The common human GNB3 825C > T variant, which is present in 50% of the world’s chromosomes, has previously been shown to predispose individuals to hypertension, cardiac and neural disorders. This variant causes the production of a stable and gain of function protein Gβ_3S- This thesis describes the discovery of a novel D153del mutation that produces an unstable, loss of function, protein Gβ_3D in the recessively inherited, retinopathy globe enlarged (rge) chickens. This thesis also demonstrates that the normal Gβ₃ downstream phosphorylation signalling pathways are significantly altered in a tissue specific manner in rge chicken organs and in a human GNB3 825TT lymphoblast cell line. In rge tissues expressing Gβ_3D protein, the cAMP induced GRK2 phosphorylation activity is significantly altered. Moreover MAPK1 (ERK2) phosphorylation is significantly decreased compared to normal tissues. In contrast human 825TT cell lines expressing the Gβ_3S protein, showed enhanced cAMP induced GRK2 and MAPK (ERK1 and ERK2) phosphorylation activity. These results confirm previous findings of 825C > T Gβ₃ studies, that Gβ_3S is indeed a hyper-activating structural variant, in contrast to the D153del Gp3D is a classical recessively inherited non-functional mutation.

G-protein pathway suppressor 2 (GPS2) is a 36kD protein involved in a number of regulatory functions in key metabolic organs. First discovered as a suppressor of the RAS- and MAPK- signaling pathways, GPS2 is subsequently identified as part of the NCoR/SMRT corepressor complex that play an important regulatory role in gene transcription, and GPS2 is also involved in meiotic recombination in the nucleus. Recently, we identified a non-transcriptional role of GPS2 as an inhibitor of the pro-inflammatory JNK pathway activation in response to tumor necrosis factor alpha (TNF-a;) in the cytosol. This suggests that GPS2 function may be dependent on its cellular localization. However, an understanding of how GPS2 differentially target cellular compartments is still lacking. In this study, we show that a tightly controlled balance between GPS2 protein stabilization and degradation regulates the function of nuclear GPS2. Our results reveal that methylation by arginine methyltransferase PRMT6 and interaction with exchange factor TBL1 cooperate to protect GPS2 from Siah2-dependent proteasomal degradation, thus promoting GPS2 nuclear localization. In addition, our results link GPS2 protein instability to decreased nuclear-encoded mitochondrial gene expression, suggesting that GPS2 may play an important role in regulating mitochondrial oxidative capacity, whose imbalance has been linked to chronic inflammation and insulin resistance. In conclusion, our findings illustrate post-transcriptional modification is important in the regulation of GPS2 cellular function. Understanding such molecular regulation of GPS2 is critical in furthering future efforts to investigate its roles in cellular homeostasis and inflammatory responses.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-01-16Bitstream added on 2014-06-13T19:55:49Z : No. of bitstreams: 1 sabbag_mp_me_sjrp.pdf: 582990 bytes, checksum: a674199278bb87518fc43d93309aefd1 (MD5) / As infecções respiratórias agudas (IRAs) constituem a principal causa de mortalidade infantil no mundo, e o Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV – Human Respiratory Syncytial Virus) é um dos principais agentes etiológicos das IRAs. Este vírus pertencente à família Paramyxoviridae, é envelopado, de simetria helicoidal, cujo genoma é RNA de fita simples não segmentada. A infectividade do vírus está relacionada com suas proteínas de membrana e dentre elas a glicoproteína G, que é responsável pela ligação do vírus à célula hospedeira e conseqüente instalação da infecção. Esta glicoproteína exerce um importante papel como antígeno de reconhecimento, sendo alvo para identificação do RSV através de anticorpos. Existem evidências de que esta proteína se liga a receptores glicosilados na célula hospedeira, porém ainda não foi descrito um receptor para a proteína G na célula. Para elucidar estes mecanismos de interação, foram realizados estudos experimentais e teóricos desta proteína. Os domínios solúveis da região N-terminal (1 a 38 aa) e C-terminal (67 a 298 aa), com 231 aminoácidos da glicoproteína G do hRSV foram clonados e a região N-terminal foi expressa em bactéria BL21 pLysS. Em paralelo, foi realizada a caracterização teórica desta proteína, e foram avaliados os possíveis sítios de interação da mesma com glicosaminoglicanos (heparina). Foram obtidos dois modelos teóricos para a proteína G do hRSV, bem como dois modelos de interação com heparina, determinando portanto, um possível sítio de ocorrência de interação. O conhecimento da estrutura da proteína G é de grande importância para elucidar a composição da estrutura e os mecanismos de interação com