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The vesicular stomatitis virus glycoprotein G is responsible for low pH mediated membrane fusion induced by the virus. Four linker insertion mutants (H2, H5, HIO, A4) of the G ectodomain were found to disrupt fusion and yet maintained all the requirements for proper folding and cell surface expression (Li et al., 1993). Site specific mutagenesis of residues 123 to 137, surrounding the H2 mutant, either blocked or shifted the pH optima and threshold of fusion to more acidic values with a concomitant reduction in cell-cell fusion efficiency (Zhang and Ghosh, 1994; Fredericksen and Whitt, 1995). The region is highly conserved among vesiculoviruses and was found to insert into lipid membranes by hydrophobic photolabelling (Durrer et al., 1995) suggesting a possible role for this domain as the fusion peptide. Site-directed mutagenesis of residues 190 to 210, surrounding the H5 insertion mutant, did not significantly affect fusion (Fredericksen and Whitt, 1995). Surrounding the H10 and A4 insertion mutants is a conserved region, residues 395 to 424, that does not interact with target membranes (Durrer et al., 1995). To determine the functional importance of this region, site-directed mutagenesis was employed. Substitution of conserved Gly 404, Gly 406, Asp 409, and Asp 411 with Ala, Ala, Asn, and Asn, respt:.ctively, both reduced fusion and caused a shift in the pH of fusion threshold to more acidic values (tested by Y. He as published in Shokralla et al., 1998). In this study, the Hl0/A4 region is further mutagenized and tested for fusion. Cell surface expression was examined by indirect immunofluorescence and lactoperoxidase catalyzed iodination. Rates of transport from the endoplasmic reticulum and oligomerization into trimers were tested by resistance to endoglycosidase H and sucrose density gradient centrifugation, respectively. Low-pH induced conformational changes were assayed by resistance to proteolytic digestion. Residues Gly 395, Gly 404, Gly 409 and Ala 418 were substituted with Glu, Lys, Asp, and Lys, respectively. All mutants, with the exception of A418K, were expressed at levels similar to or above wild-type. Mutants G404K and D409A completely abolished fusion. Mutant G395E reduced cell-cell fusion efficiency by 82% and shifted both the pH threshold and optimum of wild type fusion. Although all mutants were capable of trimer formation, alterations in the structure of mutants G404K, D409 A, and A418K were detected by slower transport rates. All Hl0/A4 mutants were more susceptible to trypsin than wild-tyr,e at the pH of6.5, and mutant G404K was completely susceptible at this pH Reductions in the extent of fusion, along with shifts in the pH optima and thresholds of fusion suggest that the Hl0/A4 region (residues 395 to 418) of vesicular stomatitis virus G protein is important for G mediated fusion. The region may influence low-pH induced conformational changes. Double mutants of the H2 and HI0/A4 regions were also tested for their effects on fusion. The extents of fusion mediated by double mutant G proteins were severely reduced with levels ranging from 28% wild-type fusion to complete fusion deficiency. Only mutant Gl31A G404A was capable of 83% wild-type fusion. Mutants Gl31A G395E, Gl31A G404A, Gl31A D4LIN, Dl37N G404A, and the fusion defective D137N D411N were expressed at levels above wild-type G protein at the cell surface. Mutants Fl25Y D411N and Pl26L D411N, although capable of very low levels of fusion were not detectable at the cell surface by immunoflorescence and were detected at low levels by lactoperoxidase catalyzed iodination of cell surface proteins. These two mutants, along with Gl31A G404A, also showed slower transport rates than wild-type G. All double mutants showed increased sensitivity to trypsin at the pH of 6.5 with mutant Fl25Y D411N showing complete susceptibility. They were also all capable of trimer formation by sucrose density gradient centrifugation. In comparing the fusion profiles of double mutants with those of their component single mutants, it was found that in most cases the pH threshold of fusion by double mutants was greater than the sum of the single mutants and that the pH optimum of fusion corresponded to that of the constituent H2 single mutant. Although, the regions are functionally independent, they may indirectly affect one another through alterations in protein structure. / Thesis / Master of Science (MS)

