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Intracellular trafficking of protease : Activated Receptor 2 (PAR2) by members of sorting nexins familyKasakov, Velichko M. 06 1900 (has links)
Le dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau.
Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus.
Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes.
Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2.
"Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2.
Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2.
En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire.
Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire. / During the recent years the existing statements that G – protein coupled receptors (GPCRs) are relaying signals only from the plasma membrane have been challenged. It has become clear that some GPCRs can also signal from intracellular compartments and the nucleus. The role and the function of these nuclear GPCRs are subject of intensive investigations.
Protease - activated receptors (PAR) are members of the GPCR family. PARs are activated by the cleavage of the N – terminus of the receptor followed by binding of the tethered ligand on to the receptor. Four PARs have been described: PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4. PAR2 can induce mitogenic effects and participate in processes such as angiogenesis and inflammation. While many of the intracellular effects of PAR2 can be explained with its plasma membrane signalling pathway, intracrine effects of PAR2 have also been proposed. However the mechanisms by which PAR2 can induce its target gene expressions are still unknown.
The purpose of our study was to investigate whether a distinct nuclear population of PAR2 exists. We hypothesized that the roles of PAR2 at different cellular compartments are different since signalling pathways depend on subcellular context. Using confocal microscopy and Western blot techniques we were able to demonstrate the presence of a nuclear population of PAR2. Upon stimulation of the cell membrane PAR2, we observed significant translocation of the receptor from the plasma membrane to the nucleus. Using RT – PCR technique we detected diverse roles of cell surface and nuclear PAR2 on triggered gene expression.
In the current study we have attempted to reveal the mechanisms responsible for PAR2 nuclear translocation. We tested the hypothesis that members of the Sorting Nexin (SNX) family are involved in PAR2 nuclear translocation.
Sorting Nexins are a new, large group of proteins with well established cargo functions. SNX1 and SNX2 have been demonstrated to be responsible for lysosomal sorting of PAR1. SNX11 has not been studied yet, and we hypothesized that it may be another SNX involved in PAR2 signalling.
We developed stable knockdowns for SNX1, SNX2 and SNX11 in HEK293 cells. Using immunofluorescence, Western Blot analysis and FACS assays, we determined that all three members of SNX group are interaction partners of PAR2. However only SNX11 co-localized with its partner in the nucleus and is responsible for its nuclear translocation. RT – PCR experiments on SNXs knockdowns cell lines demonstrated that PAR2 nucleus function is mostly dependent on SNX11; nevertheless SNX1 and SNX2 knockdowns can also attenuate it, suggesting that they are part of PAR2 signalling network.
In conclusion, PAR2 is being translocated from the plasma membrane to the nuclear membrane after its stimulation with SLIGKV. PAR2 nucleus translocation triggers intracellular effects different from its cell membrane signalling. SNX11 is the major factor responsible for PAR2 nuclear sorting.