potenciais ligantes e deste modo, em um passo posterior, propor mecanismos de reconhecimento celular pelo hRSV, através de glicosaminoglicanos / Acute Respiratory Infections (ARI) are the leading cause of infant mortality in the world, and the Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the main agents of ARI. This virus belongs to Paramyxoviridae family, has a lipidic envelope, helical symmetry and its genome is a single-stranded RNA. The viral infectivity is related to its membrane proteins and among them the G glycoprotein, which is responsible for binding the virus to the host cell and consequent infection. This glycoprotein plays an important role as antigen recognition, being the target for hRSV identification through antibodies. There are evidences that this protein binds to host cell glycosylated receptors, but it has not been described a receptor for G protein in the cell yet. To elucidate these interaction mechanisms and understand the process of viral infectivity, we performed experimental and theoretical studies of this protein. The soluble domains of the N-terminal (1-38 aa) and C-terminal regions (67-298 aa), with 231 amino acids of the hRSV G glycoprotein have been cloned and the N-terminal region was expressed in BL21 pLysS bacteria. In a later trial these peptides will be purified and biophysical tests will be done. It was also performed a theoretical characterization of this protein, to assess the possible interaction sites with glycosaminoglycan (heparin). It were obtained two theoretical models for the hRSV G protein as well as two interaction models with heparin, in order to determine a possible site of occurrence of interaction. Knowledge of G protein structure is of great importance to elucidate the mechanism of viral infectivity and interaction mechanisms with potential ligants, and the results obtained in this work will allow us, in a later step, to propose mechanisms of cellular recognition by hRSV through glycosaminoglycans

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Le striatum est composé principalement de neurones épineux de taille moyenne, subdivisés en neurones striatopallidaux et striatonigraux en fonction de leurs projections et de leur expression en récepteurs et neuropeptides. Ces deux populations neuronales sont respectivement à l’origine des voies indirecte (ou inhibitrice) et directe (ou activatrice) des noyaux de la base, présentant des effets opposés à la fois au niveau moteur et motivationnel. Ces deux voies sont également différemment affectées dans différentes pathologies des noyaux de la base, telles que les maladies de Huntington et de Parkinson et les addictions. Les mécanismes moléculaires et cellulaires de régulation des neurones STP et STN ne sont cependant pas encore pleinement compris. Dès lors, l’identification et l’étude de la fonction de gènes spécifiques de l’une ou l’autre de ces sous-populations pourraient constituer une étape importante vers une meilleure compréhension de leur fonctionnement. Dans cette optique, notre laboratoire a précédemment réalisé une étude comparative des profils d’expression de chacune des sous-populations striatales par microarray. Parmi les gènes potentiellement inégalement exprimés dans les neurones STP et STN, nous avons identifié GPRIN3, un membre de la famille G Protein-Regulated Inducer of Neurite outgrowth (GPRIN), comme étant une cible intéressante. Cette famille, bien qu’encore très peu caractérisée, interagit en effet avec les sous-unités Gαi/o des protéines G et joue par conséquent un rôle régulateur sur la fonction et la voie de signalisation de certains GPCRs, tels que le récepteur μ opioïde. De plus, contrairement aux autres membres de la famille GPRIN, nos résultats de microarray suggèrent également un niveau d’expression élevé de GPRIN3 dans les neurones striataux chez l’adulte. Etant donné le rôle crucial des GPCRs au niveau du striatum et plus particulièrement dans le comportement différentiel des neurones STP et STN, GPRIN3 pourrait dès lors constituer un élément important dans le fonctionnement des neurones striataux. Ce travail s'est par conséquent axé sur l’élucidation du rôle de GPRIN3 dans les fonctions striatales. Dans ce but, nous avons dans un premier temps établi le profil d'expression de GPRIN3 chez la souris, au niveau du cerveau adulte et lors de l'embryogénèse. Ceci nous a permis de confirmer, chez l'adulte, l'expression majoritairement striatale de GPRIN3, et l'expression préférentielle dans les neurones STP. Nous avons également généré différents vecteurs d'expression de la protéine GPRIN3 et établi sa localisation subcellulaire en lignée HEK293T. La génération et la caractérisation d'un modèle d'invalidation constitutive ainsi que d'un modèle de répression par interférence ARN ont par la suite mis en évidence une implication, directe ou indirecte, de GPRIN3 dans la régulation fine de la signalisation du D2R. En effet, nous avons montré une modification des comportements liés à la motivation et à la réponse à la cocaïne ainsi qu’une altération de l’état de phosphorylation de DARPP32 et de la réponse à l’halopéridol dans le modèle d’invalidation constitutive. De plus, la réponse au quinpirole est également modifiée dans les deux modèles testés. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent dès lors une altération de la voie de signalisation du D2R en l’absence de GPRIN3 fonctionnel. En outre, les neurones STP dépourvus de GPRIN3 fonctionnel présentent des modifications de leur morphologie et de leurs propriétés électrophysiologiques. En conclusion, ce travail de thèse a permis d’apporter les premières pistes quant à la fonction de GPRIN3, une protéine totalement méconnue, dans le striatum, de par la création de modèles d’invalidation constitutive et de répression Cre-dépendante de cette protéine. Divers outils moléculaires ont également été générés et pourront être utilisés dans la suite de la caractérisation des fonctions de GPRIN3. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de protéines membranaires, et ils sont la cible de plus de 25% des médicaments. Ces récepteurs activent diverses voies de signalisation cellulaire via plusieurs familles de protéines G hétéro-trimériques (Gs, Gq, Gi/o et G12/13). Etant donné qu’un RCPG peut activer différentes protéines G, il est important de comprendre comment des ligands favorisent l’activation de certaines protéines G au détriment des autres (ligands biaisés). L’objectif de mon travail a été de développer de nouveaux tests pour l’étude des protéines G qui soient spécifiques d’une famille voire même de certains sous-types de protéines. / G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the main family of membrane proteins, and they are the target of more than 25% of drugs in the market. These receptors activate various signaling pathways through different families of heterotrimeric G proteins (Gs, Gq, Gi/o et G12/13). Since a given GPCR can activate several G proteins, it is important to understand how ligands favor the activation of some of these G proteins (biased ligands). The objective of my thesis was to develop assays to study most G protein subtypes.

Abstract The luteinizing hormone receptor (LHR) is a G protein-coupled receptor (GPCR) that has a large N-terminal ligand binding ectodomain. The LHR ectodomain splice variant, expressed concomitantly with the full-length LHR in tissues, has an unknown biological function. GPCRs are a major pharmacological target, however, very little is known about the intracellular regulation of these receptors. In the present work, expression and maturation of the rat LHR and its variant were elucidated using both tissues and heterologous expression systems. A special effort was made to identify the role of developmental stage and tissue type on the LHR maturation and to find out about the molecular role of the ectodomain splice variant. We found two sites of localization for the receptor, namely the sensory system and urogenital tissues. This was demonstrated at mRNA and protein level and by rat LHR promoter-driven β-galactosidase (β-Gal) expression in the mice. In neurons, the β-Gal co-localized with the cytochrome P450 side chain cleavage enzyme, which may indicate a novel role in the neurosteroid synthesis. The neuronal LHR was expressed in the mature and immature protein forms in both developing and adult tissues, being able to bind hormone with similar high-affinity as gonadal receptors. In contrast, only immature receptors were detected in the fetal rat urogenital structures. A significant novel finding was substantial upregulation of the LHR in pregnant female rat adrenal glands and kidneys at a time that coincides with the differentiation of the fetal urogenital tissues. The mice overexpressing the ectodomain splice variant showed interference in pituitary-gonadal functions and morphological changes in the urogenital tissues. The studies showed that the variant was an endoplasmic reticulum (ER)-retained soluble protein. It accumulated in juxtanuclear regions of the ER together with ER folding chaperones and was a substrate for ER associated degradation (ERAD). The co-expression of the variant with the full-length receptor decreased the amount of receptors and misrouted them to the juxtanuclear ER subcompartment. Taken together, we suggest that the maturation of the LHR protein is developmentally and physiologically regulated at the post-translational level in tissues. The LHR ectodomain splice variant possibly modulates post-translationally the number of full-length receptors through physiological signals. Our observation of the chaperone and protein accumulation into a specific ER subcompartment may represent a protein quality control holding compartment for inefficiently/misfolded ERAD substrates.