Yes / Background: The receptor for activated C-kinase 1 (RACK1) is a conserved protein belonging to the WD40 repeat family of proteins. It folds into a beta propeller with seven blades which allow interactions with many proteins. Thus it can serve as a scaffolding protein and have roles in several cellular processes. Results: We identified the product of the Dictyostelium discoideum gpbB gene as the Dictyostelium RACK1 homolog. The protein is mainly cytosolic but can also associate with cellular membranes. DdRACK1 binds to phosphoinositides (PIPs) in protein-lipid overlay and liposome-binding assays. The basis of this activity resides in a basic region located in the extended loop between blades 6 and 7 as revealed by mutational analysis. Similar to RACK1 proteins from other organisms DdRACK1 interacts with G protein subunits alpha, beta and gamma as shown by yeast two-hybrid, pulldown, and immunoprecipitation assays. Unlike the Saccharomyces cerevisiae and Cryptococcus neoformans RACK1 proteins it does not appear to take over Gβ function in D. discoideum as developmental and other defects were not rescued in Gβ null mutants overexpressing GFP-DdRACK1. Overexpression of GFP-tagged DdRACK1 and a mutant version (DdRACK1mut) which carried a charge-reversal mutation in the basic region in wild type cells led to changes during growth and development. Conclusion: DdRACK1 interacts with heterotrimeric G proteins and can through these interactions impact on processes specifically regulated by these proteins. / This work was supported by the DFG and SFB670. TYR acknowledges support from the Professorinnen Program of the University of Cologne.

Les protéines-G hétérotrimériques, constituées des sous-unités α, β et γ, sont les premières actrices de la transduction du signal en interagissant directement avec les Récepteurs Couplés aux protéines-G (RCPG). Les protéines-G ont la capacité de lier soit une molécule de GDP lorsqu'elles sont inactives, soit une molécule de GTP quand elles sont activées par un RCPG. Cet échange de nucléotide va conduire à la dissociation de l'hétérotrimère avec d'une part la sous-unité α seule, et d'autre part le complexe βγ. Chacune de ces entités va ensuite propager le signal dans le compartiment intracellulaire. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont pour but de mieux comprendre la dynamique des protéines-G hétérotrimériques et de leurs récepteurs par des techniques de mécanique moléculaire incluant la Dynamique Moléculaire (DM) et l'Analyse de Modes Normaux (AMN). Dans un premier temps une AMN nous a permis de décrire les possibles mouvements de larges amplitudes des protéine-G. Nous avons à l'occasion de cette étude mis au point une méthode de sélection de Modes Normaux (MN) pertinents que nous avons appelés modes représentatifs. Nous avons également développé une méthode d'extraction de ligand (ici le GDP) le long de ces MN. Ceci nous a permis de montrer qu'un mouvement concerté de toute la sous-unité α pouvait permettre l'ouverture de la poche et la sortie du GDP. Dans un deuxième temps, nous avons affiné nos résultats en reconstruisant des profils d'énergie libre le long de plusieurs chemins de sortie possibles pour le GDP. Ainsi nous avons pu proposer un mécanisme fin de sortie du ligand et plusieurs résidus clés impliqués dans cette sortie. Nous avons également étudié le processus de dissociation de l'hétérotrimère par la technique de la Dynamique Moléculaire Dirigée. Il a été possible, à l'issue de cette étude, de proposer un mécanisme à l'échelle moléculaire de la séparation des sous-unités α et βγ. Pour finir, nous avons également étudié le macro-complexe RCPG : protéine-G. Deux études traitent des mécanismes d'activation et de couplage des protéines-G à son récepteur. Nous avons notamment montré que l'hétérotrimère de protéine-G contraint très fortement les mouvements du récepteur. Un mouvement très largement retrouvé dans le complexe ainsi que dans plusieurs autres RCPGs dont les structures sont connues a été proposé comme étant le mouvement d'activation des RCPG une fois complexés à leurs protéines partenaires. / Heterotrimeric G-proteins, constituted of α, β and γ subunits are the first actresses of the intra-cellular signal transduction and interact directly with G-protein Coupled Receptors (GPCR). The heterotrimer is able to bind either a GDP molecule (inactive state) or a