Memoria para optar el título de Bioquímico / Cupriavidus necator JMP134 (pJP4), antes denominada Ralstonia eutropha JMP134 (pJP4), es una bacteria ambiental capaz de utilizar los compuestos contaminantes 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) y 3-clorobenzoato (3-CB) como única fuente de carbono y energía. Las vías metabólicas que permiten dichas capacidades se encuentran codificadas en los genes cromosomales benABC y benD, y en la vía de degradación de clorocatecoles, codificados por los genes tfd del plasmidio pJP4. Se ha descrito que el regulador TfdR/S (familia LysR) activa la expresión de los genes tfd. El regulador de la vía de degradación de catecol, CatR, tiene en común aspectos genéticos, funcionales y evolutivos con el regulador TfdR/S. Estos antecedentes hacen posible proponer que CatR podría estar influyendo en la expresión de los genes tfd. En esta memoria se estudió el papel de CatR en la degradación de 3-CB y 2,4-D. Para esto se identificaron los putativos genes catR en el genoma de C. necator, encontrándose dos, catR1 y catR2, cuyo contexto genómico sugiere que podrían participar diferencialmente en el metabolismo de cloroaromáticos. Estos genes fueron clonados e introducidos en C. necator. Adicionalmente, se obtuvo una cepa de C. necator mutante del gen catR1 mediante una estrategia de doble recombinación homóloga. Esta mutante fue complementada con los genes catR1 o catR2. Estas cepas fueron estudiadas mediante curvas de crecimiento en medios de cultivos con distintas concentraciones de 3-CB, 2,4-D o benzoato (BZ). En cada caso se determinó la densidad óptica en fase estacionaria y la velocidad de crecimiento. Además, se evaluó la degradación de 3-CB y BZ mediante la detección del compuesto por HPLC. Estos estudios permitieron determinar que tanto CatR1 como CatR2 aumentan la degradación de 3-CB, puesto que la sobreexpresión de sus genes aumentó la velocidad de crecimiento (μ) en ±2 veces. Consistente con lo anterior, la ausencia de CatR1 disminuyó la velocidad de crecimiento en ±3 veces en 3-CB y la tasa de degradación de este sustrato disminuyó ±3 veces, lo cual también fue observado durante el crecimiento en BZ. Adicionalmente, los estudios de complementación realizados para corregir la ausencia de CatR1, con los genes catR1 y catR2 por separado, mostraron recuperar el fenotipo silvestre en ambos sustratos. Por otra parte, la degradación de 2,4-D fue mejorada por CatR2, puesto que la sobreexpresión del gen catR2 impidió la disminución en el rendimiento celular que se observa en la cepa silvestre al aumentar la concentración de 2,4-D. En cambio, la velocidad de crecimiento en 2,4-D a altas concentraciones de sustrato se vio desfavorecida por la sobreexpresión del gen catR1. Los resultados de este trabajo indican que los reguladores CatR1 y CatR2 modifican el crecimiento en estos compuestos, probablemente a través de la modulación de la expresión de los genes ben y tfd. Lo anterior se basa en que ambos reguladores poseen cercanía estructural con el regulador TfdR y compartirían la capacidad de interactuar con las respectivas regiones promotoras. En este contexto, se propone un modelo de la regulación ejercida por CatR1 y CatR2 en C. necator. Este modelo sugiere que estos reguladores modulan diferencialmente los genes tfd, de modo que CatR2 activa los módulos génicos tfd I-II y el gen tfdA, mientras que CatR1 activa sólo el módulo tfd I. En base a modelamiento molecular, se predijo que las diferencias observadas entre el regulador CatR1 y CatR2 podrían ser explicadas por la afinidad de unión a DNA y no por la unión del inductor / Cupriavidus necator JMP134 (pJP4) (Ralstonia eutropha) is a soil bacterium that is able to use the pollutants 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and 3-chlorobenzoate (3-CB), as sole carbon and energy source. The metabolic pathways are encoded in the chromosome by the benABC and benD genes and in the pJP4 plasmid, by the chlorocatechol degrading, ortho ring cleavage pathway tfd genes. It has been reported that the TfdR/S regulator (LysR family) activates the expression of the tfd genes. The regulator of the catechol degradative pathway, CatR, shares genetic, functional and evolutionary aspects with the TfdR/S regulator, making possible that CatR may influence the expression of tfd genes. In this work, the role of CatR in 3-CB or 2,4-D degradation was studied. Two putative genes encoding CatR regulators were identified in the genome of C. necator, catR1 and catR2, genetic contexts at which suggest that they may be differentially involved in chloroaromatic metabolism. These genes were cloned and overexpressed in C. necator. In addition, a catR1 gene mutant was obtained by a double recombination strategy. This mutant was complemented with either the catR1 or catR2 genes. These strains were studied by growth curves in cultures grown at different concentrations of 3-CB, 2,4-D or benzoate (BZ). In each case, the optical density at the stationary phase and the growth rate were determined. In addition, the degradation of 3-CB or BZ was monitored by HPLC. These studies showed that both regulators increase degradation of 3-CB, since overexpression of catR1 or catR2 genes provoked a two-fold increase in growth rate. Accordingly, a three-fold decrease in growth rate and 3-CB degradation rate was determined in the absence of catR1. The same was observed during growth in BZ. In addition, complementation with catR1 or catR2 genes recovered wild type growth phenotype with both substrates. On the other hand, the degradation of 2,4-D was improved