Submitted by Maria Aparecida (cidazen@gmail.com) on 2017-11-27T18:12:10Z No. of bitstreams: 1 Juliana Macedo.pdf: 3843653 bytes, checksum: a40308c73af9a3d7ce2e665d6464831f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-27T18:12:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana Macedo.pdf: 3843653 bytes, checksum: a40308c73af9a3d7ce2e665d6464831f (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / FAPEMA. / Penile cancer (PeCa) is a rare neoplasm with higher incidence in regions with low socioeconomic indexes. In Brazil, most of the men afflicted by this disease reside in the North and Northeast. Among the main risk factors are lack of hygiene, phimosis, high-risk human papillomavirus (HPV) infection and chronic inflammation. Although the role of inflammation and HPV infection is known in some cancers, the relationship between these two factors and the disruption of genes involved in the CaPe genesis is not yet well established. Thus, our main goal was to determine the expression of genes involved in the process of chronic inflammation and in the carcinogenesis mediated by HPV infection and the role of the deregulation of these genes in the establishment and progression of penile tumor. For this purpose, fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues from 55 patients with penile cancer were evaluated. HPV detection and genotyping were carried out by nested PCR and direct sequencing in all samples. A subgroup (N = 37) was evaluated by qRT-PCR to determine COX-2, EGFR, MYC, RB and P53 gene expression. For this, sections of FFPE tissues containing more than 70% tumor cells were analyzed. Protein expression of these genes and PGE2 were determined by immunohistochemistry in the same tumor tissues. An analysis of the association between the clinical-histopathological parameters, presence of HPV, and gene and protein expression was performed. All tumors were classified as epidermoid squamous cell carcinoma. HPV DNA was detected in 80% of tumors, of which 95% had at least one high-risk subtype, and HPV16 was the most frequent subtype (63%). Among the HPV negative samples in the tumor tissue, 14% were positive in the tissue adjacent to the tumor, so that 94% of the patients, in total, were positive for the presence of HPV DNA.. Overexpression was identified in all genes involved in the inflammatory process. EGFR showed overexpression in 84% of the samples, while COX2 and PGE were overexpressed in 40% of the tumors, each. There was an associationbetween the levels of EGFR and COX2 expression, and between COX2 and PGE2. On the other hand, the genes related to HPV infection, MYC, RB and P53, were underexpressed in 97%, 85% and 81% of the samples, respectively. The gene expressions did not show any association with clinical-histopathological variables. This study describes the repression of RB and P53 activity in HPV + tumors, suggesting that there is a mechanism of control of these genes, possibly mediated by the virus. The high detection of HPV infection shows the importance of the immunization of boys in the prevention of penile cancer. Our data emphasize the need to expand the vaccine coverage to cover types of HPV present in penile cancer. The overexpression of EGFR / COX2 / PGE2, and the association found between them, support the possibility of therapeutic use of anti-EGFR and anti-COX drugs in penile tumors. / Câncer peniano (CaPe) é uma neoplasia rara com maior incidência em regiões com baixos índices socioeconômicos. No Brasil, a maior parte dos homens acometidos por essa doença residem nas regiões Norte e Nordeste. Entre os principais fatores de risco estão a falta de higiene, fimose, infecção por papilomavírus humano (HPV) de alto risco e inflamação crônica. Embora o papel d a inflamação e da infecção por HPV sejam conhecidas em alguns cânceres, ainda não é bem estabelecida a relação entre esses dois fatores e a disrupção de genes envolvidos na gênese de CaPe. Assim, neste estudo foi avaliada a expressão de genes envolvidos no processo de inflamação crônica e na infecção pelo HPV e o papel da desregulação desses genes no estabelecimento e progressão de tumor peniano. Para isto, foram avaliadas amostras teciduais frescas e fixadas em formalina embebidas em parafina (FFPE) de 55 pacientes com câncer de pênis. Foram realizadas detecção e genotipagem de HPV por nested PCR e sequenciamento direto em todas as amostras Um subgrupo amostral (N=37) foi avaliado por qRT-PCR para determinação da expressão dos genes COX-2, EGFR, MYC, RB e P53. Para isso, foram usadas secões de tecidos de FFPE contendo mais de 70% de células tumorais. A expressão