Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont des E. coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) représentant le quatrième agent responsable de toxi-infections alimentaires en Europe. La contamination par ces pathogènes résulte principalement de l’ingestion de produits alimentaires contaminés par les fèces de bovins, dont le tube digestif apparait comme le principal réservoir naturel des EHEC. Ces pathogènes survivent dans le tractus digestif du ruminant, qui est porteur sain, et semblent bien adaptés à l’ensemble de cet écosystème complexe. Réduire le portage animal est une stratégie de choix afin de limiter les toxi-infections humaines à EHEC. L’objectif de cette thèse était d’approfondir les connaissances sur la physiologie et l’écologie des EHEC dans le tube digestif du bovin, une étape primordiale pour proposer, à terme, différentes stratégies visant à limiter le portage. L’analyse du transcriptome de la souche EHEC O157:H7 de référence EDL933 a permis l’identification de voies métaboliques utilisées par les EHEC dans différents compartiments du tube digestif de l’animal. Certains sucres, dont ceux issus de la couche de mucus intestinal, et acides aminés ainsi que l’éthanolamine semblent représenter des substrats importants pour la survie des EHEC tout au long du tube digestif du bovin. Cette étude transcriptomique a également mis en évidence l’activation, par la souche EHEC, de nombreux systèmes de résistance à différents stress rencontrés dans le tube digestif bovin, dont les systèmes toxines/anti-toxines. L’activation de ces systèmes et la capacité à former des biofilms ont également été observées chez une souche STEC O157:H7 d’origine bovine, la souche MC2, dans des conditions mimant une persistance dans l’environnement. La caractérisation génomique et phénotypique permet de considérer cette souche comme pathogène et des études réalisées in vitro et in vivo ont indiqué que la souche MC2 était capable de persister dans le tube digestif du bovin mais aussi dans l’environnement de l’élevage. L’inoculation expérimentale de bovins par la souche MC2 a permis de mettre au point le premier modèle animal reproductible de portage et d’excrétion des STEC O157:H7 décrit en France. Ce modèle pourra être utilisé pour tester in vivo l’effet d’additifs alimentaires, tels que les probiotiques, afin de réduire le portage et l’excrétion de souches EHEC par les bovins, et donc limiter la contamination de l’Homme. / Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are Shiga-toxin producing E. coli (STEC) which represent the fourth pathogen leading to foodborne illness in Europe. Contamination by these pathogens results mainly from the ingestion of food contaminated by feces of bovine, for which the digestive tract appears as the main natural reservoir of EHEC. These pathogens survive in the digestive tract of ruminants, which is healthy carriers, and seem well-adapted to this complex ecosystem. Reducing animal carriage is a strategy of choice to limit EHEC human infections. The aim of this thesis was to increase our knowledge on the physiology and ecology of EHEC in the digestive tract of bovine, a key step to propose, ultimately, different strategies to limit the carriage. Transcriptome analysis of the EHEC O157:H7 reference strain EDL933 allowed the identification of metabolic pathways used by EHEC in different compartments of the digestive tract of the animal. Some carbohydrates, including those from the intestinal mucus layer, and amino acids as well as ethanolamine appear to be important substrates for the survival of EHEC throughout the bovine digestive tract. This transcriptomic study also revealed the activation, by the EHEC strain, of several stress resistance systems encountered in the bovine digestive tract, including toxin/anti-toxin systems. The activation of these systems and the ability to form biofilms have also been observed in a bovine STEC O157:H7 strain, MC2 strain, under conditions mimicking persistence in the environment. Genomic and phenotypic characterization allows this strain to be considered as pathogenic and in vitro and in vivo studies indicated that the MC2 strain was able to persist in the bovine digestive tract but also in the farm environment. The experimental inoculation of bovines with the MC2 strain led to the development, for the first time in France, of a reproducible animal model of carriage and excretion of STEC O157:H7. This model could be used to test in vivo the effect of food additives, such as probiotics, in order to reduce the carriage and excretion of EHEC strains by bovines, and thus limit the contamination of humans.