for CatR2, because the overexpression of catR2 gene avoided the decrease in cell yield at higher concentrations of 2,4-D. In contrast, the degradation of 2,4-D at higher concentrations of this substrate was impaired by overexpression of catR1. The results of this work show that regulators CatR1 and CatR2 modify growth on 2,4-D or 3-CB, probably through modulation of the expression of the ben and tfd genes. The latter assumption is based on that both regulatory proteins are structurally related to TfdR and that both could interact with the respective promoter regions. In this context, a model for the regulation by CatR1 and CatR2 in C. necator is proposed. This model suggests that both regulatory proteins differentially modulates tfd genes, with CatR2 activating both tfd modules and tfdA gene, whereas CatR1 only activates module tfd- I. Based on molecular modelling, it was predicted that differences between CatR1 and CatR2 would be explained by DNA binding affinity and not by inducer binding

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-16T03:05:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337515.pdf: 2935273 bytes, checksum: c4a8eb296f355f5ea5994df6dd124dd7 (MD5) Previous issue date: 2015 / Os Polihidroxialcanoatos (PHAs), com destaque para o Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) e o Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)), são poliésteres biodegradáveis, produzidos intracelularmente por muitos microrganismos. A bactéria Cupriavidus necator destaca-se por ser capaz de acumular mais de 80 % de sua massa seca em polímero e assimilar diferentes fontes de carbono. O custo de produção desses polímeros ainda é elevado e a utilização de substratos de baixo custo, como resíduos agroindustriais, aparece como alternativa para diminuição dos custos. Resíduos agroindustriais, entretanto, apresentam baixa ou moderada concentração de carbono, exigindo estratégias de cultivo como a batelada sequencial com reciclo externo de células para garantir a obtenção de processos com alta produtividade. Modelos estruturados, que levam em conta as reações metabólicas envolvidas no processo, têm tido utilização destacada em processos biotecnológicos como uma ferramenta na predição de condições de cultivo que maximizem a produção do produto. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de P(3HB) e P(3HB-co-3HV), por C. necator, utilizando substrato com baixa concentração de glicose e adição de ácido propiônico, em cultivos realizados em batelada sequencial com reciclo externo de células, conduzidos sob exaustão ou limitação de nitrogênio ao longo da fase de produção. Além disso, pretendeu-se desenvolver e validar um modelo fenomenológico estruturado, baseado na Análise de Fluxos Metabólicos (AFM), para auxiliar na compreensão do comportamento metabólico de C. necator e obter condições de processo que maximizem a produção de P(3HB), a partir de glicose, no sistema com reciclo externo de células. Os resultados mostraram que a alimentação de nitrogênio em concentração limitante durante a fase de produção, no sistema batelada sequencial com reciclo externo de células, aumentou a produtividade do processo, frente aos resultados obtidos a partir da exaustão de nitrogênio durante a fase de produção neste mesmo sistema. Na produção de P(3HB-co-3HV), verificou-se que a relação entre as unidades 3HV/3HB aumentou ao longo de toda a fase de produção. O modelo fenomenológico foi construído a partir de 17 metabólitos chave e 15 reações estequiométricas. Equações que descrevem a inibição pela concentração inicial de glicose e nitrogênio foram também consideradas no modelo. O modelo foi validado para diferentes estratégias de cultivo: batelada, batelada alimentada, batelada sequencial com e sem reciclo de células e alimentação de nitrogênio na fase de produção. Um cultivo em modo batelada sequencial com reciclo externo de células, alimentação de nitrogênio na fase de produção e concentrações iniciais de substrato não inibitórias foi realizado. A produtividade volumétrica (1,35 g.L-1.h-1) foi 35 % superior à obtida por Ienczak et al. (2015) que utilizaram sistema em batelada sequencial com reciclo de células. Estes resultados mostraram que a estratégia proposta no presente trabalho é eficiente na obtenção de alta densidade celular (86,3 gXt.L-1) e produtividade de processo, e que o modelo fenomenológico estruturado desenvolvido pode ser muito útil na predição de condições de maximização da produção de P(3HB) por C. necator, a partir de glicose.<br> / Abstract : Polyhydroxyalkanoates (PHAs), highlighting the Poly(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)) and the Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (P(3HB-co-3HV)), are biodegradable polyesters produced intracellularly by many microorganisms. The bacterium Cupriavidus necator stands out due its ability to accumulate more than 80 % of its dry mass in polymer and, assimilate different carbon sources. These biopolymers present high production cost and the utilization of low cost substrates, as agroindustrial wastes, is an alternative to reduce this cost. However, the agroindustrial wastes present moderate or low carbon concentration, requiring culture strategies as the repeated batch with external cell recycle to ensure the achievement of high process productivity. Structured models, which take into account the metabolic reactions involved in the process, have been largely applied in biotechnological process as a tool in predicting culture conditions that can maximize the product production. The aim of the present work was