proteica desses genes e de PGE2 foi determinada por imunohistoquímica em 42 amostras. Foi feita análise de associação entre os parâmetros clínico-histopatológicos, presença de HPV e expressão gênica e proteica. Todos os tumores foram classificados como carcinoma epidermóide de células escamosas. DNA de HPV foi detectado em 80% dos tumores (N=55), dos quais 95% apresentaram, pelo menos, um subtipo de alto risco, e destes, HPV16 foi o subtipo mais frequente (63%). Dentre as amostras negativas para HPV no tecido tumoral, 14% foram positivas no tecido adjacente ao tumor, de modo que 94% dos pacientes, no total, foram positivos para presença de DNA de HPV. Nas amostras nas quais foi feita análise de expressão gênica (N=37), detectou-se 94,4% de infecção, sendo 94% dos infectados possuem, pelo menos um, tipo de alto risco. Foi Identificada superexpressão em todos os genes envolvidos no processo inflamatório. EGFR mostrou superexpressão em 84% das amostras, enquanto COX2 e PGE mostraram-se, cada um, superexpressos em 40% dos tumores. Houve associação entre níveis de expressão de EGFR e COX2, e entre COX2 e PGE2. Por outro lado, os genes relacionados à infecção por HPV, MYC, RB e P53, mostraram-se subexpressos em 97%, 85% e 81% das amostras, respectivamente. A expressão dos genes estudados não mostrou associação com as variáveis clínico-histopatológicas. Este estudo descreve a repressão da atividade de RB e P53 em tumores HPV+, sugerindo que há um mecanismo de controle desses genes em câncer peniano, possivelmente mediado pelo vírus. A alta detecção de infecção por HPV mostra a importância da imunização de meninos na prevenção de câncer peniano, e ressalta-se a necessidade de ampliação da cobertura vacinal de modo a abranger tipos de vírus presentes em câncer peniano. A superexpressão de EGFR/COX2/PGE2, e a associação encontrada entre eles, sustenta a possibilidade de uso terapêutico de drogas anti-EGFR e anti-COX em tumores penianos.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-08-30T12:03:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_BiologiaMolecularAplicada.pdf: 8918060 bytes, checksum: d929a519e6a827337140388ee9beb358 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-30T12:43:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_BiologiaMolecularAplicada.pdf: 8918060 bytes, checksum: d929a519e6a827337140388ee9beb358 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T12:43:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_BiologiaMolecularAplicada.pdf: 8918060 bytes, checksum: d929a519e6a827337140388ee9beb358 (MD5) Previous issue date: 2016-09-02 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A hanseníase é causada pelo Mycobacterium leprae e os indivíduos acometidos pela hanseníase podem ser classificados, em Paucibacilares e Multibacilares. Alternativamente, segundo Ridley-Jopling (1966), com base em critérios clínicos e imuno-hitológicos em outros dois pólos: (i) o pólo Tuberculóide (TT); e (ii) pólo Lepromatoso (LL), e seus intermediários. Independente de sua classificação, este espectro parecer ser inflluenciado por moléculas moduladoras da resposta imune, como os genes que codificam estes mediadores, e por um grupo de pequenos RNAs (microRNAs) que são responsáveis pela regulação destes genes, portanto essas investigações podem adensar o conhecimento sobre o mecanismo de resposta ao processo infecsioso, assim como possibilitar a identificação de novos biomarcadores no auxilio ao diagnóstico da hanseníase. O objetivo foi investigar oito polimorfismos do tipo INDEL nos genes CYP19A1, NFKβ1, IL1α, CASP8, UGT1A1, PAR1, CYP2E1, e IL4, para identificar possíveis marcadores de susceptibilidade e a influência da ancestria genética neste risco, além disso foi realizado o primeiro miRnoma da hanseníase por sequenciamento massivo em plataforma de alto desempenho, afim de elucidar o perfil epigenético presente na hanseníase. Nosso estudo revelou que os genes NFΚβ1, CASP8, PAR1 e IL4, são potenciais marcadores de susceptibilidade para a hanseníase, enquanto que NFΚβ1, CASP8, PAR1 e CYP19A1 são potenciais marcadores da forma clínica multibacilar. Adicionalmente, a análise da ancestralidade genômica mostrou que a contribuição Européia elevou o risco ao desenvolvimento da doença, enquanto a contribuição Africana aumentou proteção. No que diz respeito a análise diferencial do perfil de expressão dos microRNAs de pacientes com hanseníase, por meio da análise de biopsias de pele, revelaram-se 67 miRNAs diferencialmente expressos, dos quais 43 apresentavam um padrão de expressão downregulated e 24 upregulated. Quando analisamos amostras de sangue