Au cours de leur développement, les cellules du système hématopoïétique sont très exposées aux dommages à l’ADN qui peuvent avoir une origine exogène ou endogène. Les organismes vivants ont développé de nombreux mécanismes de réparation pour y faire face, et leur dysfonctionnement est responsable de maladies rares mais sévères chez l’Homme. Un des deux mécanismes de réparation des cassures double-brin (CDB) de l’ADN joue un rôle prépondérant dans le développement du système immunitaire (SI) des mammifères. Il s’agit de la voie de réparation des extrémités non-homologues (NHEJ) qui est absolument essentiel au bon déroulement de la recombinaison V(D)J dans les progéniteurs lymphocytaires de la moelle osseuse et du thymus. En effet, la formation de CDB de l’ADN est une étape clé de ce remaniement. De même, bien que dans une moindre mesure, le NHEJ intervient pour réparer les cassures induites par AID lors de la commutation de classe des immunoglobulines (Ig- CSR). Notre équipe a précédemment identifié un nouveau facteur du NHEJ, Cernunnos (ou XLF), responsable chez l’Homme de déficit immunitaire combiné sévère (DCIS) associé à une sensibilité aux rayonnements ionisants (RI) et à une microcéphalie. Afin de mieux comprendre le rôle de Cernunnos dans le système hématopoïétique et dans le développement des lymphocytes en particulier, nous avons créé un modèle murin invalidé pour ce gène. De façon surprenante, le développement lymphocytaire se fait quasi normalement dans ces souris, le seul défaut observé est une diminution du nombre de lymphocytes. Cependant, l’analyse fine du répertoire des cellules T a permis de mettre en évidence un biais dans l’utilisation des segments variables V et J de la chaîne α du récepteur (TCRα). Ce serait là la signature d’un défaut de survie des thymocytes, passant par une activation chronique de la voie de l’apoptose dépendante de p53 en réponse à l’accumulation de dommages de l’ADN. Certaines sous- populations de lymphocytes T, comme les iNKTs et les MAITs, seraient ainsi affectées. Par ailleurs, notre équipe poursuit la caractérisation génétique et fonctionnelle de pathologies chez des patients dont le tableau clinique laisse penser qu’il existe un déficit immunitaire ou hématologique primaire associé à un défaut de réparation de l’ADN. Nous nous sommes intéressés à un patient dont le tableau clinique combinant déficit hématopoïétique et instabilité génomique suggère une origine génétique forte. Grâce aux techniques de séquençage haut- débit et à l’étude de ségrégation au sein de la famille nous avons pu isoler plusieurs mutations dont une nous a interpellé plus particulièrement / Throughout their development, hematopoietic cells are exposed to many DNA damages of either exogenous or endogenous origin. Living organisms evolved a variety of DNA repair mechanisms in order to face those threats, and their impairment leads to rare but severe diseases in human. Of the two mechanisms involved in the repair of DNA double-strand break (DSB) repair, one plays a major role in mammal’s Immune System (IS). The non-homologous end joining (NHEJ) pathway is essential for the correct proceeding of V(D)J recombination in lymphocyte progenitors from bone marrow and thymus. Indeed, the formation of DNA DSB is a key step of the rearrangement. In similar fashion, though to a lesser degree, NHEJ is involved in repair of AID induced breaks during immunoglobulin class switch recombination (Ig-CSR). Our team previously identified a new NHEJ factor, Cernunnos (or XLF), as being responsible for a human syndrome of severe combined immunodeficiency (SCID) associated with ionizing radiation (IR) sensitivity (RS-SCID) and microcephaly. To better understand Cernunnos role in the hematopoietic system and particularly in lymphocyte development, we engineered a knock-out (KO) mouse model for this gene. Surprisingly, lymphocyte development is almost normal in these mice, the only defect observed being a decrease of lymphocyte number. However, a refined analysis of T cell repertoire allowed us to uncover a bias in the use of V and J segments from the receptor’s α chain (TCRα). This is the signature of a survival defect in thymocytes, caused by chronic activation of the p53 dependent apoptosis pathway in response to DNA damage. Some discrete T cell populations, such as iNKTs and MAITS, would be affected. In the meantime, our team pursues the uncovering of genetic diseases and their functional description in patients showing signs of immune or hematopoietic deficiency combined to impaired DNA repair. We focused on a patient harboring clinical signs of genomic instability and hematopoietic defects with strong evidence for genetic cause. Thanks to high-throughput DNA sequencing technology and whole genome association study (WGAS), we identified several mutations, one of them striking us as pertinent

En dépit de leur importance, la caractérisation des communautés bactériennes dans l’environnement reste encore très incomplète. Les principales raisons sont, d’une part, la difficulté d’appréhender la totalité de la communauté bactérienne quand plus de 99% des bactéries demeurent récalcitrantes à la culture in vitro et ne peuvent donc être étudiées par les approches classiques de microbiologie. D’autre part, la métagénomique, censée contourner cette méthode de culture en s’intéressant à l’ensemble des génomes extraits des milieux d’études, demeure elle aussi imparfaite du fait de limitations techniques (biais d’extraction de l'ADN, de clonage, de PCR, de séquençage et d’assemblage des génomes etc.) et conceptuelles, inhérentes à la complexité et l’hétérogénéité des environnements. Pour compenser les limites de chacune de ces techniques, des méthodes de tri cellulaire appliquées en conjonction avec les deux premières pourraient aider à un meilleur décryptage de la diversité microbienne. Basée sur la sélection spécifique (taxonomique et/ou fonctionnelle) et l’isolement direct des cellules bactériennes ciblées à partir d’un échantillon environnemental complexe, l’étude est restreinte à une population spécifique, voire à une cellule isolée. Pourront alors être appliquées les approches classiques de mise en culture ou d’extraction de l’ADN pour une étude restreinte à l’ADN ou l’ARN, leur répétition sur les différentes populations devant à terme (lointain) approcher l’exhaustivité. C’est dans ce contexte que s’est positionné ce travail de thèse visant dans un premier temps à mettre au point un nouvel outil de tri cellulaire basé sur l’intégration de micro-aimants permanents dans un canal microfluidique. A partir de ce système de tri magnétique miniaturisé, offrant de nombreux avantages (dispositif portable, peu coûteux, nécessitant de faibles volumes réactionnels et potentiellement intégrable en « laboratoire sur puce »), une technique d’isolement sélectif de cellules bactériennes marquées magnétiquement a alors été développée. Ciblées sur des critères taxonomiques après hybridation in situ avec des sondes d’acides nucléiques biotinylés complémentaires d’une région spécifique du gène 23S rRNA, des cellules bactériennes ont été marquées magnétiquement après réaction de la sonde avec des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de streptavidine. Les premiers résultats montrent l’établissement d’une méthode de tri suffisamment spécifique et sensible pour piéger les cellules marquées diluées (0,04%) au sein d’une suspension, à des niveaux compatibles avec l’isolement futur de populations d’intérêt à partir de communautés