to evaluate the P(3HB) and P(3HB-co-3HV) production, by C. necator, using substrate with low glucose concentration and propionic acid addition, in repeated batch cultures with external cell recycle, conducted in exhaustion or limitation of nitrogen during the production phase. Also, it was intended to develop and to validate a structured phenomenological model, based in the Metabolic Flux Analysis (MFA), to help in the comprehension of the metabolic behavior of C. necator and in obtaining process conditions that maximize the P(3HB) production, from glucose, in the system with external cell recycle. The results showed that the limited nitrogen feeding during the production phase, in the repeated batch system with external cell recycle, increased the process productivity, compared to the results obtained from the nitrogen exhaustion during the production phase in the same system. In the P(3HB-co-3HV) production, it was verified that the relation between the 3HV/3HB units increased during all the production phase. The phenomenological model was built considering 17 key metabolites and 15 stoichiometric reactions. Equations that can describe the growth inhibition by the initial concentration of glucose and nitrogen were also considered in the model. The model was validated to different culture strategies: batch, fed batch, repeated fed batch with or without cell recycle and nitrogen feeding during the production phase. One repeated batch culture with external cell recycle, nitrogen feeding during the production phase, and not inhibitory initial glucose and nitrogen concentrations, was performed. The volumetric productivity (1.35 g.L-1.h-1) obtained was 35 % higher than the results reported by Ienczak et al. (2015), which applied a repeated batch system with external cell recycle. These results showed that the strategy proposed in the present work is efficient in obtaining high cell density (86.3 gXt.L-1) and process productivity, and, the phenomenological model developed can be useful in predicting conditions that maximize the P(3HB) production by C. necator, from glucose.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T18:04:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Gabriel Olivo Locatelli_PPGBI, 2012.pdf: 3209364 bytes, checksum: e1f9118cb8343a86b784ba5a4b4188f1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T18:04:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Gabriel Olivo Locatelli_PPGBI, 2012.pdf: 3209364 bytes, checksum: e1f9118cb8343a86b784ba5a4b4188f1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / FACEPE / As pectinas são hidrocolóides naturais, encontrados na parede celular primária das células vegetais e nas camadas intercelulares, contribuindo para adesão entre as células, firmeza e resistência mecânica dos tecidos. Estão presentes em grande quantidade nos subprodutos das indústrias de extração de sucos cítricos, e muitas vezes são descartados de forma inadequada, representando um grande passivo ambiental. Objetivando o aproveitamento desses resíduos como uma alternativa de baixo custo para a produção de polihidroxialcanoatos (PHAs), foi estudado o uso de ácido galacturônico e hidrolisados pécticos para crescimento celular de Cupriavidus necator e Pseudomonas putida. Foram estudados métodos de hidrólise ácida e enzimática, através da aplicação de planejamento fatorial e metodologia de superfície de resposta. Os resultados indicaram que o método de hidrólise enzimática foi mais eficiente permitindo obter um maior rendimento de compostos redutores (CR). As variáveis investigadas foram à concentração da enzima endo-poligalacturonase (endo-PG) e a agitação, mantendo-se a concentração de substrato em 1% (p/v). Os resultados obtidos foram comparados com a performance enzimática realizada com uma maior concentração de substrato (10% p/v) empregando-se diferentes concentrações de enzima. Ambos os resultados indicaram que a concentração enzimática de 10 UI/g de pectina favoreceu a obtenção de CR, permitindo atingir em média 70 g/L de CR a partir de 100 g/L de pectina. Ambos os micro-organismos cresceram na presença de ácido galacturônico, mas apenas C. necator apresentou crescimento satisfatório nos meios formulados com os hidrolisados pécticos, com velocidades específicas de crescimento (μMax) e taxas de conversão de substrato em células (Yx/s) semelhantes aos valores encontrados em estudos com outros substratos, como glicose, açúcar invertido e melaço. Essas condições de cultivo permitiram um crescimento celular acima de 10 g/L e o acúmulo intracelular de polihidroxialcanoatos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:17:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341136.pdf: 2868083 bytes, checksum: 1aa7910ecf1ffe60d5d462e0d7a16b75 (MD5) Previous issue date: 2016 / Os poli(hidroxialcanoatos) (PHAs) são compostos biodegradáveis, produzidos por microrganismos como reserva de energia, que despertam interesse industrial por serem termoplásticos biodegradáveis. O desenvolvimento de processos de produção desses biopolímeros de forma eficiente, tem sido foco de diversas linhas de pesquisa. Ralstonia eutropha é um dos microrganismos mais estudados para a produção de Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)), que é o PHA mais comumente estudado. A utilização de substratos de baixo custo, como os resíduos, pode ser uma alternativa na redução dos custos de produção desses materiais. A vinhaça é o principal subproduto da indústria sucroenergética, sendo produzida em grandes volumes. A valorização da vinhaça, pelo desenvolvimento de um processo para