A sinalização muscarínica exerce função modulatória sobre diferentes aspectos da cognição e emoções. Todos os cinco subtipos de receptores muscarínicos (mAChR), M1 a M5, são expressos no hipocampo de mamíferos e são ativados de forma sobreposta pela maioria dos fármacos, dificultando avanços significativos na compreensão da contribuição de cada componente desse sistema. A toxina muscarínica 3 (MT3) é um antagonista seletivo para o subtipo M4, permitindo a investigação das ações modulatórias deste receptor no aprendizado, memória e plasticidade sináptica. Os M4 são receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que atuam via Gi/o desencadeando efeitos inibitórios sobre as células em que estão presentes. Estudos comportamentais anteriores indicam que a administração de MT3 imediatamente após o treino em uma tarefa aversiva produz efeito amnéstico, enquanto que a administração antes da evocação, causa facilitação. Uma explicação para estes resultados é que os circuitos locais envolvidos na consolidação e na evocação da memória diferem em sua natureza. Nesse contexto, sugere-se que o efeito amnéstico da MT3 sobre a consolidação seja consequência da supressão da inibição de interneurônios GABAérgicos; enquanto que na evocação, esse efeito se daria sobre as sinapses glutamatérgicas. Assim, no presente trabalho, com o objetivo de investigar como o receptor M4 modula a plasticidade sináptica de longa duração e interage com uma dessas sinalizações, no caso a GABAérgica, utilizou-se a técnica de eletrofisiologia in vivo de hipocampo de ratos anestesiados. Para tanto, foram realizados registros extracelulares do potencial excitatório pós-sináptico de campo (fEPSP) de CA1 evocados por estimulação contralateral da via Colateral de Schaffer com infusão dos fármacos 15 min antes ou depois da estimulação elétrica de alta ou baixa frequência (HFS: 10 trens 0,5 Hz, 20 pulsos 100 Hz; ou LFS: 600 pulsos 1 Hz, respectivamente). MT3 (4,0 μg/μl), bicuculina (0,06 μg/μl), baclofen (0,2 μg/μl) e veículo, isoladamente ou combinados, não alteraram a amplitude da resposta evocada basal ou a facilitação por pulso pareado (FPP) 15 min após a infusão. MT3 aparentemente atenuou, mas não de forma significativa, a potenciação de longa duração (LTP) em relação ao controle (potenciação 60 min após a HFS de 31,8% e 66,0%, respectivamente). Além disso, não houve diferença significativa entre a amplitude do fEPSP no período basal e 60 min após a HFS sob ação da MT3. Bicuculina, embora não tenha abolido a LTP e nem causado alteração na FPP, produziu uma potenciação de apenas 36,4%. Baclofen promoveu uma potenciação semelhante à dos controles. A administração de baclofen também reduziu significativamente a FPP em relação ao basal. A administração conjunta de MT3 com bicuculina ou baclofen promoveu uma potenciação semelhante ao controle. MT3 não apresentou efeito sobre a manutenção da LTP quando aplicada 15 min após a HFS. Por fim, não foi possível induzir a depressão de longa duração (LTD) com o protocolo de LFS utilizado. Embora não tenha ocorrido diferença estatisticamente significativa entre os grupos devido ao baixo número de animais utilizados, os dados sugerem a possibilidade de uma amplitude reduzida da LTP quando da injeção de bicuculina. Baclofen alterou a FPP em relação ao fEPSP basal, o mesmo não tendo sido observado no grupo controle. Com a administração concomitante de MT3, tais alterações deixam de ser identificadas. Ainda que os achados experimentais sejam inconclusivos e preliminares, este trabalho permitiu a padronização da técnica de eletrofisiologia in vivo em animal anestesiado o que abre portas para futuras investigações. / The cholinergic muscarinic system exerts modulatory function over different aspects of cognition and emotion. All five muscarinic receptors subtypes (mAChR), M1 to M5, are expressed at mammals hippocampus and at least two of them are simultaneously activated by most of the drugs, hindering significant advances on the role of each component of this system. The muscarinic toxin 3 (MT3) is a selective antagonist for the M4 subtype, allowing the investigation of the modulatory actions of this receptor over learning, memory and synaptic plasticity. The M4 are G protein coupled receptors (GPCRs) that act through Gi/o triggering inhibitory effects on which cells they are occur. Previous behavioral studies have shown that administration of MT3 soon after aversive task training exerts amnestic effects over memory, while administration prior to recall, leads to facilitation. A possible explanation to these results could