d’environnements complexes. Sur un principe comparable, l’approche a été adaptée à l’étude des transferts horizontaux de gènes in situ. Les applications d’un tri cellulaire grâce au marquage par des nanoparticules magnétiques et l’emploi de micro-aimants intégrés dans des microsystèmes fluidiques semblent donc très prometteuses pour le développement de la microbiologie environnementale. / Despite their importance, bacterial communities in the environment remain poorly characterized. On the one hand, it is difficult to gain knowledge of the community as a whole because over 99% of bacteria are recalcitrant to in vitro culture, rendering classic microbiological approaches imposible to carry out. On the other hand, metagenomics, which can be used to circumvent culture-based approaches by extracting all the genomes from a given environment, is also problematic given the associated technical limitations (biases related to DNA extraction, cloning, PCR, genome sequencing and assembling etc.), and conceptual difficulties related to the complexity and the homogeneity of the environments. In order to overcome some of the limitations of these approaches, bacterial cell selection methods have been developed and can be used to improve our understanding of microbial diversity. Based on taxonomic and/or functional selection and the direct isolation of bacterial cells from an environmental sample, bacterial cell selection can be used to reduce microbial community complexity by targeting specific populations, or even an isolated cell. A variety of classic approaches such as cultivation or DNA/RNA extraction can then be carried out. This cycle can theoretically be repeated until all members of the community are characterized. The aim of this doctoral thesis was to design a novel cell selection tool based on the permanent integration of micro-magnets into a microfluidic canal. In conjunction with a new miniaturized magnetic selection system that provides several advantages over larger systems (portable, low cost, requiring smaller reaction volumes and can be potentially integrated on “laboratory on a chip” systems), a method for selective bacterial cell isolation using magnetic labeling was developed. The bacterial cells were targeted based on taxonomic criteria; biotin-labeled probes were developed for a specific region of the 23S rRNA gene. Following in situ hybridization with the probes, baceterial cells were labeled with streptavidin-functionalized magnetic nanoparticles. First results showed that the tool was specific and sensitive enough to trap labeled and diluted (0,04%) cells from a suspension at levels that are comparible to populations of interest found in complex environmental communities. This tool has also been adapted to study in situ horizontal gene transfer as well. The application of a cellular selection tool that labels targets with magnetic nanoparticles coupled to fluidic microsystems with integrated nano-magnets looks very promising for future studiesin environmental microbiology.

Dans un contexte environnemental anthropisé, fragmenté et soumis à un changement climatique rapide, l’appréhension des processus d'adaptation locale des organismes marins par l'étude de zones de contact entre taxa proches constitue une approche privilégiée. Dans ces zones, des génotypes hybrides persistent malgré un état de maladaptation liée à des incompatibilités génétiques endogènes et/ou des barrières exogènes. L'histoire biogéographique complexe de la telline baltique Macoma balthica fait émerger quatre zones hybrides européennes, dont l'une, localisée autour de la Pointe Finistère (France), est le résultat d’un contact entre deux stocks génétiques ayant divergé en allopatrie. Ces divergences sont susceptibles de rompre la coadaptation entre génomes nucléaire et mitochondrial en raison de l'émergence d'incompatibilités mitonucléaires (MNIs). Ainsi, les sous-unités protéiques des cinq complexes de la chaine OXPHO sont codées à la fois par des gènes nucléaires et mitochondriaux, et une coévolution inter-génomique étroite est requise pour maintenir la production énergétique cellulaire. De précédentes données de transcriptomique dévoilent de probables MNIs chez M. balthica au niveau des complexes respiratoires I et V. Afin d’apporter des éléments de compréhension aux mécanismes de maintien des zones hybrides dans un contexte de pression anthropique, le présent travail se propose de tester l'hypothèse de putatives MNIs dans cette zone de contact. Pour cela, (i) six mitogénomes correspondant à cinq lignées haplotypiques divergentes en Europe ont été séquencés et l'architecture génomique a été étudiée conjointement à une cartographie des mutations des 13 gènes mitochondriaux, (ii) le niveau de transcription de 5 gènes nucléaires et 8 gènes mitochondriaux (complexe I à V) des individus hybrides a été comparé à celui des lignées parentales après détermination du statut d'hybridation de chaque individu (six populations françaises). A défaut d'apporter des éléments de réponses concrets quant à l'existence de MNIs chez M. balthica, et ses répercussions évolutives en terme de dépression d'hybridation, ce travail constitue un tremplin vers une étude approfondie de la zone hybride française en développant de nouveaux outils moléculaires, et de solides techniques expérimentales pour la conduite de futurs croisements artificiels. / In the anthropized, fragmented environmental context subject to rapid climate change, understand local adaptation processes of marine organisms by studying the contact zones between close taxa is a preferred approach. In these areas, hybrid genotypes persist despite a maladaptive state related to endogenous genetic incompatibilities and/or exogenous barrier. The complex biogeographic history of the Baltic tellin Macoma balthica leads to emergence of several European hybrid zones, one of which, located around the Pointe Finistère (France), is the result of the confluence of two genetic stocks that have diverged in allopatric. These divergences may have lead to the co-adaptation breakdown between nuclear and mitochondrial genomes due to the emergence of mito-nuclear incompatibilities (MNIs). Thus, the different protein subunits of the five OXPHO chain complexes are encoded by both nuclear and mitochondrial genes, and a tight inter-genomic coevolution is required to maintain the cellular energy production. Recent transcriptomic data unveil the existence of underlying MNIs in M. balthica, bearing by the respiratory complexes I and V. In order to provide some understanding clues of mechanisms in hybrid zone's maintenance in the context of human pressure, the present work aims to test the assumption of putative MNIs in this area. For this purpose, (i) six mitogenomes corresponding to five divergent haplotype lineages in Europe were sequenced and the genomic architecture has been studied jointly to a mapping mutation of the 13 mitochondrial genes, (ii) the level of transcription of 5 nuclear and 8 mitochondrial genes (complex I to V) of hybrid individuals was compared to the parental lineages after identification of the hybrid status of each individual (six french populations). For the lack of bringing concrete answers concerning the existence of MNIs in M. balthica, and its evolutionary effects in term of hybrid breakdown, this work is a springboard for a comprehensive study of the French hybrid zone by developing new molecular tools, and stable experimental technics for the realisation of future artificial crosses.