obtenção de um produto com valor agregado, como o P(3HB), contribui com valor adicional à produção de etanol. O glicerol é uma das principais fontes de carbono presentes na vinhaça. O objetivo deste trabalho foi utilizar a vinhaça como substrato para o crescimento e a produção de P(3HB) pela bactéria R. eutropha DSM 545. Diferentes diluições de vinhaça foram estudadas e em nenhuma delas a bactéria sofreu inibição em seu crescimento, mesmo quando a vinhaça (sem diluição) foi apenas adicionada de sais. Visto que a bactéria alcançou a fase estacionária de crescimento quando havia substratos disponíveis no meio, como o glicerol, foi proposto realizar o melhoramento de R. eutropha DSM 545 para o consumo mais eficiente dessa fonte de carbono. Assim, dois dos genes responsáveis pelo consumo do glicerol em Escherichia coli: glpF e glpK, que codificam uma aquaporina e a glicerol quinase (atua na fosforilação do glicerol a glicerol 3-fosfato), respectivamente, foram expressos em R. eutropha DSM 545 (parental) e assim foi construída a cepa R. eutropha_glpFK (recombinante). Ao se analisar comparativamente o crescimento de R. eutropha_glpFK com R. eutropha DSM 545, em meio contendo glicose, os resultados mostraram que a expressão dos genes glpFK não interferiu no desempenho desse microrganismo. Cultivos em modo batelada em biorreator foram conduzidos para comparar o desempenho das cepas parental e recombinante, em glicerol, em vinhaça em meio contendo vinhaça adicionada de glicerol. Em vinhaça, a recombinante foi capaz de crescer com µmáx de 0,41 h-1, enquanto R. eutropha foi de 0,18 h-1. Nesses experimentos, não houve praticamente produção de biopolímero pois não ocorreu a limitação de um nutriente essencial. Nos ensaios conduzido sem vinhaça com adição de glicerol, a recombinante foi capaz de crescer com µmáx de 0,33 h-1 e acumulou 34% de P(3HB), enquanto R. eutropha foi de 0,19 h-1 e 15% de P(3HB). Ao comparar o crescimento das duas cepas, nos cultivos contendo glicerol como fonte de carbono, ambas foram capazes de acumular aproximadamente 35% de biopolímero. Com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se dizer que a vinhaça é um substrato com potencial para ser utilizado por R. eutropha, com velocidades específicas máximas de crescimento superiores às encontradas em outros substratos, porém há a necessidade de uma fonte de carbono adicional para aumentar os percentuais de acúmulo de biopolímero. Uma dessas alternativas é o glicerol que quando adicionado à vinhaça a produção de P(3HB) aumentou. O glicerol foi mais rapidamente consumido e com rendimentos maiores por R. eutropha_glpFK que por R. eutropha DSM 545. Assim, pode-se dizer que, R. eutropha é capaz de crescer e produzir P(3HB) a partir de vinhaça e glicerol.<br> / Abstract : Polyhydroxyalkanoates (PHA), a biodegradable energy store of microbes, is an alternative to petroleum-derived thermoplastics. Researches had been foccused to develop efficient production process with low costs.The bacteria Ralstonia eutropha is one of the most studied microrganisms for P(3HB) production, a widely studied PHA. Vinasse is the main liquid waste from ethanol industry and its valorization by a process that use this waste as substrate for an added value product, like P(3HB), contributes to ethanol production, besides try to solve an environment problem related to this waste. Glycerol is one of the main carbon source present in vinasse. In this study, vinasse was used as substrate for P(3HB) production by R. eutropha DSM 545. Different vinasse concentrations were evaluated, and no inhibitory effect were observed. Batch cultivation was performed in bioreactor using vinasse (undiluted) plus the mineral medium salts and R. eutropha could growth until 5 g/L final cell concentration. Once the bacteria reached the stacionary growth fase while residual substrates were available, like glycerol, this study examined the enhancement of glycerol assimitation ability of R. eutropha DSM 545 by introduction of the genes of aquaglyceroporin (glpF), able to facilitate the glycerol transport, and glycerol kinase (glpK), able to phosphorylated glycerol to yield glycerol 3-phosphate, from Escherichia coli. The growth behavior of the recombinant strain was compared to the parental strain on glucose and results showed that the glpFK expression didn?t affect R. eutropha DSM 545 behavior. Batch cultivations in bioreactor were performed to compare the parental and the engineered strains, on vinasse, vinasse plus glycerol and glycerol, as culture medium. On cultivations using vinasse, the recombinat strain grow with a µmáx of 0,41 h-1, while R. eutropha was 0,18 h-1 and no P(3HB) production was observed, since the nitrogen limitation did not occurred. When vinasse plus glycerol was used as culture medium, aimed to increase the carbon source, R. eutropha_glpFK was able to growth with µmáx 0,33 h-1 and produced 34% of P(3HB), while the wild type grow with µmáx 0,19 h-1 and produced 15% of P(3HB). In the cultivations using only glycerol as substrate, without considering the difference in pre culture time, both strains showed the same behavior and produced about 35% of P(3HB). In conclusion, vinasse is a potencial substrate for R. eutropha, showing maximum specific growth rates higher when compared to others substrates, but it requires an extra carbon source to increase the P(3HB) accumulation. In this context, glycerol is a good alternative, since when it was used with vinasse the biopolymeraccumulation was higher and it was efficiently consumed by the engineered strain expressing glpFK genes.