Keywords: G – protein coupled receptors, Sorting Nexins, Protease - activated receptors, nuclear translocation, nuclear membrane, nuclear signalling
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Conception et synthèse de sondes fluorescentes et d'agonistes des récepteurs de la vasopressine et de l'ocytocine : application mécanistique et thérapeutique / Design, synthesis and pharmacological evaluation of fluorescent probes and non-peptide agonists for oxytocin and vasopressin receptors : therapeutic and mechanistic applicationsPflimlin, Elsa 31 October 2013 (has links)
Les récepteurs couplés aux protéines G constituent la plus grande famille de protéines membranaires et interviennent dans de nombreux processus physiologiques. La compréhension de l’interaction ligand-récepteur d’un point de vue mécanistique mais également thérapeutique est cruciale. Appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs de la vasopressine et de l’ocytocine ont été choisis comme modèle d’étude. Ces hormones jouent un rôle important dans la modulation de l’attachement et de l’affect chez les mammifères. Afin d’accélérer la découverte de ligands ocytocinergiques et d’explorer les mécanismes fondamentaux de leurs interactions, nous avons conçu les premiers ligands fluorescents non peptidiques des récepteurs de la vasopressine V1a et de l’ocytocine. Ces ligands ont été utilisés pour développer des tests de liaisons par TR-FRET et démontrer la dimérisation des récepteurs de la vasopressine V1a et V2 sur cellules. Des études autour de petites plates-formes dérivées d’aza-dicétopipérazine ont permis d’accéder à un nouvel antagoniste non peptidique du récepteur de l’ocytocine. L’optimisation de dérivés benzodiazépines ocytocinergiques par des études de relations structure-activité a permis d’identifier les meilleurs agonistes non peptidiques du récepteur de l’ocytocine à ce jour. Une étude in vivo chez la souris et chez le singe est amorcée pour apporter dans un futur, une solution thérapeutique aux problèmes d’interaction sociale en général et d’autisme en particulier. / G protein coupled receptors are the largest membrane protein family and play an important role in a large number ofphysiological processes. The comprehension of the ligand-receptor interaction from a mechanistic point of view but alsofor therapeutic use is crucial. Belonging to the G protein coupled receptors, the oxytocin and vasopressin receptors havebeen used as a model system. These two hormones play an important role in the modulation of attachment and affectin mammals. To accelerate the discovery of new ligands for oxytocin and vasopressin receptors and to explore thefundamental role of their interactions, we designed the first non-peptide fluorescent ligands for oxytocin and vasopressin V1a receptors. These ligands have been used to develop new binding tests based on TR-FRET technology and to prove the V1a and V2 receptor dimerisation. In parallel, we developed a new non-peptide oxytocin antagonist around an aza-diketopiperazine platform. . Optimization of benzodiazepine derivatives enables us to identify the best non peptideoxytocin agonists to date. In vivo studies in mice and monkeys are initiated to bring in the future a therapeuticsolution to social interaction problems in general and autism in particular
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Neuronal polarization shapes the targeting and signaling of G-protein coupled receptors (GPCRs) : type-1 cannabinoid receptors and 5-HT1B serotonin receptors show highly contrasted trafficking and signaling patterns in axons and dendrites / La polarisation neuronale façonne l’adressage et la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) : le récepteur canabinoïque de type 1 et le récepteur sérotoninergique 5-HT1B ont un trafic et une signalisation différents dans les axones et les dendritesLadarré, Delphine 03 October 2014 (has links)
L’architecture polarisée des neurones est mise en place est maintenue grâce à un adressage hautement contrôlé de protéines vers l’axone ou vers le compartiment somatodendritique. Parmi ces protéines, les récepteurs aux protéines G (RCPG) neuronaux sont des cibles pharmacologiques clés. Cependant, leur pharmacologie est généralement étudiée dans des lignées cellulaires non polarisées et les résultats obtenus dans ces systèmes ne caractérisent pas correctement les effets physiologiques de l’activation des RCPG présents dans le cerveau. Par conséquent, un des principaux sujets de recherche de notre équipe est de comprendre comment la polarité neuronale influe sur la pharmacologie des RCPG, en étudiant l’un des RCPG les plus abondants dans le cerveau : le récepteur cannabinoïque de type-1 (CB1R). Les études précédentes de notre groupe ont suggéré que CB1R acquiert une polarisation axonale grâce à un adressage transcytotique : après leur synthèse, ces récepteurs apparaissent sur la membrane plasmique somatodendritique d’où ils sont rapidement enlevés par endocytose constitutive puis adressés à la membrane plasmique axonale où ils s’accumulent du fait d’une endocytose réduite. Au début de ma thèse, nous avons directement mesuré cette endocytose différentielle et le transport transcytotique de CB1R en utilisant des neurones de rats mis en culture dans des dispositifs microfluidiques. De plus, nous avons montré que des traitements pharmacologiques prolongés peuvent fortement changer la distribution de RCPG à la surface neuronale. Ces résultats démontrent que l’équilibre endocytotique dépendant du compartiment neuronal, qui est contrôlable pharmacologiquement, est important pour la distribution des RCPG neuronaux. Dans une seconde partie, nous avons étudié si le trafic différentiel de CB1R entre axones et dendrites est corrélé avec