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Die meisten membranständigen Rezeptoren in Säugetieren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Sie sind entscheidend beteiligt an der Verarbeitung von sensorischen Reizen, an der Wirkung von Signalmolekülen, an Zellwachstum, Zellreifung und Entzündungsprozessen. Dennoch sind für viele GPCR die molekularen und auch physiologischen Funktionen nicht bekannt. Die Erforschung dieser Rezeptorproteine ist von großer medizinischer Relevanz, da deren Fehlfunktion eine mögliche Ursache für Krankheiten ist und sich GPCR häufig als pharmakologische Zielmoleküle eignen. Mit 33 Mitgliedern bilden die Adhesion GPCR die zweitgrößte Klasse von GPCR im Menschen, die bisher allerdings am wenigsten erforscht wurde. Sie sind bedeutsam für das Immunsystem, die zelluläre Organisation während der Embryonalentwicklung, die Angiogenese und die Entstehung von Tumoren. Adhesion GPCR besitzen im Transmembranbereich die typische Struktur von GPCR, unterscheiden sich jedoch von klassischen GPCR aufgrund ihrer sehr großen und komplexen N Termini. Die Frage, ob diese Rezeptorfamilie funktionell an G-Proteine koppelt, blieb lange unbeantwortet. Für einige wenige Rezeptoren der Subfamilie wurde die Bindung von Liganden beschrieben, dennoch fehlt für diese bisher der Beweis einer Rezeptoraktivierung. Unsere Arbeitsgruppe konnte zum ersten Mal eine Gαs vermittelte Adenylylcyclase (AC) Aktivierung durch den Adhesion GPCR GPR133 zeigen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden in dieser Arbeit die Signalkopplungswege der drei Adhesion GPCR GPR126, GPR56 und CD97 mittels verschiedener in vitro Methoden untersucht, um eine G-Protein-vermittelte Kopplung zu beweisen und weiter zu spezifizieren. Eine Grundlage bildeten die erfolgreiche Entwicklung einer Klonierungsstrategie und der Nachweis einer suffizienten Expression der Adhesion GPCR sowohl intrazellulär, als auch an der Membran. Durch die N-terminale Integration eines Rhodopsin Epitops gelang eine Steigerung der Zellmembranexpression für GPR126 und GPR56. Weiterhin wurden eine funktionelle Kopplung von GPR126 und GPR56 an das Gs-Protein sowie von GPR126 an das Gi-Protein bewiesen. Da eine G-Protein-gekoppelte Signaltransduktion somit für zwei weitere Adhesion GPCR gezeigt werden konnte, kann diese als etabliert für die gesamte Rezeptorklasse gelten.:Inhaltsverzeichnis 3 Abbildungsverzeichnis 4 Tabellenverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis 6 1 Einleitung 8 1.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und die Verarbeitung von Signalen 9 1.2 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit unbekannter Funktion 11 1.3 Die Adhesion G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 14 1.3.1 Die Struktur von Adhesion GPCR 14 1.3.2 Signaltransduktion von Adhesion GPCR 17 1.3.3 Der Adhesion GPCR GPR126 18 1.3.4 Der Adhesion GPCR GPR56 19 1.3.5 Der Adhesion GPCR CD97 20 2 Ziele und Fragestellungen 24 3 Materialien und Methoden 25 3.1 Chemikalien, Materialien, Plasmide, Primer 25 3.2 Verwendete Mikroorganismen und Zellen 26 3.3 Klonierung der Adhesion GPCR GPR126, GPR56 und CD97 26 3.3.1 Isolation von RNA 26 3.3.2 Herstellung von cDNA durch Reverse Transkription 27 3.3.3 Klonierungsstrategie und Primer-Design 27 3.3.4 Topo-Klonierung 29 3.3.5 Selektionierung der Klone 31 3.3.6 Integration von tags und pcDps-Klonierung 31 3.4 Rezeptor-Expression und Funktionsanalyse in Säugerzellen 33 3.4.1 Zellkultur und Transfektion 33 3.4.2 Oberflächen-ELISA 34 3.4.3 Sandwich-ELISA 35 3.4.4 cAMP-Akkumulationsassay 36 3.4.5 Inositolphosphat-Akkumulationsassay 38 3.4.6 G12/13-vermittelte