Nas ultimas décadas o processo de biossorção tem alcançado grande relevância no tratamento de efluentes contendo metais potencialmente tóxicos. O uso de bactérias nesse processo tem obtido destaque, uma vez que possuem inúmeras vantagens. O presente estudo pretendeu avaliar o mecanismo envolvido no processo de biossorção dos íons Pb(II) e Hg(II) por meio das linhagens Cupriavidus metallidurans (CH34) e Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3). Dentre os modelos estudados a isoterma de Langmuir foi a que melhor se ajusta ao processo de adsorção, apresentando uma capacidade máxima de adsorção (qmax) de 0,98 mg.g-1 para o Hg(II) e 86,2 mg.g-1 para o Pb(II), para a linhagem selvagem. Já para a linhagem recombinante o qmax obtido foi 3,4 mg.g-1 para o mercúrio e 172,4mg g-1 para o chumbo. Baseado nos valores referentes à energia livre de Gibbs (&Delta;G) o processo de retenção ocorreu de forma química e espontânea. A influencia do pH foi avaliada por meio de estudo competitivo entre os íons metálicos, em níveis equimolares. O valor que melhor contemplou a adsorção para ambos os íons foi o pH 7,0, tendo o Pb(II) demonstrado maior capacidade de retenção. Em pH 2,0 houve maior retenção do Hg (II), já em pH 10,0 o Pb(II) obteve maior retenção. Indicando que o meio influencia diretamente na competição dos íons metálicos pelos sítios ativos. Constatou-se que a retenção do metal é robusta e estável ao longo de 6 meses. Os resultados indicam que a Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) pode ser uma boa opção para biossorção de íons metálicos por meio de biorreator. / In the last decades the biosorption process, has achieved great relevance treatment of effluents containing toxic metals. The use of bacteria in the process has several advantages. This study aimed to evaluate the mechanism involved in the biosorption process of Pb (II) and Hg (II) ions by C. metallidurans (CH34) and C. metallidurans (CH34/pCM3) genetically modified strain. The Langmuir isotherm was the best adjusts to the adsorption process. The maximum adsorption capacity (qmax) of 0.98 mg.g-1 for Hg (II) and 86.2 mg.g -1 to Pb (II), for a wild strain (pH 7,0). However, for a recombinant strain, the qmax was 3.4 mg.g-1 for mercury and 172.4 mg.g-1 for the lead (pH 7,0). Based on the Gibbs free energy (&Delta;G) values on the adsorption process, it occurred chemically and spontaneously. The Hg(II) presented high adsorption capacity at pH=2 in comparing with Pb(II). While Pb(II) presented high adsorption capacity at pH=10. The studies of binding process was robust and stable for 6 months. The results indicate that Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) can be a good option for biosorption of metal in a bioreactor.