be that the local circuits involved on memory consolidation and recall are different in nature. On this perspective, the amnestic effect of MT3 over memory consolidation should be consequence of GABAergic interneurons inhibition suppression; while the effect on recall, should be over glutamatergic synapses modulation. Thereby, the present work, with the objective to investigate how the M4 receptor modulates long-term synaptic plasticity and interacts with the GABAergic system, in vivo electrophysiological approach of anesthetized rats’ hippocampus was applied. Hence, field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) from CA1 were recorded after stimulation of contralateral Schaffer Collateral pathway with drugs infusion 15 min before or after high or low frequency electric stimulation (HFS: 10 trains 0.5 Hz, 20 pulses 100 Hz; LFS: 600 pulses 1 Hz, respectively). Neither MT3 (4.00 μg/μl), bicuculline (0.06 μg/μl), baclofen (0.20 μg/μl) nor vehicle, isolated or combined, changed the baseline evoked response amplitude 15 min after infusion nor the paired-pulse facilitation ratio (PPF). MT3 apparently attenuated, but not significantly, the long-term potentiation (LTP) compared to control (31.8% and 66.0% potentiation 60 min after HFS, respectively). In addition, there was no significant difference between baseline and 60 min after HFS fEPSP amplitude at MT3 group. Bicuculline, although did not abolish LTP neither changed PPF, it did produce a potentiation of only 36.4%. Baclofen induced a potentiation similar to control group. Baclofen administration also significantly reduced PPF compared to baseline. The simultaneous administration of MT3 and bicuculline or baclofen led to a potentiation similar to the control group. MT3 did not show any effect over LTP maintenance when applied 15 min after HFS. Lastly, it was not possible to induce long-term depression (LTD) with the used LFS protocol. Although there was no statistical significance between groups due to the low animal numbers used, data suggest that bicuculline had reduced LTP amplitude. Baclofen did alter PPF and the same was not observed on control group. When bicuculline or baclofen were injected with MT3, those alterations were not observed. These are inconclusive and preliminary results, notwithstanding this work allowed to set up the in vivo electrophysiology technique in anesthetized animals what will provide new tools for future research.

La déficience intellectuelle affecte de 1 à 3% de la population mondiale, ce qui en fait le trouble cognitif le plus commun de l’enfance. Notre groupe à découvert que des mutations dans le gène SYNGAP1 sont une cause fréquente de déficience intellectuelle non-syndromique, qui compte pour 1-3% de l’ensemble des cas. À titre d’exemple, le syndrome du X fragile, qui est la cause monogénique la plus fréquente de déficience intellectuelle, compte pour environ 2% des cas. Plusieurs patients affectés au niveau de SYNGAP1 présentent également des symptômes de l’autisme et d’une forme d’épilepsie. Notre groupe a également montré que SYNGAP1 cause la déficience intellectuelle par un mécanisme d’haploinsuffisance. SYNGAP1 code pour une protéine exprimée exclusivement dans le cerveau qui interagit avec la sous-unité GluN2B des récepteurs glutamatergique de type NMDA (NMDAR). SYNGAP1 possède une activité activatrice de Ras-GTPase qui régule négativement Ras au niveau des synapses excitatrices. Les souris hétérozygotes pour Syngap1 (souris Syngap1+/-) présentent des anomalies de comportement et des déficits cognitifs, ce qui en fait un bon modèle d’étude. Plusieurs études rapportent que l’haploinsuffisance de Syngap1 affecte le développement cérébral en perturbant l’activité et la plasticité des neurones excitateurs. Le déséquilibre excitation/inhibition est une théorie émergente de l’origine de la déficience intellectuelle et de l’autisme. Cependant, plusieurs groupes y compris le nôtre ont rapporté que Syngap1 est également exprimé dans au moins une sous-population d’interneurones GABAergiques. Notre hypothèse était donc que l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones contribuerait en partie aux déficits cognitifs et au déséquilibre d’excitation/inhibition observés chez les souris Syngap1+/-. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré un modèle de souris transgéniques dont l’expression de Syngap1 a été diminuée uniquement dans les interneurones dérivés des éminences ganglionnaires médianes qui expriment le facteur de transcription Nkx2.1 (souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1). Nous avons observé une diminution des courants postsynaptiques inhibiteurs miniatures (mIPSCs) au niveau des cellules pyramidales des couches 2/3 du cortex somatosensoriel primaire (S1) et dans le CA1 de l’hippocampe des souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1. Ces résultats supportent donc l’hypothèse selon laquelle la perte de Syngap1 dans les interneurones contribue au déséquilibre d’excitation/inhibition. De manière intéressante, nous avons également observé que les courants postsynaptiques excitateurs miniatures (mEPSCs) étaient augmentés dans le cortex S1, mais diminués dans le CA1 de l’hippocampe. Par la suite, nous avons testé si les mécanismes de plasticité synaptique qui sous-tendraient l’apprentissage étaient affectés par l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones. Nous avons pu montrer que la potentialisation à long terme (LTP) NMDAR-dépendante était diminuée chez les souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1, sans que la dépression à long terme (LTD) NMDAR-dépendante soit affectée. Nous avons également montré que l’application d’un bloqueur des récepteurs GABAA renversait en partie le déficit de LTP rapporté chez les souris Syngap1+/-, suggérant qu’un déficit de désinhibition serait présent chez ces souris. L’ensemble de ces résultats supporte un rôle de Syngap1 dans les interneurones qui contribue aux déficits observés chez les souris affectées par l’haploinsuffisance de Syngap1. / Intellectual disability affects 1-3% of the world population, which make it the most common cognitive disorder of childhood. Our group discovered that mutation in the SYNGAP1 gene was a frequent cause of non-syndromic intellectual disability, accounting for 1-3% of the cases. For example, the fragile X syndrome, which is the most common monogenic cause of intellectual disability, accounts for 2% of all cases. Some patients affected by SYNGAP1 also showed autism spectrum disorder and epileptic seizures. Our group also showed that mutations in SYNGAP1 caused intellectual disability by an haploinsufficiency mechanism. SYNGAP1 codes for a protein expressed only in the brain which interacts with the GluN2B subunit of NMDA glutamatergic receptors (NMDAR). SYNGAP1 possesses a Ras-GAP activating activity which negatively regulates Ras at excitatory synapses. Heterozygote mice for Syngap1 (Syngap1+/- mice) show behaviour abnormalities and learning deficits, which makes them a good model of intellectual disability. Some studies showed that Syngap1 affects the brain development by perturbing the activity and plasticity of excitatory neurons. The excitatory/inhibitory imbalance is an emerging theory of the origin of intellectual disability and autism. However, some groups including ours, showed that Syngap1 is expressed in at least a subpopulation of GABAergic interneurons. Therefore, our hypothesis was that Syngap1 happloinsufficiency in interneurons contributes in part to the cognitive deficits and excitation/inhibition imbalance observed in Syngap1+/- mice. To test this hypothesis, we generated a transgenic mouse model where Syngap1 expression was decreased only in GABAergic interneurons derived from the medial ganglionic eminence, which expresses the transcription factor Nkx2.1 (Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mouse). We showed that miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) were decreased in pyramidal cells in layers 2/3 in primary somatosensory cortex (S1) and in CA1 region of the hippocampus of Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mice. Those results suggest that Syngap1 haploinsufficiency in GABAergic interneurons contributes in part to the excitation/inhibition imbalance observed in Syngap1+/- mice. Interestingly, we also observed that miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) were increased in cortex S1 but decreased in CA1 region of the hippocampus. We further tested whether synaptic plasticity mechanisms that are thought to underlie learning and memory were affected by Syngap1 haploinsufficiency in GABAergic interneurons. We showed that NMDAR-dependent long-term potentiation (LTP) but not NMDAR-dependent long-term depression (LTD) was decreased in Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mice. We also showed that GABAA receptor blockade rescued in part the LTP deficit in Syngap1+/- mice, suggesting that a disinhibition deficit is present in these mice. Altogether, the results support a functional role of Syngap1 in GABAergic interneurons, which may in turn contributes to the deficit observed in Syngap1+/- mice.