Evolutionary biology is not a specialty, like genetics or development - it is an explanation of what is investigated by all biological specialties. Thus, the goal of this dissertation was to study both micro- and macroevolutionary processes in a multi-disciplinary framework.<p>Population genetics, conservation, and phylogeny inference. The Jamaican boa (Epicrates subflavus) is an endemic species, whose natural populations greatly and constantly declined since the late 19th century, mainly due to predation by introduced species, human persecution, and habitat destruction. Using species-specific nuclear microsatellite loci and mitochondrial sequences, we investigated the population structure of this endangered reptile. All analyses pinpointed to an Eastern versus (Western+Central) pattern of differentiation in agreement with geological data and patterns of differentiation uncovered in other vertebrate and invertebrate Jamaican species. The same molecular markers were employed on 80 Jamaican boas of the European captive breeding program. This approach allowed us to (i) clarify all ambiguities in the studbook, (ii) correct parental allocation errors and (iii) assess the genetic diversity and the level of inbreeding of the current captive population. These results provide important insights for guiding the development of proper ex-situ and in-situ species survival and habitat management plans for this vulnerable snake. In the same framework of classical evolutionary genetics, we performed preliminary analyses of cytochrome b-like sequences in representatives of all cetacean families (but one), and revealed the presence of at least four nuclear mitochondrial pseudogenes that were independently inserted into the nuclear genome. <p>Evo-Devo. The emergence of Evolutionary Developmental biology has caused a partial shift in the criteria for the selection of model species. Thus far, the main criterion was the relevance of a species for understanding human biology, whereas in the frame of the new discipline, it is the understanding of the generative mechanisms underlying biological diversity that is put forward. We discussed a few criteria and limitations of major relevance to the choice of model species for Evo-Devo studies, and applied a pragmatic approach to identify possible model species within Amniotes. <p>Moreover, we developed MANTiS, an application pipeline that aims at integrating genomic, functional and expression data with evolutionary concepts, thus constituting the missing link between multi-species genome comparisons and functional analyses. Using MANTiS, we proceeded in the analysis of 35 metazoan full genomes for identifying all lineage-specific gene gains and losses. These results were combined with functional and expression analyses, and we demonstrated the much higher performance of MANTiS against popular databases of ortholog clusters (InParanoid, OrthoMCL, RoundUp).<p>Finally, preliminary results of our attempt to adapt the new revolutionary technology of DNA sequencing in microfabricated high-density picoliter reactors (developed by 454/Roche) to the ultra-fast sequencing of brain full transcriptomes in multiple reptilian species are highly promising. As an example, the Crocodylus sample generated more than 72 Mbases (per run), which were successfully assembled in approximately 31,000 contigs. One third of the latter could be matched to known sequences in the transcriptome of related species. After fine-tuning of the in silico analyses, and incorporation of genomic sequence data, we expect our approach to provide important insights not only in the evolution of central nervous system novelties in vertebrates, but in transcriptomes in general as the brain transcriptome is one of the most complex among all organs.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'objet de cette thèse de bioinformatique est de mieux comprendre l’ensemble des systèmes de régulation génique chez les bactéries. La disponibilité de centaines de génomes complets chez les bactéries ouvre la voie aux approches de génomique comparative et donc à l’étude de l’évolution des réseaux transcriptionnels bactériens. Dans un premier temps, nous avons implémenté et validé plusieurs méthodes de prédiction d’opérons sur base des génomes bactériens séquencés. Suite à cette étude, nous avons décidé d’utiliser un algorithme qui se base simplement sur un seuil sur la distance intergénique, à savoir la distance en paires de bases entre deux gènes adjacents. Notre évaluation sur base d’opérons annotés chez Escherichia coli et Bacillus subtilis nous permet de définir un seuil optimal de 55pb pour lequel nous obtenons respectivement 78 et 79% de précision. Deuxièmement, l’identification des motifs de régulation transcriptionnelle, tels les sites de liaison des facteurs de transcription, donne des indications de l’organisation de la régulation. Nous avons développé une méthode de recherche d’empreintes phylogénétiques qui consiste à découvrir des paires de mots espacés (dyades) statistiquement sur-représentées en amont de gènes orthologues bactériens. Notre méthode est particulièrement adaptée à la recherche de motifs chez les bactéries puisqu’elle profite d’une part des centaines de génomes bactériens séquencés et d’autre part les facteurs de transcription bactériens présentent des domaines Hélice-Tour-Hélice qui reconnaissent spécifiquement des dyades. Une évaluation systématique sur 368 gènes de E.coli a permis d’évaluer les performances de notre méthode et de tester l’influence de plus de 40 combinaisons de paramètres concernant le niveau taxonomique, l’inférence d’opérons, le filtrage des dyades spécifiques de E.coli, le choix des modèles de fond pour le calcul du score de