Nas ultimas décadas o processo de biossorção tem alcançado grande relevância no tratamento de efluentes contendo metais potencialmente tóxicos. O uso de bactérias nesse processo tem obtido destaque, uma vez que possuem inúmeras vantagens. O presente estudo pretendeu avaliar o mecanismo envolvido no processo de biossorção dos íons Pb(II) e Hg(II) por meio das linhagens Cupriavidus metallidurans (CH34) e Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3). Dentre os modelos estudados a isoterma de Langmuir foi a que melhor se ajusta ao processo de adsorção, apresentando uma capacidade máxima de adsorção (qmax) de 0,98 mg.g-1 para o Hg(II) e 86,2 mg.g-1 para o Pb(II), para a linhagem selvagem. Já para a linhagem recombinante o qmax obtido foi 3,4 mg.g-1 para o mercúrio e 172,4mg g-1 para o chumbo. Baseado nos valores referentes à energia livre de Gibbs (&Delta;G) o processo de retenção ocorreu de forma química e espontânea. A influencia do pH foi avaliada por meio de estudo competitivo entre os íons metálicos, em níveis equimolares. O valor que melhor contemplou a adsorção para ambos os íons foi o pH 7,0, tendo o Pb(II) demonstrado maior capacidade de retenção. Em pH 2,0 houve maior retenção do Hg (II), já em pH 10,0 o Pb(II) obteve maior retenção. Indicando que o meio influencia diretamente na competição dos íons metálicos pelos sítios ativos. Constatou-se que a retenção do metal é robusta e estável ao longo de 6 meses. Os resultados indicam que a Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) pode ser uma boa opção para biossorção de íons metálicos por meio de biorreator. / In the last decades the biosorption process, has achieved great relevance treatment of effluents containing toxic metals. The use of bacteria in the process has several advantages. This study aimed to evaluate the mechanism involved in the biosorption process of Pb (II) and Hg (II) ions by C. metallidurans (CH34) and C. metallidurans (CH34/pCM3) genetically modified strain. The Langmuir isotherm was the best adjusts to the adsorption process. The maximum adsorption capacity (qmax) of 0.98 mg.g-1 for Hg (II) and 86.2 mg.g -1 to Pb (II), for a wild strain (pH 7,0). However, for a recombinant strain, the qmax was 3.4 mg.g-1 for mercury and 172.4 mg.g-1 for the lead (pH 7,0). Based on the Gibbs free energy (&Delta;G) values on the adsorption process, it occurred chemically and spontaneously. The Hg(II) presented high adsorption capacity at pH=2 in comparing with Pb(II). While Pb(II) presented high adsorption capacity at pH=10. The studies of binding process was robust and stable for 6 months. The results indicate that Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) can be a good option for biosorption of metal in a bioreactor.

Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros produzidos por diversas bactérias como material de reserva de carbono e energia, apresentando propriedades termoplásticas comparáveis às dos plásticos de origem petroquímica, além da vantagem de ser totalmente biodegradáveis. A bactéria Cupriavidus necator DSMZ 545 é considerada o organismo modelo para a produção de PHA, possuindo a capacidade de utilizar CO2 como fonte de carbono, porém existem sérias limitações para o seu cultivo autotrófico. Visando otimizar a capacidade autotrófica desta bactéria, foi realizada neste trabalho a clonagem e expressão do gene da bacteriorodopsina (bop) de Halobacterium salinarum em C. necator. Esta proteína de membrana é capaz de converter a energia luminosa em um gradiente de prótons, que pode ser utilizado pela célula para produzir ATP. Obtiveram-se clones recombinantes de C. necator, que, sob iluminação, apresentaram maior produção de ATP, assim como produção aumentada de PHA, sem alterações no crescimento celular. / Polihydroxyalcanoates (PHAs) are polymers produced by several bacteria as carbon and energy storage materials, which show comparable thermoplastic properties with plastics from petrochemical origin and present the advantage of being completely biodegradable. The bacterium Cupriavidus necator DSM 545 is considered as a model organism for PHA production, being able to produce PHA utilizing CO2 as the carbon source, although there are severe limitations for its autotrophic cultivation. In the present work, with the purpose of optimizing the autotrophic capability of this bacterium, the cloning and expression of the Halobacterium salinarum bacteriorhodopsin gene (bop) was undertaken in C. necator. This membrane protein is able to convert light energy in a proton gradient that can be utilized by the cell for ATP production. Upon illumination, the C. necator recombinant clones showed an increase in ATP production, as well as an increase in PHA production, and no alterations in cell growth.

L'uranium est un toxique à la fois chimique et radiologique. C'est un élément que l'on retrouve à faible concentration dans l'environnement sauf lors de pollutions causées par les activités humaines. Du fait de sa forte réactivité, l'ion uranyle peut se complexer à de nombreux constituants du sol, qu'ils soient minéraux ou organiques. Ces différentes formes peuvent être ainsi plus ou moins biodisponibles pour les microorganismes et les plantes et peuvent ensuite rentrer dans la chaîne alimentaire de l'homme. La connaissance et la compréhension des mécanismes de transfert et du devenir d'éléments toxiques chimiques et radiologiques dans la biosphère constituent donc un enjeu capital pour permettre une bonne estimation des risques sanitaires et écologiques. La connaissance de la spéciation est capitale pour engager des processus de biorémédiation. Ici, c'est l'effet des microorganismes sur la spéciation de l'uranium dans l'environnement qui nous intéresse. Selon les formes initiales