desses mesmos pacientes, observaram-se 10 miRNAs diferencialmente expressos, dos quais 9 com padrão de expressão downregulated e 1 upregulated. Os alvos pesquisados, em análise in silico, a partir desses resultados sugeriu os genes (IL1β, IL6, IL8, IL12, TLR2, TLR4, IL17RB, IFNGR1, TGFBR1, NFκβ, família SMAD, STAT3, CASP8, CYP19A1, BCL-2, entre outros) como envolvidos na patologia da hanseníase. Por fim, monstrou-se pela primeira vez o perfil de microRNAs em genome wide da Hanseníase. / Leprosy is caused by Mycobacterium leprae and patients can be grouped in Paucibacillary and Multibacillary. Alternatively, according by Ridley-Jopling (1966), using immune-hystogical criteria, grouped in two distinct pole: (i) Tuberculóide (TT); and (ii) lepromatous (LL), and your intermediaries. Independently these classification, the disease can be affected by molecules that modulates immune response, like genes that encode these molecules, and by small RNA (micro-RNA), wich regulated these genes, thus these study can improve the knowledge about the mechanism of response to infectious process, as well as enable the identification of new possibles biomarkers to assist diagnosis in leprosy. The objective of this study was to investigate eight INDEL polymorphisms on genes CYP19A1, NFKβ1, IL1α, CASP8, UGT1A1, PAR1, CYP2E1, and IL4, to identify possible susceptibility markers of leprosy and evaluate the influence of genetic ancestry on disease risk. Besides was performed the first genome wide miRNA profiling of Leprosy by next generation sequencing (NGS), assessing and describing the expression standard in leprosy. Our study shows that the NFKβ1, CASP8, PAR1, IL4 and CYP19A1 genes are possible markers for the susceptibility to development of leprosy and the severe clinical form MB. Moreover, after correcting for population structure within an admixture population, the results show that different levels of ethnic group composition can generate different OR rates for leprosy susceptibility. The differential expression profile from tissue samples reveal 67 miRNAs differentially expression, with 43 down and 24 upregulated and from blood sample were found a total of 10 miRNAs differentially expression with 9 down and one upregulated. Moreover was performed in silico target analysis and detect the genes (IL1β, IL6, IL8, IL12, TLR2, TLR4, IL17RB, IFNGR1, TGFBR1, NFκβ, família SMAD, STAT3, CASP8, CYP19A1, BCL-2, in others) involved on pathological of leprosy. Lastly, was showed for the first time the genome wide microRNA of leprosy.

Nas últimas décadas, a molécula HLA-G despontou como uma importante molécula imunossupressora. O fato de a molécula HLA-G estar envolvida em diversos mecanismos de imunorregulação e, considerando sua expressão em doenças inflamatórias, sugere a possibilidade de um papel dessa molécula na patogênese e no curso de doenças reumatológicas. Com base nisso, esta tese teve como objetivo avaliar a influência da molécula HLA-G, bem como das variantes genéticas do gene HLA-G na suscetibilidade e no curso de doenças reumatológicas, buscando correlacionar fatores genéticos, moleculares, clínicos e imunológicos. Neste trabalho, avaliamos a influência de variantes alélicas da região 3’ não traduzida do gene HLA-G na suscetibilidade e curso do lúpus eritematoso sistêmico (LES), na suscetibilidade à artrite reumatóide (AR) e avaliamos a expressão de HLA-G solúvel (sHLA-G) em pacientes com AR e artrite idiopática juvenil (AIJ). Observamos que o mesmo haplótipo (D/G) parece estar associado tanto à suscetibilidade ao LES quanto à AR, apontando para o gene HLA-G como um potencial fator de suscetibilidade comum às duas doenças. Em AR, observamos maiores níveis de HLA-G solúvel no líquido sinovial de pacientes fator reumatóide-negativos (FR-) em comparação com pacientes FR+, e diferentes padrões de correlação entre os níveis plasmáticos de sHLA-G e parâmetros de atividade de doença após estratificarmos os grupos de pacientes para positividade para FR e gênero. Nossas observações, portanto, colocam a molécula e o gene HLA-G como elementos diretamente envolvidos na patogênese e curso dessas doenças e encorajam estudos futuros que procurem elucidar o papel da molécula HLA-G no curso de doenças reumatológicas. / In the last decades, HLA-G has emerged as a major immunosuppressive molecule. The fact that HLA-G is involved in various mechanisms of immunoregulation and given its expression in inflammatory diseases suggests the possibility of a role of this molecule in the pathogenesis and course of rheumatic diseases. This thesis aimed to evaluate the influence of HLA-G, as well as