significativité, et enfin un seuil sur ce score. L’analyse détaillée pour un cas d’étude, l’autorégulation du facteur de transcription LexA, a montré que notre approche permet d’étudier l’évolution des sites d’auto-régulation dans plusieurs branches taxonomiques des bactéries. Nous avons ensuite appliqué la détection d’empreintes phylogénétiques à chaque gène de E.coli, et utilisé les motifs détectés comme significatifs afin de prédire les gènes co-régulés. Au centre de cette dernière stratégie, est définie une matrice de scores de significativité pour chaque mot détecté par gène chez l’organisme de référence. Plusieurs métriques ont été définies pour la comparaison de paires de profils de scores de sorte que des paires de gènes ayant des motifs détectés significativement en commun peuvent être regroupées. Ainsi, l’ensemble des nos méthodes nous permet de reconstruire des réseaux de co-régulation uniquement à partir de séquences génomiques, et nous ouvre la voie à l’étude de l’organisation et de l’évolution de la régulation transcriptionnelle pour des génomes dont on ne connaît rien.<p><p>The purpose of my thesis is to study the evolution of regulation within bacterial genomes by using a cross-genomic comparative approach. Nowadays, numerous genomes have been sequenced facilitating in silico analysis in order to detect groups of functionally related genes and to predict the mechanism of their relative regulation. In this project, we combined prediction of operons and regulons in order to reconstruct the transcriptional regulatory network for a bacterial genome. We have implemented three methods in order to predict operons from a bacterial genome and evaluated them on hundreds of annotated operons of Escherichia coli and Bacillus subtilis. It turns out that a simple distance-based threshold method gives good results with about 80% of accuracy. The principle of this method is to classify pairs of adjacent genes as “within operon” or “transcription unit border”, respectively, by using a threshold on their intergenic distance: two adjacent genes are predicted to be within an operon if their intergenic distance is smaller than 55bp. In the second part of my thesis, I evaluated the performances of a phylogenetic footprinting approach based on the detection of over-represented spaced motifs. This method is particularly suitable for (but not restricted to) Bacteria, since such motifs are typically bound by factors containing a Helix-Turn-Helix domain. We evaluated footprint discovery in 368 E.coli K12 genes with annotated sites, under 40 different combinations of parameters (taxonomical level, background model, organism-specific filtering, operon inference, significance threshold). Motifs are assessed both at the level of correctness and significance. The footprint discovery method proposed here shows excellent results with E. coli and can readily be extended to predict cis-acting regulatory signals and propose testable hypotheses in bacterial genomes for which nothing is known about regulation. Moreover, the predictive power of the strategy, and its capability to track the evolutionary divergence of cis-regulatory motifs was illustrated with the example of LexA auto-regulation, for which our predictions are remarkably consistent with the binding sites characterized in different taxonomical groups. A next challenge was to identify groups of co-regulated genes (regulons), by regrouping genes with similar motifs, in order to address the challenging domain of the evolution of transcriptional regulatory networks. We tested different metrics to detect putative pairs of co-regulated genes. The comparison between predicted and annotated co-regulation networks shows a high positive predictive value, since a good fraction of the predicted associations correspond to annotated co-regulations, and a low sensitivity, which may be due to the consequence of highly connected transcription factors (global regulator). A regulon-per-regulon analysis indeed shows that the sensitivity is very weak for these transcription factors, but can be quite good for specific transcription factors. The originality of this global strategy is to be able to infer a potential network from the sole analysis of genome sequences, and without any prior knowledge about the regulation in the considered organism. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cupriavidus metallidurans CH34 est une béta-protéobactérie, résistante aux métaux lourds, isolée des sédiments d'une usine de métallurgie non-ferreuse en Belgique. <p>Le génome de cette bactérie contient un chromosome (3.6 Mb), un mégaplasmide (2.6 Mb) et deux plasmides pMOL28 (171 kb) et pMOL30 (234 kb) déjà connus pour porter des gènes de résistance aux métaux lourds. <p>Nous avons d'abord fait le catalogue des gènes impliqués dans la résistance aux métaux lourds et, ensuite, cherché à mesurer leur expression par deux approches transcriptomiques :RT-PCR et puces à ADN.