GTP molecule (active state). The nucleotide exchange is triggered by the interaction with an activated GPCR and leads to the dissociation of the whole heterotrimer into two independant entities : α and tightly bound βγ subunits. Both subunits further propagate the signal into the intracellular compartment. Goals of the present work were to better understand the mechanics of G-proteins and GPCR by combining several molecular mechanics techniques such as Molecular Dynamics (MD) and Normal Mode Analysis (NMA).Firstly, we described large amplitude motions of the whole G-protein heterotrimer. In this study we developped a method to select relevant Normal Modes (NM), we called representative NM. We also developped a method which consists to extract a ligand (in our case the GDP) out of its binding pocket along computed NM. With these two new methods, we showed that a concerted motion of the α subunit would promote the opening of the pocket and the release of the GDP.Secondly, to refine our results, we performed free energy profiles reconstructions along several putative exit pathways of the GDP. Thus, we proposed for the first time a fine-tuned mechanism of GDP exit at the molecular scale and putative key-residues. We proposed also a molecular scale mechanism for the dissociation of the heterotrimeric G-protein through the use of the Targeted Molecular Dynamics (TMD). Finally we were interested in the study of the GPCR:G-protein complex. We performed two studies related to the activation and to the coupling of the macro-complex. We showed that G-protein constrain drastically the GPCR motions. One over-represented motion in the complex that was also retrieved in other crystallized structures of several different GPCRs thus suggested that this motion could be the putative activation motion of a GPCR when complexed to its favorite protein partners.

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind Rezeptoren mit 7 Transmembrandomänen. Nach Bindung ihres Liganden werden über die Kopplung von G-Proteinen rezeptorspezifisch Signaltransduktionswege aktiviert. Ein bislang nicht ausreichend verstandener Prozess für die Funktion von GPCR ist deren Oligomerisierung. Für einige GPCR konnte gezeigt werden, dass die Oligomerisierung den Rezeptortransport und/oder die Dynamik der Rezeptoraktivierung moduliert. Dabei ist noch nicht aufgeklärt, ob die entsprechenden GPCR ausschließlich als Oligomere oder in einem bestimmten Monomer-Dimer Verhältnis (M/D) vorliegen und welcher Dynamik dieses Verhältnis unterliegt. In dieser Arbeit wurde die Homo-Oligomerisierung des Endothelin-B-Rezeptors (ETBR), des Vasopressin-V2-Rezeptors (V2R) und der Corticotropin-Releasing-Factor-Rezeptoren Typ 1 (CRF1R) und Typ 2(a) (CRF2(a)R) analysiert. Im Anschluss an diese Untersuchungen wurde das M/D der GPCR bestimmt. Zur Detektion der Protein-Protein Interaktionen wurden die biophysikalischen Methoden Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) und Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS) eingesetzt. Mit Hilfe der FCCS konnte das spezifische M/D der GPCR bestimmt und über FRET ein Unterschied in der Interaktions-Dynamik zwischen den GPCR der Familie 1 (am Bsp. des V2R) und der Familie 2 (am Bsp. des CRF1R) ermittelt werden. Des Weiteren lieferten die genutzten Methoden den Nachweis, dass der zum CRF1R homologe CRF2(a)R ausschließlich als Monomer vorliegt. Zusätzliche Untersuchungen an Signalpeptidmutanten des CRF1R und des CRF2(a)R weisen darauf hin, dass das Pseudosignalpeptid des CRF2(a)R, welches bislang einzigartig in der Superfamilie der GPCR ist, die Oligomerisierung des Rezeptors verhindert. Zusätzlich zu diesen neuen Daten konnte in dieser Arbeit erstmals ein Zusammenhang zwischen Rezeptorinteraktion und G-Protein Selektivität für den CRF1R und den CRF2(a)R festgestellt werden / The heptahelical G protein-coupled receptors (GPCRs) are important drug targets. Following activation by their ligands, they exert their function via the binding of G proteins and activation of specific signal transduction cascades. To date, the functional significance of the oligomerization of GPCRs is not completely understood. For some GPCRs it could be shown that the oligomerization modulates receptor transport and/or the dynamics of receptor activation. Most importantly, it is not clear whether the GPCRs exist exclusively as oligomers or in a certain monomer-dimer ratio (M/D) or whether a given