genetic variants of the HLA-G gene in the susceptibility and course of rheumatic diseases, seeking to correlate genetic, molecular, clinical and immunological factors. We evaluated the influence of allelic variants of the HLA-G gene 3 'untranslated region (3”UTR) in susceptibility and course of systemic lupus erythematosus, in the susceptibility to rheumatoid arthritis and we have also evaluated the expression of soluble HLA-G in patients with rheumatoid arthritis (RA) and juvenile idiopathic arthritis (JIA). We noted that the same haplotype (D/G) seems to be associated with susceptibility to RA and SLE, pointing to the HLA-G gene as a potential common susceptibility factor to both diseases. In RA, we observed higher levels of soluble HLA-G (sHLA-G) in synovial fluid (SF) from rheumatoid factor negative (RF-) patients as compared to RF+ patients, and different patterns of correlation between sHLA-G plasma levels and disease activity parameters after stratifying patient groups for RF positivity and gender. Our observations, therefore, put the gene and molecule HLA-G as directly involved elements in the pathogenesis and course of these diseases and encourage future studies that seek to elucidate the role of HLA-G in the course of rheumatic diseases.

O Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) é comum em adultos e caracteriza-se por sintomas persistentes de desatenção, hiperatividade e impulsividade. Clinicamente, o TDAH é um fenótipo bastante heterogêneo e, frequentemente, encontra-se associado a diversos outros transtornos psiquiátricos. A contribuição genética é substancial no TDAH e diversos genes de pequeno efeito têm sido associados com o desenvolvimento do transtorno. O metilfenidato (MPH) representa o principal agente farmacológico usado no tratamento e seu mecanismo de ação parece envolver a potencialização da transmissão catecolaminérgica no córtex pré-frontal. Estudos farmacogenéticos têm investigado o papel de diversas variantes genéticas, principalmente em sistemas de neurotransmissão, na resposta ao tratamento com MPH. No entanto, esses estudos têm focado quase que exclusivamente no tratamento de crianças com TDAH. No presente trabalho foi investigada a associação entre 17 polimorfismos genéticos, em nove genes candidatos (DAT1, ADRA2A, 5-HTT, HTR1B, TPH2, DBH, DRD4, COMT e SNAP25), e a resposta ao tratamento com MPH. A amostra foi composta de 165 adultos com TDAH, diagnosticados de acordo com os critérios do DSM-IV. A gravidade dos sintomas dos pacientes foi avaliada antes e após um mês de uso de MPH através da aplicação das subescalas SNAP-IV e da escala CGI-S. Também avaliamos uma amostra de 136 dependentes de álcool e 237 controles, em um estudo de associação envolvendo o gene HTR1B. A resposta ao MPH foi analisada através de avaliações categórica e dimensional da redução nos sintomas após o uso de MPH. Foi observada uma redução significativa nos escores de gravidade total dos sintomas após o tratamento, sendo que 83% dos pacientes foram classificados como respondedores e 17% como não respondedores. Interpretamos a dificuldade de identificar variantes genéticas envolvidas na resposta ao tratamento como o reflexo da complexidade clínica e etiológica do TDAH. Exemplo disso é o fato de que o gene HTR1B, que apresenta resultados positivos para associação com o TDAH em meta-análises e em um estudo com crianças da nossa população, não se mostrou associado com o TDAH em adultos ou com a resposta ao MPH, mas sim com o alcoolismo nesse estudo. Novas investigações, em amostras maiores, serão necessárias para que seja alcançado maior sucesso nos estudos farmacogenéticos envolvendo o MPH ou outros fármacos no tratamento do TDAH. / Attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) has a high prevalence in adults and it is characterized by pervasive symptoms of inattention, hyperactivity and impulsivity. Clinically, ADHD is a very heterogeneous disorder frequently associated with other psychiatric conditions. The genetic contribution in ADHD is substantial and several genes of small effect have been associated with ADHD susceptibility. Methylphenidate (MPH) is the primary agent used in pharmacological intervention for ADHD. Its mechanism of action is believed to potentiate catecholamine transmission in the pre-frontal cortex. Pharmacogenetic studies have been investigating the role of genetic variants in the response to the treatment with MPH. However, previous studies have focused almost exclusively in the treatment of children with ADHD. In this study, we investigated the association between 17 polymorphisms, in 9 candidate genes (DAT1, ADRA2A, 5- HTT, HTR1B, TPH2, DBH, DRD4, COMT and SNAP25), and the response to MPH. The sample comprised 165 adults with ADHD diagnosed according to DSMIV criteria. We also evaluated a sample of 136 alcohol dependents and 237 control subjects, in an association study involving the HTR1B gene. The response to MPH was assessed by both categorical and dimensional approaches through the SNAP-IV sub-scales and the CGI-S scale, applied at the beginning and after the 30th day of treatment. We detected a significant reduction in SNAP-IV total scores during the follow-up period. According to the categorical definition of MPH response, 83% of the patients were classified as responders and 17% were classified as non-responders. Our results indicated that none of the investigated variants showed significant effects on the MPH response. We interpret the difficulty of identifying genetic variants involved in response to treatment as a reflection of the clinical and etiological complexity of ADHD. For example, we did not find association of the HTR1B gene with ADHD nor with treatment response to MPH in our adult sample, but it was in fact associated with alcohol dependence. However, this gene has previously shown positive results for association with children ADHD in meta-analysis and also in a study with children of the same population of the current work. More investigations with larger sample sizes will be need to achieve greater success in pharmacogenetic studies involving the MPH or other drugs used in the treatment of ADHD.

Orientador: Danilo Moretti-Ferreira / Banca: Henrique Krieguer / Banca: Claudia Regina Furquim de Andrade / Resumo: A gagueira é um distúrbio da comunicação, mais especificamente da fluência, onde há interrupções e alterações na velocidade do fluxo da fala. Acomete de 3 a 4% dos indivíduos do sexo masculino e de 1 a 2% do sexo feminino, em algum momento de suas vidas. A frequencia pode variar de acordo com a idade: entre crianças em idade pré-escolar de 2,4% a 5% e em idade escolar 1%. Em adultos, estima-se que de 1 a 2% sofram com este distúrbio. Em todas as idades, a gagueira parece ser mais comum no sexo masculino do que no feminino, sendo de 4 a 5 M : 1 F em adultos. Em estudos de subgrupos de gagueira persistente familial, a proporção entre os indivíduos foi de apenas 1,5 M : 1 F. A triagem genômica em famílias de gagos provenientes da América do Norte e da Europa demonstrou a existência de um locus de predisposição a gagueira familial no cromossomo 18 envolvendo a região 18p e um segundo locus na região 18q proximal, sugerindo que exista um locus de predisposição a gagueira familial no cromossomo 18 e que genes adicionais possam existir, além dos fatores ambientais. O objetivo deste trabalho foi a análise de associação nas regiões cromossômicas 18p e 18q proximal através de marcadores microssatélites (2 cM) em 31 famílias brasileiras com gagueira persistente, com mais de um indivíduo gago em idade acima de 6 anos. Utilizou-se para a classificação da gagueira, o SSI aplicado por profissionais especializados nesta disfluência. Foram incluídos todos os indivíduos disponíveis do núcleo familial, independente do sexo, etnia, escolaridade e nível social.Todos os participantes tiveram amostras de seu DNA coletados a partir de amostras de sangue periférico. Foram selecionados 14 marcadores microssatélites do cromossomo 18, genotipados após PCR em seqüenciador automático. Na análise dos dados foram utilizados programas SIMWALK 2, FBAT e POINTER... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Stuttering is a communication disorder, or more precisely, a fluency disorder that causes speech interruptions and changes in speech flow rate. It affects 3- 4% of males and 1-2% of females at some point in their lives. Its frequency may vary with age - it has been reported to be 2.4-5% among children of pre-school age and 1% at school age. In adults, it ranges from 1 to 2%. At all ages, stuttering seems to be more frequent in males than in females, being 4-5M:1F among adults. Studies in subsets of familial persistent stuttering showed a sex ratio of only 1.5M:1F. A genome scan in stuttering families from North America and Europe demonstrated the presence of a predisposing locus for family stuttering on chromosome 18 involving the 18p region and a second locus on proximal 18q (Shugart et al.,2004), suggesting that chromosome 18 may harbor a predisposing locus for this disorder, and that additional genes may exist besides environmental factors. The purpose of this study was to perform the association analysis of chromosomal regions 18p and proximal 18q using