques produits sur la base des séquences d'ARNr 16S. Bien que ces arbres soient suffisants pour une classification initiale, ils ne permettent pas de capturer l'évolution détaillée de ce genre. Ainsi, l'évolution des flavobactéries colonisant les poissons et les déterminants génétiques ayant favorisés cette sélection ne sont pas connus. Également, la taxonomie des isolats de flavobactéries se base généralement sur les séquences d'ARNr 16S, en complément avec d'autres méthodologies. Ces analyses portent certaines limitations, notamment au niveau de la précision. Ainsi, deux hypothèses ont été émises. Il existe une spécificité génétique aux flavobactéries colonisant les poissons. Également, une approche génomique constitue une taxonomie plus précise. Pour la première hypothèse, un arbre phylogénétique avec des génomes complets correspondant à une majorité des espèces du genre a été construit. Puis, le pangénome et le génome cœur ont été analysés pour trouver des caractères génétiques spécifiques à un clade d'intérêt, CII. Ces déterminants ne proviennent pas de gène uniquement présent ou absent à ce clade, mais précisément de 13 changements d'acides aminés communs sur 10 protéines, Pour la deuxième hypothèse, 16 isolats de collections et de laboratoires de recherche ont été récoltés, tous identifiés par des méthodes diverses. La taxonomie proposée, basée sur du génotypage avec les gènes gyrA et gyrB, et les Average Nucleotide Identity, a été testée. Cette approche taxonomique représente une alternative plus précise démontrant que certains isolats, au nombre de six, avaient une mauvaise classification initiale.L'étude montre que l'utilisation des génomes complets en phylogénie permet d'élucider l'évolution d'espèces clefs. De plus, le développement de la nouvelle taxonomie permet une identification améliorée d'isolats, notamment ceux en piscicultures québécoises.