une pharmacologie différentielle. CB1R est majoritairement couplé à des protéines de type Gi/o et est connu pour inhiber la production d’AMPc. Nous avons donc développé l’imagerie par Föster Resonance Energy Transfer (FRET) appliqué aux cultures de neurones d’hippocampe de rats afin de mesurer la modulation de la voie de signalisation AMPc/PKA en aval de CB1R endogènes dans l’ensemble des compartiments neuronaux : somata, dendrites, mais aussi dans les axones matures très fins. Nos résultats montrent que CB1R possède une pharmacologie différente entre les dendrites et les axones. Notamment, son activation conduit à une diminution plus forte de l’activité basale de la PKA dans les axones comparé aux dendrites, lié au plus grand nombre de récepteurs présents sur la membrane de ce compartiment. De plus, nous démontrons que, contrairement aux récepteurs axonaux, les CB1R somatodendritiques inhibent constitutivement la voie AMPc/PKA. Cette différence est due à la distribution polarisée de la DAGLipase, l’enzyme synthétisant l’endocannabinoïde principal, le 2-arachidonoyglycerol (2-AG). De plus, l’inhibition pharmacologique de la DAGL modifie l’efficacité de plusieurs agonistes de CB1R dans le compartiment somatodendritique mais pas dans l’axone. Cet effet pourrait être dû à une modulation allostérique. Dans une troisième partie, nous avons étudié si les résultats ci-dessus peuvent être généralisés à d’autres RCPG. Etant donné que l’adressage axonal et la pharmacologie in vitro des récepteurs sérotoninergiques 5-HT1B montrent de fortes similitudes avec ceux de CB1R, nous avons étudié la pharmacologie de ces récepteurs en utilisant la technique de FRET développée précédemment. De façon similaire, nous avons trouvé une pharmacologie différentielle entre l’axone et les dendrites. / Polarized neuronal architecture is achieved and maintained mainly through highly controlled targeting of proteins to axons versus to the somatodendritic compartment. Among these proteins, neuronal G protein coupled receptors (GPCRs) are key therapeutic targets. However, their pharmacology is generally studied in non-polarized cell lines, and results obtained in such systems likely do not fully characterize the physiological effects of brain GPCR activation. Therefore, a main research subject of our group is to understand how neuronal polarity influences GPCR pharmacology, by studying one of the most abundant GPCR in the brain: the type-1 cannabinoid receptor (CB1R). Previous studies of the group suggested that CB1Rs achieve axonal polarization through transcytotic targeting: after their synthesis, these receptors appear on the somatodendritic plasma membrane from where they are removed rapidly by constitutive endocytosis and then targeted to the axonal plasma membrane where they accumulate due to relatively reduced endocytosis rate. At the beginning of my PhD project we directly demonstrated this differential endocytosis and transcytotic transport of CB1Rs by using cultured neurons in microfluidic devices. Moreover, we showed that chronic pharmacological treatments may strongly change neuronal GPCR distribution on the neuronal surface. These results demonstrate that subdomain-dependent steady-state endocytosis, which is pharmacologically controllable, is important for GPCR distribution in neurons. In a second part, we asked if differential traffic of CB1Rs between axons and dendrites is correlated with differential pharmacology. CB1R is predominantly coupled to Gi/o proteins and is known to inhibit cAMP production. Thus, we developed live Föster Resonance Energy Transfer (FRET) imaging in cultured hippocampal neurons in order to measure basal cAMP/PKA pathway modulation downstream of endogenous CB1Rs in all neuronal compartments: in somata, in dendrites but also in the very thin mature axons. Our results show that CB1R displays differential pharmacology between axon and dendrites. Notably, its activation leads to a stronger decrease of PKA activity in axons compared to dendrites, due to increased number of membrane receptors in this compartment. Moreover, we demonstrate that somatodendritic CB1Rs constitutively inhibit cAMP/PKA pathway, while axonal receptors do not. This difference is due to polarized distribution of DAGLipase, the enzyme that synthesizes the major endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG). Moreover, blocking DAGL by pharmacological treatment modifies somatodendritic, but not axonal effects of several CB1R agonists, possibly through allosteric action. In a third part, we asked if the above results may be generalized to other GPCRs. Because the axonal targeting and in vitro pharmacology of 5-HT1B serotonin receptors demonstrate strong similarities with CB1Rs, we studied their neuronal pharmacology by using the previously developed FRET technique. We found similar differential responses to pharmacological treatments between axon and dendrites. In a fourth part, we investigated the role of the threonine 210 (T210) residue in the constitutive activity of neuronal CB1R. We showed that the hypoactive mutant T210A-CB1R do not constitutively recruit signaling pathways even in somatodendritic compartment, where 2-AG is present. This result demonstrates that T210 is necessary for constitutive CB1R activation by 2-AG.Finally, previous results of our group demonstrated the involvement of CB1R in neuronal development. Notably, CB1R activation was shown to have an overall inhibitory effect on the development of polarized neuronal morphology. We established a bibliographic review on this subject. The published literature data suggest that not only neuronal polarization influences both CB1R traffic and pharmacology but CB1Rs also contribute to the achievement of neuronal polarization. (...)