<p> L'analyse du génome montre au moins 170 gènes relatifs à la résistance aux ions métalliques localisés sur les 4 réplicons, principalement sur les deux plasmides. Ces gènes codent essentiellement pour des systèmes d'efflux tel que les HME-RND (transport chimioosmotique avec flux de protons à contresens), les ATPases de type P ou encore pour le système de résistance aux ions Cu(II). Dans le génome de C. metallidurans, nous avons identifié 13 opérons qui codent pour des systèmes HME-RND, seuls trois, localisés sur les plasmides, sont surexprimés en présence de métaux lourds. Huit gènes codent pour des ATPases de type P, dont deux appartiennent à une classe dont les substrats ne sont pas métalliques. Deux ATPases appartiennent à une famille spécialisée pour l'efflux du Cu(II) et les quatre autres à une autre grande famille impliquée dans l'efflux des ions Cd(II), Pb(II) et Zn(II). Les analyses transcriptomiques montrent la surexpression des deux premières classes d'ATPases P en présence des métaux lourds. La mutagenèse du gène zntA (mégaplasmide), codant pour l'une des ATPases, provoque une diminution de la viabilité en présence de Zn(II), Cd(II) et dans une moindre mesure de Pb(II), Tl(I) et Bi(III). <p>Sur pMOL30, la résistance au cuivre implique un groupe de 19 gènes cop codant pour la résistance au cuivre au niveau du périplasme et du cytoplasme, et vraisemblablement pour une forme de stockage du cuivre essentiel. Ces 19 gènes sont surexprimés en présence de cuivre, mais une quinzaine de gènes proches semblent aussi requis pour une expression optimale de la résistance au cuivre. <p>L'annotation des plasmides a mis en évidence la parenté du plasmide pMOL28 avec le plasmide pHG1 (hydrogénotrophie, fixation du CO2) de C. eutrophus H16 et le plasmide pSym (fixation de l'azote) de C. taiwanensis, et chez pMOL30, la présence de deux îlots génomiques concentrant la plupart des résistances aux métaux lourds. Les puces montrent la surexpression de 83 sur 164 gènes dans pMOL28, et de 143 sur 250 gènes dans pMOL30. Elles montrent aussi que les gènes présents sur les deux plasmides sont davantage surexprimés que ceux localisés sur les deux mégaréplicons. Parmi les gènes surexprimés les plus intéressants du plasmide pMOL30, il faut mentionner des transposases tronquées et des gènes impliqués dans la synthèse des membranes (glycosyltransférases). L'analyse de l'expression des gènes plasmidiens de résistance aux métaux lourds montre la surexpression en présence de plusieurs ions métalliques ajoutés indépendamment et pas seulement par les substrats métalliques de ces opérons, ce qui suggère l'intervention de deux types de régulation dont les gènes correspondants sont aussi localisés sur le chromosome et le mégaplasmide.<p>Ce travail met en évidence la spécialisation de la bactérie dans la réponse à un grand spectre de concentrations de métaux lourds, jusqu'à la limite majeure de la toxicité observée pour les bactéries mésophiles hétérotrophes. Cette spécialisation correspond bien aux biotopes industriels de divers continents dans lesquels on l'a trouvée. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le maintien de l'intégrité du génome est essentiel pour la survie cellulaire et la propagation de l'information génétique. Une mauvaise prise en charge des dommages de l’ADN et / ou une aberration de la maintenance de l’intégrité des télomères - les extrémités des chromosomes linéaires - provoquent chez l'homme des pathologies associées à une instabilité génétique. Ainsi, des dysfonctions télomériques sont à l’origine de la Dyskératose Congénitale (DC), et de sa forme rare et sévère, le Syndrome de Hoyeraal-Hreidarsson (HHS). Les DC et HHS se caractérisent principalement par une insuffisance médullaire progressive, des défauts développementaux et une prédisposition à développer des cancers. Par ailleurs, de nombreux syndromes associant déficits immunitaires et anomalies développementales sont causés par des défauts de réparation de l'ADN (cas de déficits immunitaires sévères, de l’Anémie de Fanconi (FA), de l’ataxie télangiectasie (AT), etc …). Au cours de ce travail, nous avons réalisé une étude phénotypique et génétique de patients atteints de deux pathologies aux caractéristiques cliniques distinctes. Ce travail de thèse a permis : 1) d'une part d'identifier des mutations de RTEL1 chez 3 patients atteints de HHS, décrivant ainsi une nouvelle cause moléculaire de cette pathologie. L'analyse des cellules de ces patients a révélé le rôle crucial que joue RTEL1 sur la stabilité du génome et le maintien des télomères dans des cellules humaines. 2) d'autre part, d'identifier un défaut en MYSM1, une histone déubiquitinase, dans un nouveau syndrome immuno-hématologique associé à des défauts de réparation de l’ADN présentant certaines similitudes avec l'anémie de Fanconi. Cette étude démontre pour la première fois, qu'outre son rôle dans la régulation transcriptionnelle, MYSM1 participe également aux mécanismes de réparation des lésions de l'ADN. / Maintaining genome integrity is essential for cell survival and propagation of the genetic information. Improper management of DNA damages and / or aberrations in maintenance of telomere - the ends of linear chromosomes - causes humans disorders associated with genetic instability. Thus, in humans, telomere dysfunction causes Dyskeratosis Congenita (DC), and its rare and severe form, Hoyeraal-Hreidarsson Syndrome (HHS). DC and HHS are mainly characterized by progressive bone marrow failure, developmental defects and predisposition to cancer. In addition, many syndromes involving immunodeficiency and developmental abnormalities are caused by defects in DNA repair (e.g. severe immune deficiencies, Fanconi Anemia (FA), Ataxia Telangiectasia (AT),…). In this work, we performed a phenotypic and genetic study of patients with two syndromes presenting distinct clinical features. This work permitted : 1) on one hand, to identify RTEL1 mutations in patients with HHS and describe a new molecular cause of this disease. The analysis of patients’ cells revealed the crucial role for RTEL1 in genome stability and telomere maintenance in human cells. 2) on the other hand, to identify mutations in MYSM1, a histone deubiquitinase, in a new immuno-hematological syndrome associated with defects in DNA repair and sharing some similarities with Fanconi anemia. This study demonstrates for the first time that, in addition to its role in transcriptional regulation, MYSM1 is required to cope with DNA damages.