ratio is dynamic. In this work, the homo-oligomerization of the endothelin-B-receptor (ETBR), the vasopressin-V2-receptor (V2R) and the corticotropin-releasing-factor-receptors type 1 (CRF1R) and type 2(a) (CRF2(a)R) was analysed. In addition, the M/D of these GPCRs was determined. For the detection of the protein-protein interactions, the following biophysical methods were established: fluorescence-resonance-energy-transfer (FRET) and fluorescence-crosscorrelation-spectroscopy (FCCS). With the help of FCCS, a specific M/D could be determined for each of the GPCRs. Using FRET, differences in the interaction dynamics between family 1 (V2R) and family 2 GPCRs (CRF1R) could be described. Moreover, it was experimentally verified that the CRF2(a)R is exclusively expressed as a monomer, in contrast to the other GPCRs and even the highly homologous CRF1R. Using signal peptide swap experiments, it could be demonstrated that the N-terminal pseudo signal peptide of the CRF2(a)R, which is so far unique in the superfamily of GPCRs, prevents oligomerization of the receptor. In addition, a relation of receptor oligomerization and G protein coupling selectivity was established for the CRF1R and the CRF2(a)R which is novel for the GPCR protein family.

Der G Protein-gekoppelte Rezeptor 30 (GPR30) wurde vornehmlich im Kontext von schnellen Östrogeneffekten auf zelluläre Signaltransduktionskaskaden untersucht und stellt möglicherweise einen neuen Östrogenrezeptor dar. Die physiologische Funktion von GPR30 in vivo konnte jedoch bisher nicht ermittelt werden. Daher wurde in dieser Arbeit ein Gpr30-defizientes Mausmodell charakterisiert, bei dem ein Teil der kodierenden Sequenz durch einen LacZ-Reporter ersetzt wurde (Gpr30-lacZ). Die Integration des Konstruktes in den Gpr30-Locus wurde mittels Southern blotting und Real-time PCR verifiziert. Gpr30-positive Zelltypen wurden durch Kolokalisation von LacZ mit zelltyp-spezifischen Markerproteinen identifiziert. Weitere Versuche dienten der Aufklärung des Phänotyps von Gpr30-lacZ Mäusen. Zur Identifizierung von Proteinen des GPR30-Signalkomplexes wurden Yeast-Two-Hybrid Analysen mit der N- bzw. C-terminalen Domäne des Rezeptors durchgeführt. Die wesentlichen LacZ-positiven Zellpopulationen waren (i) Endothelzellen in kleinen arteriellen Gefäßen, (ii) glatte Muskelzellen, Perizyten und neuronale Subpopulationen im Gehirn, (iii) Hauptzellen in der Magenschleimhaut, (iv) Zellpopulationen in der Adenohypophyse und dem Hypophysenzwischenlappen sowie (vi) chromaffine Zellen im Nebennierenmark. Während der Phenotypisierung des Mausmodells wurde eine Reduktion der CD62L+ T-Zellen von ca. 50% im peripheren Blut festgestellt. Mittels Yeast Two-Hybrid Analyse wurden Pals1-associated tight junction protein (PATJ) und FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2) als mögliche Interaktionspartner identifiziert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine zelluläre Basis für die Funktion von Gpr30 in vivo ermittelt. Der Phänotyp in Gpr30-lacZ Mäusen ist wahrscheinlich durch eine verringerte Produktion von naiven T-Zellen im Thymus bedingt. PATJ bindet die C-terminalen Aminosäuren von GPR30 mit einer PDZ-Domäne und könnte ein Gerüst-protein des GPR30-Signal¬komplexes darstellen. / The orphan G protein coupled receptor 30 (GPR30) was predominantly analyzed in the context of membrane-initiated estrogen signaling suggesting that GPR30 represents a novel estrogen receptor. However, the physiological function of GPR30 in vivo remained unknown. To unravel the physiological role of murine Gpr30 in vivo, a Gpr30-deficient mouse model was analyzed that harbors a LacZ reporter (Gpr30-lacZ) within the Gpr30 locus. The targeting of Gpr30 was verified by Southern blotting and real-time PCR. Gpr30-expressing cell types were identified by colocalization of LacZ along with cell type-specific markers. Further experiments aimed to decipher the phenotype of Gpr30-lacZ mice. To gain information about the signaling complex of human GPR30, yeast two-hybrid screenings were performed with the N- and C-terminal domains as bait. The main LacZ-positive cell populations were (i) endothelial cells in small arterial vessels of various tissues, (ii) smooth muscle cells, pericytes, and neuronal subpopulations in the brain, (iii) gastric chief cells in the stomach, (iv) cells in the intermediate and anterior pituitary, and (v) chromaffin cells in the adrenal glands. Extensive phenotype screening at the German Mouse Clinic revealed reduced numbers of T cells in the peripheral blood of Gpr30-lacZ mice. Especially the proportion of CD62L+ cells was decreased by approx. 