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Intracellular trafficking of protease : Activated Receptor 2 (PAR2) by members of sorting nexins familyKasakov, Velichko M. 06 1900 (has links)
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Rôle des récepteurs aux protéines G (GPR55, GPR91 et GPR99) dans la croissance et le guidage axonal au cours du développement du système visuelCherif, Hosni 09 1900 (has links)
No description available.
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Implication des récepteurs de la mélatonine dans les troubles neurologiques et le diabète de type 2 et identification de régions clés du récepteur MT1 responsables de sa sélectivité fonctionnelle / Involvement of Melatonin Receptors in Neurological Disorders and Type 2 Diabetes and Identification of Key Regions Mediating MT1 Functional SelectivityHegron, Alan 12 December 2018 (has links)
La mélatonine est une neurohormone produite principalement par la glande pinéale de manière circadienne et agissant par l’activation de deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) appelés MT1 et MT2. La mélatonine régule de nombreuses fonctions physiologiques importantes. La régulation des niveaux de dopamine (DA) et de glucose en font partie mais nous ne savons pas clairement comment la mélatonine les régule.Les niveaux de DA extracellulaire sont principalement régulés par son transporteur (DAT) responsable de sa recapture dans les neurones présynaptiques afin de prévenir d’une hyperactivation des récepteurs dopaminergiques. Par conséquent, nous avons vérifié le rôle de DAT dans la régulation du système dopaminergique par le système mélatoninergique. Nous avons montré qu’en interagissant avec la forme immature non-glycosylée de DAT, MT1 et MT2 le retiennent dans le réticulum endoplasmique régulant ainsi son expression à la surface cellulaire et donc la recapture de la DA. De la même manière, les souris déficientes en MT1 ou MT2 ont montré une augmentation de la recapture de la DA dans les synaptosomes de striatum et une baisse de l’hypermotilité induite par l’amphétamine. Dans ce projet nous avons ainsi révélé un nouveau lien entre les systèmes mélatoninergiques et dopaminergiques basé sur la formation de complexes moléculaires entre les récepteurs de la mélatonine et DAT.Afin de mieux comprendre le rôle de la mélatonine dans la régulation des niveaux de glucose, nous avons ensuite étudié l’implication de variants génétiques de MT2 dans le développement du diabète de type 2 (DT2). Des études antérieures avaient montré que des variants naturels défectueux fonctionnellement étaient associés à un risque de développer le DT2. Afin de déterminer plus précisément les propriétés défectueuses en lien avec le DT2, nous avons mesuré l’activation spontanée et celle induite par la mélatonine de 40 variants MT2. Nous avons ainsi montré que des défauts d’activation des protéines Gαi et Gαz induite par la mélatonine et de recrutement spontané de la βarrestine-2 sont significativement reliés à un risque de développer le DT2. Les résultats expérimentaux corrélaient avec les prédictions de l’analyse sur le score d’évolution. Ce travail permettra de nouvelles avancées dans la recherche de traitements personnalisés pour les personnes portants les mutations sur MT2 afin qu’il retrouve une réponse non défectueuse.Le séquençage de 9393 personnes a permis l’identification de 32 variants naturels MT1. Le récepteur MT1 sauvage et les variants ont ainsi été caractérisés grâce aux techniques de transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET). Nous avons montré que MT1 active les protéines Gαi/o, Gα12 et Gα15 et recrute la βarrestine-2. L’analyse des résultats par factorisation matricielle non linéaire a révélé l’existence de 5 clusters caractérisés par différents profils de signalisation. La modélisation 3D par homologie de MT1 a permis de déterminer l’impact de chaque variant sur l’activation du récepteur et ses interactions avec les protéines G et la βarrestine-2. Ce projet a ainsi permis de démontrer que des variants naturels sont très intéressant afin