Les encéphalopathies épileptogènes sont des maladies graves de l’enfance associant une épilepsie, souvent réfractaire, et un retard de développement. Les mécanismes sous-tendant ces maladies sont peu connus. Cependant, nous postulons que ces épilepsies puissent être causées par une dysfonction du réseau inhibiteur. En effet, des défauts de migration ou de maturation des interneurones GABAergiques (INs) corticaux induisent l’épilepsie, tant chez l’humain que chez la souris. Dans le but d’étudier les causes génétiques des encéphalopathies épileptogènes sporadiques inexpliquées, le laboratoire de la Dre Rossignol a procédé au séquençage d’exome entier d’une cohorte d’enfants atteints. Cela a permis d’identifier, chez un patient, une nouvelle mutation de novo, possiblement pathogène, dans le gène MYO9b. MYO9b est impliqué dans la migration de cellules immunitaires et cancéreuses et est exprimée durant le développement cérébral. Nous émettons l’hypothèse voulant que MYO9b puisse être importante pour la migration des INs corticaux. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que Myo9b est exprimé dès le stade embryonnaire par les progéniteurs des INs corticaux et que son expression se restreint aux INs dans le cortex mature. De plus, nous démontrons que la répression ex vivo de Myo9b sélectivement dans les INs au sein de tranches corticales organotypiques embryonnaires mène à des défauts morphologiques majeurs de ces cellules en migration. En effet, ces cellules présentent une morphologie multipolaire et des neurites rostraux plus longs et plus complexes. Ces changements morphologiques pourraient avoir un impact majeur sur la migration des INs et ainsi perturber le développement des réseaux inhibiteurs. / Epileptic encephalopathies are early-onset diseases characterized by refractory epilepsy with developmental delay. To identify the underlying genetic cause of these disorders, Dr Rossignol’s laboratory has performed whole-exome sequencing in children with sporadic epileptic encephalopathies. They have identified a novel de novo mutation in the MYO9B gene in one patient. Myo9b is known to regulate cell migration in the immune system and in cancer cells. It is expressed in the developing rodent brain, but its roles during brain development are largely unknown. Recent evidence suggests that epilepsy can be caused by an imbalance between inhibition and excitation in cortical circuits. Indeed, defects in the development or the functions of cortical GABAergic interneurons (INs) have been associated with epilepsy in human and in mouse models. Therefore, we postulated that Myo9b might play a role in the development of INs. In this thesis, I show that Myo9b is expressed in INs from early embryonic ages to post-natal ages. Furthermore, I demonstrate that the ex vivo downregulation of Myo9b in INs in cortical embryonic organotypic cultures causes morphological defects in migrating INs, including aberrant polarization of these cells. These morphological changes might result in aberrant IN migration, which would be expected to perturb the cortical inhibitory-excitatory ratio.

Dans la région CA1 de l’hippocampe, une population d’interneurones exprimant la somatostatine (SOM-INs) est reconnue pour une potentialisation à long terme (PLT) dépendante des récepteurs métabotropes du glutamate de type 1a (mGluR1a) à leurs synapses excitatrices provenant des cellules pyramidales (CP). Il a récemment été démontré que cette PLT est induite par l’apprentissage contextuel lié à la peur, illustrant l’importance de cette PLT des SOM-INs dans l’apprentissage et la mémoire. Cependant, l’implication du neuropeptide somatostatine (SST) dans cette PLT demeure inconnue. Dans la présente étude, le rôle de la SST dans la PLT dépendante des mGluR1a a été étudié, tout comme, l’effet de la somatostatine-14 (SST-14) exogène aux synapses excitatrices des SOM-INs. Pour ce faire, des souris transgéniques exprimant la « enhanced yellow fluorescent protein » (eYFP) sous le contrôle du promoteur de la SST ont été utilisées. Des enregistrements électrophysiologiques jumelés à une approche pharmacologique ont été réalisés sur ces souris. Les résultats suggèrent que la SST-14 exogène engendre une PLT persistante grâce aux récepteurs à la somatostatine 1-5 (SST1-5), aux synapses excitatrices des SOM-INs, mais n’affecte pas les synapses des CP ou bien des interneurones exprimant la parvalbumine (PV-INs). Cette potentialisation induite par SST-14 était indépendante des récepteurs à l’acide N-méthyl-D-aspartique (NMDAR) et mGluR1a, dépendante de l’activité synaptique concomitante et inhibée par le blocage des récepteurs GABAA. De plus, la PLT dépendante des