de l'uranium, les bactéries peuvent l'accumuler et/ou le transformer et ainsi modifier sa biodisponibilité. Les modèles utilisés dans cette étude sont Cupriavidus metallidurans CH34, bactérie tellurique résistante aux métaux lourds, Deinococcus radiodurans R1, bactérie connue pour être une des espèces les plus radiorésistantes et Rhodopseudomonas palustris, bactérie pourpre autotrophe capable de dégrader les composés aromatiques en anaérobie. Ces bactéries sont cultivées en présence de deux formes d'uranium retrouvées dans l'environnement : une forme minérale, le carbonate d'uranyle et une forme organique, le citrate d'uranyle. Ces formes ont d'abord été modélisées et les milieux de culture ont été modifiés pour pouvoir travailler avec ces espèces. La capacité des bactéries à résister, à transformer et/ou accumuler l'uranium a été étudiée. On observe une différence entre les concentrations minimales inhibitrices des deux spéciations mais celle-ci est en fait due à une différence de biodisponibilité des phosphates. Aucune accumulation ne semble être mise en évidence aux pH environnementaux par dosage de l'uranium et par observation au microscope électronique à transmission alors qu'une précipitation est observée à pH 1. La spéciation de l'uranium a été étudiée par spectroscopie d'absorption X (EXAFS). La spéciation est bien maitrisée dans les milieux de culture et les précipités observés aux pH très acide sont ces complexes de phosphates d'uranyle.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T16:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 270526.pdf: 1524874 bytes, checksum: c4882757dd8633788c4950be9cd736d4 (MD5) / Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidrohivalerato) [P(3HB-co-3HV)] é um biopolímero acumulado intracelularmente por muitos organismos como reserva de carbono e energia, em condições desbalanceadas do meio. Possui propriedades termoplásticas semelhantes às dos plásticos petroquímicos e a vantagem de ser biocompatível e completamente biodegradável. Entretanto possui custo elevado de produção frente aos polímeros convencionais, o que limita o uso. Diferentes estratégias de cultivo para a produção do copolímero P(3HB-co-3HV) por Cupriavidus necator foram avaliadas, com o objetivo de aumentar a produtividade do processo, e, consequentemente, a redução do custo de produção. O monitoramento da concentração de biomassa e da concentração de oxigênio dissolvido indicou as mudanças metabólicas do microrganismo, sinalizando o momento da limitação de nutriente. Esta sinalização facilita o processo produtivo, permitindo que as alimentações de nitrogênio e ácido propiônico sejam efetuadas a partir do momento exato do início da fase de produção, evitando desperdício de co-substrato. Visando testar a utilização de substratos alternativos de baixo custo, foram realizados testes em bioreator, estudando o crescimento de C. necator em diferentes fontes de carbono (glicose e melaço cítrico). Quando se utilizou melaço cítrico como fonte de carbono, obteve-se maior velocidade específica de crescimento (0,35 h-1) comparada ao cultivo realizado em glicose (0,19 h-1), demonstrando-se dessa forma como substrato promissor para a produção de biopolímeros. A alimentação do elemento limitante (nitrogênio) durante a fase de produção permitiu a formação de um copolímero com 9,3 mol% de acúmulo das unidades 3HV, comparado ao acúmulo de 3,7 mol% em cultura submetida à carência de nitrogênio. No entanto, não foi observado aumento de produtividade em virtude do elevado crescimento residual promovido, o qual prejudicou o acúmulo do polímero. A cinética do crescimento e a transferência de oxigênio dissolvido durante o cultivo foram acompanhados. A velocidade específica de consumo de oxigênio (QO2) e o kLa foram determinados através do método dinâmico. Os resultados mostram que o kLa, a velocidade específica de crescimento (µX) e de respiração (QO2) são afetados pelo aumento da concentração de biomassa. O maior consumo global de oxigênio foi de 595 gO2.L-1.h-1 para uma concentração celular de 18 g.L-1 em cultivo realizado em glicose, sendo que a velocidade específica de consumo de oxigênio para manutenção celular neste cultivo foi de 47,1 mgO2.(gcél.h)-1. A modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica máxima de crescimento (µmáx), tempo da fase lag (?) e aumento logarítmico da população (A), utilizando melaço cítrico e glicose como substrato. Utilizaram-se três modelos primários de crescimento (Gompertz Modificado, Logístico e Barany e Roberts) e o modelo de Gompertz Modificado foi o que apresentou melhor ajuste às curvas de crescimento da bactéria, para ambas as fontes de carbono testadas. Pelo modelo de Gompertz Modificado foi possível prever o momento da limitação da cultura. Por fim, a caracterização do copolímero produzido a partir das diferentes fontes de substrato testadas mostrou que os mesmos apresentam propriedades térmicas semelhantes ao copolímero industrial e superiores ao homopolímero industrial P(3HB). / Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-co-3HV)] is a biopolymer accumulated intracellularly by many microorganisms, as carbon and energy storage, under unbalanced growth. It possesses thermoplastic properties similar to the conventional plastics with advantages of biocompatibility and complete biodegradability. However, its high cost of production related to conventional plastics limits its use. Different strategies of P(3HB-co-3HV) production by Cupriavidus necator were studied, aiming to increase its productivity, and, consequently reducing the cost of production. Culture biomass potential and percentage of dissolved oxygen indicated state changes in C. necator and identified the limitation point during the culture. Further, it