de comprendre les mécanismes d’action des RCPGs. En résumé, ce travail contribue à la compréhension des fonctions des récepteurs à la mélatonine et souligne leur importance dans la régulation du système dopaminergique et de l’homéostasie glucidique. Nos résultats offrent de nouvelles perspectives dans la recherche de nouveaux traitements personnalisés pour les patients souffrant d’un dérèglement du système dopaminergique ou de DT2. / Melatonin is a neurohormone mainly released from the pineal gland in a circadian manner acting through two G protein-coupled receptors (GPCRs) called MT1 and MT2. Melatonin regulates many important physiological functions. Regulation of dopamine (DA) and glucose levels are two of them but how they do this is not clear.Extracellular DA levels are mainly regulated by its transporter (DAT) which mediates DA re-uptake into presynaptic nerve termini to prevent DA receptor hyperactivation in the presynaptic cleft. Consequently, we verified the role of DAT in the regulation of the DA system by melatonin. We showed that MT1 and MT2, by interacting with the immature non-glycosylated form of DAT retain DAT in the endoplasmic reticulum thus regulating DAT cell surface expression and DA reuptake. Consistently, mice with targeted deletion of MT1 and MT2 show markedly enhanced DA uptake in striatal synaptosomes and decreased amphetamine-induced locomotor activity. Collectively, we revealed here a molecular link between the melatonin and DA systems, which is based on the formation of a molecular complex between melatonin receptors and DAT.To better understand the role of melatonin on the regulation of glucose levels, we studied the involvement of genetic variants of MT2 in the development of type 2 diabetes (T2D). Previous studies showed that natural loss-of-function variants of MT2 associate with T2D risk. To determine more precisely the defective properties linked to T2D risk we monitored spontaneous and melatonin-induced activation of different signaling pathways by 40 MT2 variants. We show that defects in melatonin-induced Gαi and Gαz activation and spontaneous βarrestin-2 recruitment are most significantly associated to T2D risk. Experimental results correlated well with those predicted by evolutionary lineage analysis. This work will help to propose personalized treatments for MT2 variant carriers to recover their defective responses.Sequencing of 9393 individuals resulted in the identification of 32 natural MT1 variants. MT1 wild-type and variants were functionally characterized in bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays. We showed that MT1 activates Gαi/o, Gα12 and Gα15 proteins and recruits βarrestin-2. Analyzes of results by non-linear matrix factorization revealed the existence of 5 clusters characterized by different signaling profiles. Computational homology modeling of the 3D model of MT1 helped to determine the impact of each variant on receptor activation and interaction with G proteins and βarrestin-2. Collectively, our data illustrate that natural variants are powerful tools to understand the molecular basis of GPCR function. Overall, this work contributes to our understanding of the function of melatonin receptors and highlights their importance in the regulation of the DA system and glucose homeostasis. Our results will open new, personalized therapeutic options for patient suffering from a defective DA system or T2D.
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Applications of X-ray Hydroxyl Radical Protein FootprintingAsuru, Awuri P. January 2019 (has links)
No description available.
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New Structural Perspectives in G Protein-Coupled Receptor-Mediated Src Family Kinase ActivationBerndt, Sandra, Liebscher, Ines 03 January 2024 (has links)
Src family kinases (SFKs) are key regulators of cell proliferation, differentiation, and
survival. The expression of these non-receptor tyrosine kinases is strongly correlated with cancer
development and tumor progression. Thus, this family of proteins serves as an attractive drug target.