récepteurs mGluR1a a été affectée par l’inhibition des SST1-5 ou bien par un traitement avec de la cystéamine suggérant un rôle pour de la SST endogène dans cette PLT. Nos résultats suggèrent que la SST endogène pourrait contribuer à la PLT hébbienne aux synapses excitatrices des SOM-INs en contrôlant l’inhibition GABAA. La SST aurait alors un rôle dans la modulation de la plasticité à long terme des SOM-INs qui pourrait être important dans la mémoire dépendante de l’hippocampe. / The CA1 region of the hippocampus includes a population of GABAergic interneurons expressing somatostatin (SOM-INs). This type of interneurons displays a long-term potentiation (LTP) dependant on type 1a metabotropic glutamate receptors (mGluR1a) at their excitatory synapses from pyramidal cells (PC). It was recently demonstrated that mGluR1a dependent LTP can be induce by contextual fear learning showing an important role of this LTP in learning and memory. However, the implication of the peptide somatostatin (SST) in this LTP remains unknown. In the present study, the role of SST in mGluR1 dependent LTP and the effect of exogenous somatostatin-14 (SST-14) onto excitatory synapses of SOM-INs were investigated. To do this, transgenic mice expressing enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) under the control of the promoter of SST were used. Patch clamp recordings and pharmacological approaches were used with these mice. Results suggested that application of exogenous SST-14 induces a LTP through type 1-5 somatostatin receptors (SST1-5) of excitatory synapses of SOM-INs but does not affect synapses of PC or parvalbumin-expressing interneurons (PV-INs). This LTP induced by SST-14 was independent of N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) and mGluR1a, activity dependent, and prevented by blocking GABAA receptors. Furthermore, mGluR1a dependent LTP was prevented by inhibition of SST1-5 and by depletion of SST by cysteamine treatment, suggesting a role of endogenous SST in LTP. Our results indicate that endogenous SST may contribute to Hebbian LTP at excitatory synapses by controlling GABAA inhibition. SST would then have a role in regulating SOM-INs LTP that may be important for hippocampus dependent memory processes.

Le cervelet permet l’apprentissage moteur et la coordination des mouvements fins. Pour ce faire, il intègre les informations sensorielles provenant de l’ensemble du corps ainsi que les commandes motrices émises par d’autres structures du système nerveux central. Les noyaux cérébelleux profonds (DCN) constituent la sortie du cervelet et intègre les informations provenant des cellules de Purkinje (PC), des fibres moussues et des fibres grimpantes. Nous avons étudié les connexions fonctionnelles entres les PC et les DNC in vivo, grâce à une stimulation optogénétique des lobules IV/V du cortex cérébelleux et à l’enregistrement multi unitaire du noyau médian. Nous avons ainsi identifié deux groupes de cellules au sein des DCN, présentant des caractéristiques propres au niveau de leur fréquence de décharge et de la forme des potentiels d’action, en accord avec la dichotomie établie par une précédente étude in vitro permettant de séparer les neurones GABAergiques des autres neurones. Nos résultats suggèrent que les PC contrôlent la sotie du cervelet d’un point de vue temporel. De plus, la ciruiterie interne des DCN conforte ce résultat de part le fait que les cellules GABAergiques ne produisent pas d’effet temporel au travers de l’inhibition locale. / The cerebellum integrates motor commands with somatosensory, vestibular, visual and auditory information for motor learning and coordination functions. The deep cerebellar nuclei (DCN) generates the final output by processing inputs from Purkinje cells (PC), mossy and climbing fibers. We investigated the properties of PC connections to DCN cells using optogenetic stimulation in L7-ChR2 mice with in vivo multi electrode extracellular recordings in lobule IV/V of the cerebellar cortex and in the medial nuclei. DCN cells discharged phase locked to local field potentials in the beta, gamma and high frequency bands. We identified two groups of DCN cells with significant differences in action potential waveforms and firing rates, matching previously discriminated in vitro properties of GABAergic and non-GABAergic cells. PCs inhibited the two group of cells gradually (rate coding), however spike times were controlled for only non-GABAergic cells. Our results suggest that PC inputs temporally control the output of cerebellum and the internal DCN circuitry supports this phenomenon since GABAergic cells do not induce a temporal effect through local inhibition.