Veränderung des Zytoskeletts 39 3.5 Statistische Auswertung der Daten 41 4 Ergebnisse 42 4.1 Zellmembranexpression von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 42 4.2 Gesamt-Zell-Expression von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 43 4.3 Aktivierung des AC/cAMP-Signalweges durch Adhesion GPCR exprimiert in COS 7-Zellen 45 4.3.1 Untersuchung der basalen GPR126-induzierten cAMP-Bildung 46 4.3.2 Untersuchung der basalen GPR56-induzierten cAMP-Bildung 48 4.3.3 Untersuchung der basalen CD97-induzierten cAMP-Bildung 50 4.4 Aktivierung des PLC/IP3-Signalweges durch Adhesion GPCR exprimiert in COS-7-Zellen 52 4.4.1 Untersuchung der basalen IP3-Bildung durch Adhesion GPCR 52 4.4.2 Untersuchung der IP3-Bildung von Adhesion GPCR mit Gαqi4-Co-Expression 54 4.4.3 Untersuchung der IP3 Bildung von Adhesion GPCR mit Gαqs4 Co-Expression 56 4.5 G12/13-vermittelte Veränderung des Zytoskeletts von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 58 5 Diskussion 62 5.1 Entwicklung einer erfolgreichen Klonierungsstrategie für Adhesion GPCR 62 5.2 Sicherung der Expression von Adhesion GPCR 63 5.2.1 Artifizielle Steigerung der Oberflächenexpression durch das Rho-Epitop 65 5.3 G-Protein-Kopplung der Adhesion GPCR 66 5.3.1 Der GPR126 aktiviert Gs- und Gi-Proteine 67 5.3.2 Der GPR56 aktiviert Gs-Proteine 69 5.3.3 G-Protein-Kopplung des CD97 71 5.3.4 Untersuchung einer G12/13-vermittelten Veränderung des Zytoskeletts 73 5.4 Ausblick 76 6 Zusammenfassung der Arbeit und Schlussfolgerungen 77 7 Literaturverzeichnis 79 8 Anlagen 86 Selbstständigkeitserklärung 89 Lebenslauf 90 Veröffentlichungen 91 Danksagung 92

Eine Vielzahl von Krankheiten und Phänotypen im Menschen werden durch Mutationen in G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) verursacht. Die Klasse der Adhäsions-GPCR (aGPCR) ist bisher wenig erforscht, wird aber mit diversen Funktionen in der Immunität, Nervenentwicklung, Embryonalentwicklung und im Tumorwachstum in Zusammenhang gebracht. Ein Vertreter der Gruppe V der aGPCR ist der GPR133 (ADGRD1). Einige genomweite Assoziationsstudien konnten den gpr133-Lokus mit Veränderungen im Metabolismus, in der Körpergröße und der Herzfrequenz verknüpfen. Für diesen aGPCR wurde bereits die Signaltransduktion über Gαs und Gαi gezeigt, sodass eine funktionelle Charakterisierung des GPR133 und dessen Varianten über cAMP-, cAMP response element- (CRE) und CRE binding protein- (CREB) Assays in vitro möglich ist. Systematische Untersuchungen der Struktur des GPR133 konnten die gebundene agonistische „Stachelsequenz“ aufzeigen. Dies legt den Grundstein für die funktionelle Untersuchung von Mutationen im GPR133. Eine Analyse von mehr als 1000 sequenzierten humanen Genomen ergab über 9000 Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) im gpr133-Gen. Ungefähr 2,4 % der SNP liegen in kodierenden Genabschnitten und resultieren in 129 nicht-synonymen SNP (nsSNP) an 119 Aminosäurepositionen. Die funktionelle Relevanz dieser Missense-Varianten war unbekannt. Tiefergehende Analysen konnten nsSNP identifizieren, die zu einem vollständigen bzw. partiellen Funktionsverlust (A448D, Q600stop, C632fs [frame shift], A761E, N795K) oder zu einer erhöhten Basalaktivität (F383S, D453N) führen. Ein Vergleich der aGPCR Subklassen basierend auf diversen Orthologsequenzen konnte zudem stark konservierte Bereiche aufzeigen, deren Änderungen durch nsSNP im GPR133 in Funktionsänderungen münden. Das große im Menschen vorhandene funktionelle Spektrum von GPR133-Varianten könnte für klinisch relevante Phänotypen verantwortlich sein, auch wenn die bisher erfassten heterozygoten Individuen lebensfähig sind.