The activation of SFKs can occur via multiple signaling pathways, yet many of them are poorly
understood. Here, we summarize the current knowledge on G protein-coupled receptor (GPCR)-
mediated regulation of SFKs, which is of considerable interest because GPCRs are among the most
widely used pharmaceutical targets. This type of activation can occur through a direct interaction
between the two proteins or be allosterically regulated by arrestins and G proteins. We postulate
that a rearrangement of binding motifs within the active conformation of arrestin-3 mediates Src
regulation by comparison of available crystal structures. Therefore, we hypothesize a potentially
different activation mechanism compared to arrestin-2. Furthermore, we discuss the probable direct
regulation of SFK by GPCRs and investigate the intracellular domains of exemplary GPCRs with
conserved polyproline binding motifs that might serve as scaffolding domains to allow such a direct
interaction. Large intracellular domains in GPCRs are often understudied and, in general, not much
is known of their contribution to different signaling pathways. The suggested direct interaction
between a GPCR and a SFK could allow for a potential immediate allosteric regulation of SFKs
by GPCRs and thereby unravel a novel mechanism of SFK signaling. This overview will help to
identify new GPCR–SFK interactions, which could serve to explain biological functions or be used to
modulate downstream effectors.
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Assemblage oligomérique des récepteurs couplés aux protéines G avec les RAMPsHéroux, Madeleine 03 1900 (has links)
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude.
Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3).
Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1.
En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation. / G protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors involved in signal transduction. Traditionally, signal transduction by GPCRs involves the activation of a hetero-trimeric G protein which will then modulate the activity of several intracellular effectors. We can now appreciate the fact that in addition to their interaction with G proteins, GPCRs also associate with several other proteins, in order to allow proper signal transduction. In particular, the discovery of a family of proteins called receptor activity-modifying proteins (RAMPs) has challenged the traditional views of signal transduction by some GPCRs. In the case of the calcitonin-like receptor (CLR), the association with RAMPs allows the proper cell surface targeting of the receptor in addition to modulate it’s pharmacological properties. Co-expression of CLR with RAMP1 leads to a calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptor, whereas CLR association with RAMP2 or RAMP3 promotes the formation of an adrenomedullin receptor. In addition to their interaction with transmembrane accessory proteins such as RAMPs, GPCRs can also interact with other receptors to form receptors oligomers. In this thesis, we were interested in the interactions between GPCRs and RAMPs, and particularly, in the link between these GPCR/RAMP interactions and the assembly of receptor oligomers, using CGRP1 receptor as a model.
We first confirmed the interaction between CLR and RAMP1 in living cells. We showed that this CLR/RAMP1 complex activates G proteins and recruits the signalling protein -arrestin upon CGRP stimulation. Next, we demonstrated that even if the CLR requires hetero-oligomeric assembly with RAMPs in order to be active, this receptor can still interact with other GPCRs. In addition to CLR homo-oligomers, we observed that RAMPs can also self-associate to form oligomeric complexes which can involve different subtypes (RAMP1/RAMP2 and RAMP1/RAMP3).
This observation of the presence of CLR and RAMP1 homo-oligomers raised the question of the stoiechiometry of interaction of the CLR/RAMP1 complex. In order to establish the molecular composition of the CGRP1 receptor in vivo, we developed a novel approach allowing the detection of the interaction between three proteins in living cells. This method called BRET/BiFC is based on the bioluminescence resonance energy transfer between a luminescent energy donor, Renilla luciferase, and a fluorescent energy acceptor, the yellow fluorescent protein (YFP), reconstituted after the re-association of its two fragments. Using this approach, we showed that the CGRP1 receptor consist of a homo-oligomer of CLR interacting with a monomer of RAMP1.
By demonstrating the asymmetrical organization of the CGRP1 receptor complex using a novel biophysical approach, we believe that the results presented herein have contributed to increase our knowledge of the mechanisms of function of the large family of GPCRs and will be useful for the pursuit of research on protein complexes involved in signalling pathways.