Nous avons identifié une nouvelle forme de phospho-S27-S33-Ku70 constitutivement surexprimée dans des cellules issues de la leucémie lymphocytaire chronique résistante à la chimiothérapie basée sur des agents alkylants de l’ADN et/ou analogues nucléotidiques. La protéine Ku70 est une protéine essentielle du maintien de la stabilité génomique par son rôle dans la réparation non-homologue (système NHEJ) des cassures double brin de l’ADN (CDB) et par sa fonction télomérique. Le laboratoire d’accueil a déjà démontré, in vitro et in vivo, dans les cellules LLC résistantes une altération de la réparation par le système NHEJ et un dysfonctionnement télomérique. Le travail de thèse a porté sur la caractérisation fonctionnelle de cette nouvelle forme phospho-S27-S33-Ku70. Pour ceci, nous avons utilisé des vecteurs d’expression permettant simultanément d’inhiber l’expression du Ku70 endogène (shRNA) et d’exprimer de façon épisomale différentes formes de Ku70 exogène. Ainsi, nous avons démontré : i) une stricte colocalisation de pS27-pS33-Ku70 avec les foyers γ-H2AX; ii) des cassures double brin (DSB) induisent la phosphorylation de S27-S33-Ku70 sous forme hétérodimère avec Ku80. Cette phosphorylation a lieu quelques minutes après le stress génotoxique et implique l'activité et l'interaction physique avec pS2056-DNA-PKcs, reliant ainsi pS27-pS33-Ku70 au système NHEJ ; iii) les cellules exprimant la forme sauvage exogène S27-S33-Ku70 ou la forme phosphomimétique E27-E33-Ku70 présentent une cinétique de réparation de l’ADN plus rapide que celle des cellules exprimant la forme mutée A27-A33-Ku70. Cependant, iv) la forme sauvage de Ku70 contribue à un niveau plus élevé d'aberrations structurales chromosomiques après la première division cellulaire suite à un stress génotoxique indiquant une infidélité lors de la réparation des dommages de l’ADN. En outre, les cellules exprimant A27-A33-Ku70 possèdent un index cellulaire plus élevé qui est corrélé avec une activation de la voie β-caténine. En adéquation avec sa surexpression dans la forme résistante de la LLC, l’ensemble de ces résultats suggère un rôle oncogénique de la forme phosphorylée de Ku70. Nous avons ensuite testé l’effet des nanodiamants hydrogénés (ND-H) dans des lignées exprimant différentes formes de Ku70. Grâce à leurs propriétés physico-chimiques les ND-H sont capables de potentialiser sous irradiation la production intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et ainsi augmenter le taux des cassures (simple et double brin de l’ADN) et solliciter d’avantage le système de réparation de l’ADN. Nous observons que indépendamment de la forme exprimée de Ku70, ce double traitement induisait la sénescence cellulaire ; une découverte d’un intérêt à la fois fondamental (compréhension des voies apoptotiques vs senescence) et d’utilité pharmacologique potentielle. / We have identified a new form of phospho-S27-S33-Ku70 constitutively overexpressed in a subset of chronic lymphocytic leukemia (CLL) B cells resistant to apoptosis induced by DNA double strand breaks (DSB). Ku70 is one of the essential proteins involved in the maintenance of genomic stability through its role in DNA double strand break repair (non-homologous end-joining, NHEJ) and in telomeric protection.Laboratory previously established that resistant CLL cells disclose an upregulated NHEJ DNA repair and an impaired structure of telomeres. The goal of this thesis was to characterize the biological function(s) of this new form of Ku70. For this purpose we have constructed specific EBV-based vectors (siRNA / cDNA) enabling a simultaneous inhibition of endogenous Ku70 and an expression of different forms (mutated, wild, phosphomimetic at ser27-33) of Ku70 resistant to siRNA. Thus, we showed: i) a strict colocalisation of phospho-Ku70 with γ-H2AX foci; ii) that DSB induces the phosphorylation of Ku70 within minutes after genotoxic stress in heterodimer complex Ku70/Ku80. This phosphorylation necessitates both the physical interaction and the activity of pS2056-DNA-PKcs and/or ATM, linking phospho-Ku70 to NHEJ-mediated DNA DSB repair; iii) cells expressing mutated A27-A33-Ku70 exhibit a delayed G2/M cell cycle arrest, slower kinetic of DNA repair, lower level of genotoxic stress-induced chromosomal aberrations, and a higher cellular impedance correlated with translocation of transcriptional factor β-catenin from cytoplasmic membrane to the nucleus. Together, these data unveil an involvement of phospho-Ku70 in fast and inaccurate DNA repair; new paradigm for NHEJ regulation and to the control of resistance and maintenance of malignant cells.In parallel, we have initiated experimental approaches to explore other potential roles of phospho-Ku70. Especially, we were interested to determine whether it could play a role in an initiation of cell senescence induced by combined cells’ treatment by hydrogenated nanodiamonds (H-NDs) particles and ionizing irradiation. H-NDs exhibit positive surface charge in aqueous solutions allowing, when irradiated by photons, electrons’ emission and the release of reactive oxygen species (ROS) causing DNA damage. Effectively, we have established an intracellular increase of ROS that drive cell cycle arrest in G1/S in addition to the G2 arrest activated by irradiation alone. Finally, cells underwent the senescence process characterized byγ-galactosidaze activity, persistent large γ-H2AX foci and senescence-associated heterochromatinisation. Noteworthy, the senescence induced in this way occurred independently of Ku70 (ser27-ser33) status and irrespectively of cell resistance to genotoxic agents administrated alone; a finding of potential use in clinical trials.