50%. Yeast two-hybrid screening led to the identification of Pals1-associated tight junction protein (PATJ) and FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2). In conclusion, this study provides a cellular basis for the function of Gpr30 in vivo. Since CD62L+ cells represent the naive T cell compartment, the phenotype of Gpr30-lacZ mice suggests an impaired production of T cells in the thymus. PATJ likely binds the C-terminus of GPR30 with one of its PDZ domains and may represent a scaffolding protein of the GPR30 signaling complex.

Das fibrillen-bildende beta2-Mikroglobulin (b2M) und das CRF1-Mimetikum mit verzweigter Rückgratstruktur können als „schwierige“ Proteine betrachtet werden, deren Darstellung sich eignet, gegenwärtige Möglichkeiten und Grenzen der Proteinsynthese zu ermitteln. Die Proteine sollen zu spektroskopischen Untersuchungen von Proteinfaltung bzw. Ligand-Rezeptor- Wechselwirkungen eingesetzt werden. Versuche zur Chemosynthese von b2M über drei Segmente führten per NCL zwar zu linearen Produkten mit korrekter Primärstruktur, aber wiederholt wurden zwei, mittels HPLC trennbare Proteine erhalten, deren enzymatische Spaltung zu identischen Fragmenten führte. Eine Isomerisierung (wie z.B. Epimerisierung) als Ursache für die Bildung der zwei Produkte konnte ausgeschlossen werden. Mittels CD- und FTIR-Spektroskopie wurden für beide Produkte beta- Faltblatt-Strukturen ermittelt, die sich sowohl untereinander als auch vom rekombinanten Protein unterschieden. Die „fehlgefalteten“ Syntheseprodukte konnten nicht entfaltet und anschließend in die „korrekte“ Struktur des rekombinanten b2M überführt werden. Es ist denkbar, dass die beobachtete „Fehlfaltung“, deren Ursache nicht geklärt werden konnte, für vom b2M ausgelöste Amyloidosen verantwortlich ist. Das CRF1-Modell, das aus drei zyklischen Peptiden und einem Protein mit Disulfidbrücken besteht, welche auf einem linearen Peptid-Templat verankert sind, wurde durch ein zyklisches Templat zur strukturellen Einschränkung modifiziert. Durch das zyklische Templat ergaben sich keine Syntheseprobleme, aber interessanterweise führte die Zyklisierung des Templats zu einer signifikant höheren Affinität für den Agonisten Urocortin-I im funktionellen Assay. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein zyklisches Rezeptor-Loop-Peptid mittels EPL im mg-Maßstab erhalten werden kann, was künftig die Synthese isotopenmarkierter Analoga für Struktur-Untersuchungen ermöglicht. / The fibril forming beta2-microglobulin (b2m) and the CRF1 mimic with branched peptide backbone could be considered as “difficult” proteins, whose synthesis is suited for determining present possibilities and limits of protein synthesis. The proteins shall be used for spectroscopic analysis of protein misfolding or ligand-receptor-interaction, respectively. Efforts of the chemosynthesis of b2m over three segments may lead via NCL to linear products with correct primary structure, but two, via HPLC isolatable proteins were repetitively susbstained, whose enzymatic digest lead to identical fragments. An isomerization (such as e. g. epimerization) as reason for the formation of the two products could be excluded. By means of CD and FTIR spectroscopy for both products beta-sheet structure were determined, which differ among themselves as well as from the recombinant protein. The “misfolded” synthetic product could not be unfolded und subsequently converted into the “correct” structure of the recombinant b2m. It is possible that the observed “misfolding”, whose cause could not be clarified, is reasonable for the amyloidosis induced by b2m. The CRF1 model that consists of three cyclic peptides and one protein with disulfid bridges coupled to a linear peptide template, was modified for structural constraints by a cyclic template. In consequence of the cyclic template no synthetic problems aroused, although the cyclisation of the template leads interestingly to a significant higher affinity for the antagonist urocortin-I in the functional assay. Furthermore, it was shown that a cyclic receptor loop peptide could be received via EPL in mg scale, what in future enables the synthesis of isotopically labeled analogs for structure investigations.