facilitated the production process allowing that nitrogen and propionic acid feedings were realized from the beginning of the production phase, without co-substrate waste. Looking for alternatives substrates of low cost, experiments in bioreactor were done, studying C. necator growth in different carbon sources (glucose and citrus molasses). When citrus molasses was used as carbon source, has been obtained a higher specific growth rate (0,35 h-1) compared with glucose (0,19 h-1), the production phase, it was demonstrated it is as a promising substrate for biopolymer production. Nitrogen feeding, during the production phase, allowed the formation of copolymer with higher percentage of 3HV units, with 9,3 mol% compared with accumulation of 3,7 mol% in the culture with nitrogen deficiency. However, there wasn't increase of productivity due to the high residual growth promoted. The kinetics growth and oxygen transfer were monitored during of cultivation. The specific oxygen uptake rate (QO2) and the kLa were determined through the dynamic method. Results show that kLa, as well as the specific growth (µX) and respiration rates (QO2), are affected by the increase in biomass concentration. The highest value of specific consumption rate of oxygen uptake observed was 595 mgO2.L-1.h-1, for a cell concentration of 18 g.L-1, in culture with glucose. The amount of oxygen necessary for cell maintenance was 47,1 mgO2.gcel.h-1. The mathematical modeling of bacterial growth was used to estimate the following parameters: specific maximum growth (µmáx), time of lag phase (?) and logarithmic increase of population (A), using citrus molasses and glucose as carbon source. Three primary models were used (Modified Gompertz, Logistic and Barany and Roberts) and the Modified Gompertz model was present the bets fit to the growth curves of the bacteria, on the different carbon source tested. Through Modified Gompertz model, it was possible to establish the moment of nitrogen limitation in the culture. The copolymer characterization obtained from differents carbon source tested showed that thermal properties were similar to the conventional copolymer and higher that to the conventional homopolymer P(3HB).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T12:21:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 281561.pdf: 1244047 bytes, checksum: 79873fedaad2955ef576d9d65faf204d (MD5) / Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidrohivalerato) [P(3HB-co-3HV)] é um biopolímero acumulado intracelularmente por muitos organismos como reserva de carbono e energia, em condições desbalanceadas do meio. Possui propriedades termoplásticas semelhantes às dos plásticos petroquímicos e a vantagem de ser biocompatível e completamente biodegradável. Entretanto possui custo elevado de produção frente aos polímeros convencionais, o que limita o uso. Diferentes estratégias de cultivo para a produção do copolímero P(3HB-co-3HV) por Cupriavidus necator foram avaliadas, com o objetivo de aumentar a produtividade do processo, e, consequentemente, a redução do custo de produção. O monitoramento da concentração de biomassa e da concentração de oxigênio dissolvido indicou as mudanças metabólicas do microrganismo, sinalizando o momento da limitação de nutriente. Esta sinalização facilita o processo produtivo, permitindo que as alimentações de nitrogênio e ácido propiônico sejam efetuadas a partir do momento exato do início da fase de produção, evitando desperdício de co-substrato. Visando testar a utilização de substratos alternativos de baixo custo, foram realizados testes em bioreator, estudando o crescimento de C. necator em diferentes fontes de carbono (glicose e melaço cítrico). Quando se utilizou melaço cítrico como fonte de carbono, obteve-se maior velocidade específica de crescimento (0,35 h-1) comparada ao cultivo realizado em glicose (0,19 h-1), demonstrando-se dessa forma como substrato promissor para a produção de biopolímeros. A alimentação do elemento limitante (nitrogênio) durante a fase de produção permitiu a formação de um copolímero com 9,3 mol% de acúmulo das unidades 3HV, comparado ao acúmulo de 3,7 mol% em cultura submetida à carência de nitrogênio. No entanto, não foi observado aumento de produtividade em virtude do elevado crescimento residual promovido, o qual prejudicou o acúmulo do polímero. A cinética do crescimento e a transferência de oxigênio dissolvido durante o cultivo foram acompanhados. A velocidade específica de consumo de oxigênio (QO2) e o kLa foram determinados através do método dinâmico. Os resultados mostram que o kLa, a velocidade específica de crescimento (µX) e de respiração (QO2) são afetados pelo aumento da concentração de biomassa. O maior consumo global de oxigênio foi de 595 gO2.L-1.h-1 para uma concentração celular de 18 g.L-1 em cultivo realizado em glicose, sendo que a velocidade específica de consumo de oxigênio para manutenção celular neste cultivo foi de 47,1 mgO2.(gcél.h)-1. A modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica máxima de crescimento (µmáx), tempo da fase lag (?) e aumento logarítmico da população (A), utilizando melaço cítrico e glicose como substrato. Utilizaram-se três modelos primários de crescimento (Gompertz Modificado, Logístico e Barany e Roberts) e o modelo de Gompertz Modificado foi o que apresentou melhor ajuste às curvas de crescimento da bactéria, para ambas as fontes de carbono testadas. Pelo modelo de Gompertz Modificado foi possível prever o momento da limitação da cultura. Por fim, a caracterização do copolímero produzido a partir das diferentes fontes de substrato testadas mostrou que os mesmos apresentam propriedades térmicas semelhantes ao copolímero industrial e superiores ao homopolímero industrial P(3HB).