Avec les changements climatiques et les perturbations humaines, de nombreuses espèces changent leurs aires de répartition. Dans ce contexte, l’identification de loci potentiellement adaptatifs chez ces populations en expansion est importante pour mieux comprendre le potentiel évolutif et la capacité d’envahissement de ces espèces. Toutefois, chez les espèces en expansion de territoire, tel le dendroctone du pin, les processus démographiques comme le surf d’allèles peuvent résulter en des patrons spatiaux de variation génétique neutre qui imitent ceux issus des processus adaptatifs. Ce phénomène gonfle le taux de faux-positif d’identification des loci adaptatifs et confond ainsi les méthodes de génomique du paysage. Dans le cadre de ce projet de maîtrise, j’ai étudié le développement des structures génétiques neutres et adaptatives lors d’une expansion de territoire. Je me suis attardé particulièrement sur l’influence de différentes conditions démographiques sur le taux de loci neutres qui imitent les patrons spatiaux de ceux adaptatifs, en menant une revue de littérature et en utilisant le système épidémique du dendroctone du pin pour paramétrer un modèle de simulations. J’ai simulé les dynamiques démographiques et génétiques des populations de dendroctones à l’aide du modèle de simulation génétique explicitement spatial CDmetaPOP. J’ai analysé les conséquences de trois facteurs sur le taux de faux-positif : 1) la capacité de dispersion; 2) le moment d’échantillonnage durant l’expansion de territoire; et 3) la force de sélection agissant sur le locus adaptatif de référence. J’ai démontré qu’une combinaison de faible capacité de dispersion, faible sélection et un échantillonnage tôt au début de l’expansion contribuent à un plus grand taux de faux-positif, alors qu’une forte capacité de dispersion conduit à de plus faibles taux de faux-positif. Lorsque les méthodes de génomique du paysage sont utilisées dans ces conditions, elles risquent d’avoir un haut taux de loci neutres identifiés comme adaptatifs et doivent donc être interprétées avec prudence. La situation démographique complexe que présente le système actuel du dendroctone (et d’autres espèces irruptives et envahissantes) rend l’identification d’allèles adaptatifs plus difficile. Les résultats de ce projet encouragent l’incorporation de ces processus démographiques dans les méthodes de génomique du paysage. / Under the actual climate changes and human perturbations global context, many species are altering their geographic range. The identification of putatively adaptive loci in those expanding populations is thus important to better understand evolutionary potential and invasiveness of these species. However, in irruptive species undergoing rapid expansion, such as the mountain pine beetle (MPB), demographic processes such as allele surfing can result in spatial patterns of neutral genetic variation that can mimic those that result from adaptive processes. This phenomenon inflates the false discovery rate of adaptive loci and thus confounds landscape genomics methods. In this thesis, I studied the development of neutral and adaptive genetic structure during a range expansion. I investigated precisely how different demographic conditions influence the rate of neutral loci mimicking the spatial patterns of adaptive loci, doing a literature review and using the mountain pine beetle outbreak system to parametrize a simulation model. I simulated the demographic and population genetic dynamics of mountain pine beetle populations undergoing range expansion using the spatially explicit, individual-based genetic model CDmetaPOP. I examined the consequences of three factors on the false discovery rate: 1) species dispersal capacity; 2) timing of sampling during the course of the expansion; and 3) the strength of selection on adaptive reference loci. I found that a combination of weak dispersal capacity, weak selection, and early sampling during expansion results in the highest rate of false positive, while strong dispersal was responsible for lower rates of false positive. Used under these conditions of dispersal capacity, strength of selection and sampling timing, landscape genomics models risk elevated false discovery rates of adaptive loci and must be interpreted cautiously. Complex demography in the current MPB system (and other irruptive and invasive species) makes identification of adaptive loci challenging. Results from this project clearly demonstrate that there is a need for further method development to include these directional demographic processes in the field of landscape genomics.