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Conséquences fonctionnelles de mutations affectant le récepteur de la vasopressine de type 2 et implications thérapeutiquesCarpentier, Eric 06 1900 (has links)
Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique
insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies.
Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption
d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus,
l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent
aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le
mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques
‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations.
Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S
par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP.
Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD
tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants
est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la
hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une
désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD.
Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins. / The vasopressin type 2 receptor (V2R) plays an important role in water homeostasis. Mainly expressed in the collecting ducts of the kidney, V2R activation by the antidiuretic hormone arginine-vasopressin (AVP) leads to water reabsorption, resulting in a decrease urine output. More than 200 mutations in the V2R gene have been link to the aetiology of the congenital form of nephrogenic diabetes insipidus (cNDI), resulting from a receptor loss-of-function. In contrast, three recently identified mutations have been shown to cause a gain-of-function of the V2R leading to the nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis (NSIAD). The work presented herein is focussed on a better understanding of the molecular determinants leading to the loss- or gain -of-function of V2R mutants. More than 50% of missense mutations affecting the V2R were shown to hamper the receptor’s ability to adopt its native conformation and to cause its intracellular retention by the endoplasmic reticulum quality control system. We thus looked at the role of N-glycosylation and calnexin (Cnx) in the maturation process of mutant V2R, and their importance for receptor rescue by pharmacological chaperones (PC). Our results have shown that N-glycosylation is required for Cnx binding to the receptors and that the duration of this interaction is correlated to the severity of the misfolded state of the mutant. The importance of N-glycosylation and to sugar-mediated interactions in the maturation process of a given V2R mutant was found to be an intrinsic property, as it had no significant repercussion on the mild phenotype-associated Y128S mutant, while it completely abolished maturation of the W164S mutant, associated with a severe phenotype. Moreover, we have shown that pharmacological chaperoning can occur at different steps during the maturation process, according to the mutant studied. These mutant-specific differences indicate that the biosynthetic processing of mutant V2R is highly influenced by the nature of the mutation itself and could partially explain the variations in the clinical outcome severity among NDI-causing mutant V2Rs.
Although a functionality rescue of W164S and Y128S mutants was obtained upon exposure to PC, it is not the case for all V2R mutants with a maturation defect. The V88M-V2R was found affected both in its maturation and its affinity toward AVP. In this case, and despite a significant increase in maturation and cell surface expression, the PC treatment led to a further loss in the receptor’s affinity for AVP, preventing its activation at physiological AVP concentrations.
The R137C and R137L mutants are endowed with a high constitutive activity leading to NSIAD. Stunningly, substitution of this arginine by histidine (R137H) was associated with cNDI. These three mutant V2R were found to share many characteristics, of which a compromised maturation and elevated spontaneous desensitization. The only difference between these mutants relies on their constitutive activity levels. The PC used in our studies is also an inverse agonist, but failed to reduce the constitutive activity of the R137C/L mutants, entailing a ‘locked’ active conformation. Instead, the chaperoning property of the compound led to an increase in the number of constitutively active receptor at the cell surface. We have thus proposed the use of AVP as a treatment, as it was shown to cause receptor’s endocytosis without promoting their activation, leading to a reduced active receptor number at the cell surface.
We have identified a new gain-of-function mutation affecting the V2R, the first not involving arginine 137. The F229V substitution was shown to confer high constitutive activity to the receptor, but unlike the two other NSIAD-causing mutants, it does not undergo elevated spontaneous desensitization. The observation that inverse agonists are efficient at inhibiting the constitutive activity of the F229V mutant is an important discovery since the unfruitful attempts obtained with the other constitutively active mutants led some investigators to the erroneous conclusion that inverse agonists were not useful for the treatment of NSIAD.
Taken together, these findings underline the ‘individuality’ of V2R mutants and the importance of their functional characterization in order to bring personalized therapeutic strategies for patients with cNDI or NSIAD, and to develop new therapeutics adapted to the patients’ needs.
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