In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen für die Agonistspezifität des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34 untersucht. Mittels verschiedener funktioneller Versuche konnte an ausgewählten Orthologen des Rezeptors gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu publizierten Daten, Lysophosphatidylserin (Lyso-PS) nicht der natürliche Agonist des GPR34 ist. Lediglich an einigen cyprinoiden Subtypen des GPR34 hat Lyso-PS surrogat-agonistische Effekte. Anhand eines detaillierten evolutionären Vergleichs von Orthologen konnten Bereiche des Rezeptors ermittelt werden, welche an der Ligandenbindung, und damit an der Agonistspezifität des GPR34 beteiligt sind. Durch Übertragung dieser Bereiche vom Karpfen-GPR34-Subtyp 2a auf den humanen GPR34 konnte dieser zu einem Lyso-PS-sensitiven Rezeptor modelliert werden. Weiterhin wurde Aminoethyl-Carbamoyl-ATP (EDA-ATP) als inverser Agonist an cyprinoiden Orthologen des GPR34 identifiziert. Die Erweiterung des möglichen Ligandenspektrums von Lipiden zu Nukleotidderivaten gibt Hinweise auf die Promiskuität der Bindungsstelle des GPR34. Die Ergebnisse zeigen, dass Lyso-PS nur eine zufällige Aktivität an einigen Orthologen des GPR34 hat. Mit Identifizierung eines Nichtlipides als invers-agonistischen Liganden ist die Suche nach dem natürlichen Liganden des GPR34 noch nicht abgeschlossen und sollte auf weitere chemische Entitäten ausgeweitet werden. / Lyso-PS (lyso-phosphatidylserine) has been shown to activate the G(i/o)-protein-coupled receptor GPR34. Since in vitro and in vivo studies provided controversial results in assigning lyso-PS as the endogenous agonist for GPR34, we investigated the evolutionary conservation of agonist specificity in more detail. Except for some fish GPR34 subtypes, lyso-PS has no or very weak agonistic activity at most vertebrate GPR34 orthologues investigated. Using chimaeras we identified single positions in the second extracellular loop and the transmembrane helix 5 of carp subtype 2a that, if transferred to the human orthologue, enabled lyso-PS to activate the human GPR34. Significant improvement of agonist efficacy by changing only a few positions strongly argues against the hypothesis that nature optimized GPR34 as the receptor for lyso-PS. Phylogenetic analysis revealed several positions in some fish GPR34 orthologues which are under positive selection. These structural changes may indicate functional specification of these orthologues which can explain the species- and subtype-specific pharmacology of lyso-PS. Furthermore, we identified aminoethyl-carbamoyl ATP as an antagonist of carp GPR34, indicating ligand promiscuity with non-lipid compounds. The results of the present study suggest that lyso-PS has only a random agonistic activity at some GPR34 orthologues and the search for the endogenous agonist should consider additional chemical entities.