microsatellite markers (2 cM) in 31 Brazilian families with at least two stuttering members aged more than 6 years. Stuttering was classified by specialized professionals using SSI. All family members available, regardless of gender, ethnicity, educational or social level were assessed provided that they were older than 6 years. DNA samples from peripheral blood of all participants were collected. Fourteen chromosome 18 microsatellites were genotyped after PCR by automated sequencing. Data were analyzed with software SIMWALK 2, FBAT and POINTER. Association analysis revealed no association of stuttering with 13 microsatellites (one was excluded for being noninformative) demonstrating no association between this phenotype and chromosome 18 in the study population / Mestre

Orientador: Ana Elizabete Silva / Coorientador: Érika Cristina Pavarino / Banca: Claudia Aparecida Rainho / Banca: Claudia Regina Bonini Domingos / Resumo: O câncer colorretal (CCR) é um dos modelos da associação inflamação-câncer. Assim, polimorfismos em genes que desempenham um papel importante na suscetibilidade a doenças inflamatórias, como os receptores Toll-like (TLR2 e TLR4), podem ser alvos interessantes para estudos de possíveis marcadores moleculares para CCR. Objetivos: Avaliar a associação dos polimorfismos TLR2 -196 a -174del, TLR4 -1607 T/C (rs10759932) e TLR4 +896 A/G (rs4986790), e de fatores de risco (gênero, idade, tabagismo e etilismo) com o desenvolvimento de CCR; assim como determinar os níveis de expressão relativa desses genes no tecido tumoral e a influência dos polimorfismos funcionais sobre os níveis de expressão do RNAm. Materiais e Métodos: Foram genotipadas 434 amostras (194 de pacientes com CCR e 240 de indivíduos saudáveis) de DNA de leucócitos de sangue periférico ou de células de tecido tumoral (DNA e RNA), por meio das técnicas de PCR alelo-específico e PCR-RFLP. A análise de regressão logística múltipla foi utilizada para avaliar a associação dos polimorfismos com risco de CCR, aplicando os modelos log-aditivo, dominante e recessivo, ajustados para os fatores de risco. Para a quantificação relativa (RQ) do RNAm foi utilizada a técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) em 40 amostras de tecido tumoral. Resultados: A variante polimórfica TLR2 -196 a -174del foi associada com risco aumentado de desenvolvimento de CCR de acordo com os modelos dominante (OR=1,72, IC95%=1,03-2,89; p=0,038) e log-aditivo (OR=1,59, IC95%=1,02-2,48; p=0,039), porém para os polimorfismos TLR4 -1607 T/C e TLR4 +896 A/G não foi encontrada associação. Idade acima de 60 anos (OR=1,83, IC95%=1,26-2,90; p=0,003) e hábito etilista (OR=2,78, IC95%=1,68-4,60; p=0,000) também estão associados com risco... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Colorectal cancer (CRC) is one of the models of inflammation-cancer association. Thus, polymorphisms in genes that play a role in susceptibility to inflammatory diseases, such as Toll-like receptors (TLR2 and TLR4) may be interesting targets for studies of potential molecular markers for CRC. Objectives: To evaluate the association of polymorphisms TLR2 -196 to -174del, TLR4 -1607 T/C (rs10759932) and TLR4 +896 A/G (rs4986790) and risk factors (gender, age, smoking and drinking habits) with CRC development, as well as to determine the relative expression levels of these genes in tumor tissue and influence of functional polymorphisms on the levels of mRNA expression. Materials and Methods: We genotyped 434 samples (194 patients with CRC and 240 from healthy individuals) of DNA from peripheral blood leukocytes or tumor tissue cells (DNA and RNA), by PCR allele-specific or PCR -RFLP. The multiple logistic regression analysis was performed to evaluate the association between the polymorphisms with risk of CRC, applying the log-additive, dominant and recessive models, adjusted for risk factors. The relative quantification (RQ) of the mRNA was performed by the real time quantitative PCR (qPCR) technique in 40 tumor tissue samples. Results: The polymorphic variant TLR2 -196 to -174del was associated with increased risk of developing CRC according to both dominant (OR=1.72, 95%CI=1.03 to 2.89, p=0.038) and log-additive models (OR=1.59, 95%CI=1.02 to 2.48, p=0.039), but for the TLR4 -1607 T/C and TLR4 +896 A/G polymorphisms no association was found. Age above 60 years old (OR=1.83, 95%CI=1.26 to 2.90, p=0.003) and alcohol consumption (OR=2.78, 95%CI=1.68 to 4.60, p=0.000) are also associated with increased risk for developing of this cancer. Analysis of relative quantification of the mRNA showed a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Danilo Moretti-Ferreira / Coorientador: Dennis Drayna / Banca: Ana Maria Schiefer / Banca: Maria Isabel de Souza Aranha Melaragno / Banca: Robson Francisco Carvalho / Banca: Ester Silveira Ramos / Resumo: A gagueira é uma doença comum que afeta a fluência da fala, caracterizada por repetições ou prolongamentos frequentes de sons, sílaba, palavras, ou por hesitações, ou interrupções no fluxo normal da fala. Trata-se de uma doença que tipicamente surge na infância em crianças com idade entre dois e quatro anos, com taxa de incidência estimada em torno de 5% da população. No entanto devido à elevada taxa de recuperação espontânea, estima-se uma prevalência de 1% na população em geral. Apesar do envolvimento de fatores ambientais, o fator genético é determinante para o desenvolvimento da doença. Algumas evidências que sustentam essa relação são: agregação familial, estudos com gêmeos e envolvendo adoções e, relações de consanguinidade em famílias com diversos afetados. Entretanto, trata-se de uma doença complexa na qual a identificação exata do tipo de herança é difícil de ser determinada uma vez que não seguem as leis de Mendel. Este estudo teve como principal finalidade realizar análises de ligação em 43 famílias brasileiras do Estado de São Paulo, não relacionadas, portadoras de gagueira desenvolvimental persistente a fim de identificar regiões cromossômicas com possíveis genes candidatos; Para as análises de ligação, inicialmente foi realizada a genotipagem de todas as famílias através de chips específicos para essa finalidade contendo 6056 marcadores SNP. Posteriormente, para o refinamento do mapa de ligação foram utilizados marcadores microssatélites polimórficos marcados com fluoróforos e analisados em sequenciador automático capilar. Para as estimativas das frequências alélicas destes marcadores na população brasileira foram utilizados amostras do grupo controle, não relacionadas, previamente selecionadas. Apenas duas famílias (BRPD_47 e BRPD_50) sob o padrão de herança dominante... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Stuttering is a common disease that affects the fluency of speech, and is characterized by frequent repetitions or prolongations of sounds, syllables, or words, or by interruptions in the normal flow of speech. The disorder typically begins in children aged two to four years, and has an estimated incidence rate of around 5% of the population. Due to the high rate of spontaneous recovery, the estimated prevalence of the disorder is 1% in the general population. Despite the involvement of environmental factors, genetic factors have been shown to be critical to the development of the disease. Evidence supporting genetic factors include twin studies, adoption studies, family clusters of stuttering, and consanguineous relations in families with many cases of the disorder. However stuttering is a complex disorder in which the identification of the exact type of inheritance is difficult to determine because it does not follow Mendelian laws. The main goal of this study was to perform a genome-wide linkage analysis in 43 unrelated families from the Brazilian state of São Paulo, which had multiple cases of persistent developmental stuttering, in an effort to identify chromosomal regions containing possible causal genes, Linkage analysis was initially performed by genotyping of all families with chip-based methods that assayed 6056 sNP markers. Subsequent refinement of linkage locations used polymorphic microsatellite markers analyzed by capillary electrophoresis unsing an automated DNA sequencer. Unrelated normal Brazilian samples were used as a control group to estimate the allele frequencies of these markers in this population. Two families (BRPD_47 and BRPD_50) showed significant evidence for linkage in the region of chromosome 10q21 under a dominant inheritance model. Combining these two families produced... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Paula Rahal / Banca: Clarice Arns / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Cristiane Damas Gil / Resumo: A Hepatite C é a inflamação do fígado causada pela infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Essa inflamação ocorre na maioria das pessoas infectadas pelo vírus e, dependendo da intensidade e tempo de duração, pode levar à cirrose e câncer do fígado. No momento não existem vacinas eficazes e o tratamento convencional com peg-IFN e ribavirina tem eficácia bastante limitada e efeitos colaterais graves. Terapias moleculares utilizando a RNAi demonstraram ser eficientes na inibição deste vírus in vitro. O objetivo deste trabalho foi desenvolver diferentes metodologias para inibição da replicação do HCV utilizando-se da técnica de RNAi. Foram desenvolvidas 5 moléculas de dicer substrate siRNA, que em sua maioria foram capazes de reduzir a replicação viral em até 90% em relação ao controle negativo. Ainda, não foi observada a seleção de mutantes resistentes do vírus após o tratamento com os DsiRNAs por 21 dias. Também foram desenvolvidos 3 vetores lentivirais contendo sequencias codificantes de shRNA contra o HCV. Com a utilização destas partículas lentivirais foi possível reduzir a replicação do HCV em aproximadamente 99% em relação ao controle negativo. Neste estudo foi demonstrado que o HCV pode ser inibido eficientemente utilizando tecnologias distintas de RNAi. Os DsiRNAs são mais potentes que os tradicionais siRNAs e com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes. Os vetores lentivirais são eficientes na entrega dos genes contendo os shRNAs e potentes na inibição do HCV. Ambas as tecnologias no futuro poderão ser utilizadas na terapia alternativa de pacientes crônicos ou no caso dos DsiRNAs de forma preventiva à infecção / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) frequently establishes persistent infections in the liver, leading to the development of chronic hepatitis, and, potentially, to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma at later stages. No vaccine is available for HCV and the current standard of care, which consists of pegylated interferon-α and ribavirin, has limited efficacy against certain HCV genotypes, and also produces significant adverse effects. Molecular therapies have proven to be effective in the inhibition of the virus in vitro. Molecular therapies based on RNAi has shown good efficiency on knockdown of HCV in vitro.The aim of this study was to develop different methodologies for inhibiting HCV replication using the RNAi technique. We developed five dicer substrate siRNA molecules, which mostly were able to reduce viral replication by 90% compared to the negative control. Still, there was no selection of resistant mutants of the virus after treatment with DsiRNAs for 21 days. In addition, we developed lentiviral vectors containing sequences encoding shRNA against HCV. With the use of these lentiviral particles, it was possible to reduce HCV replication by approximately 99% compared to negative control. In this study, it was demonstrated that HCV could be effectively inhibited using different RNAi technologies. The DsiRNAs are more powerful than traditional siRNAs and less likely to select resistant mutants. The lentiviral vectors are efficient in delivery of genes containing shRNAs and potent in the inhibition of HCV. Both technologies in the future may be used in alternative therapy for chronic patients or in case of DsiRNAs preventively to infection / Doutor

Orientador: Ana Elizabete Silva / Banca: Lúcia Regina Martelli / Banca: Spencer Luiz Marques Payão / Banca: Dorotéia Rossi S. Souza / Banca: Debora Ap. Pires de C. Zuccari / Resumo: Helicobacter pylori (H. pylori) é o principal patógeno associado ao câncer, devido mudanças inflamatórias e atróficas na mucosa gástrica, que por meio de progressão pode culminar no adenocarcinoma gástrico. A erradicação da H. pylori é considerada um tratamento de primeira linha para reverter as lesões préneoplásicas e prevenir a progressão maligna. Poucos estudos avaliaram a ocorrência de alterações genéticas antes e após a erradicação da bactéria, que possam evidenciar mudanças importantes relacionadas à resposta a terapia. Portanto, os objetivos deste estudo foram: avaliar a expressão do RNAm de genes que atuam na resposta inflamatória e imune e processos biológicos como proliferação celular, migração, invasão, apoptose, regeneração e angiogênse (TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A, PLAT, PAI-1 e IFITM1) em pacientes com lesões gástricas antes e após a terapia de erradicação da H. pylori; investigar a expressão proteica dos respectivos genes; avaliar a influência dos genótipos bacterianos CagA e VacA na resposta à erradicação da bactéria e nos níveis de expressão gênica, e avaliar a cinética celular, como o índice de proliferação celular (PI) e o índice apoptótico (AI). Foram estudadas 38 biópsias gástricas de pacientes com gastrite crônica-Hp+ (GC-Hp+) antes do tratamento padrão de erradicação da bactéria e, 3 meses após a terapia. Como controle, foram obtidas quatro biópsias de mucosa gástrica normal-Hp- (MN-Hp). A quantificação relativa (RQ) do RNAm foi avaliada pelo ensaio TaqMan e a expressão proteica, proliferação celular e apoptose por imuno-histoquímica. Antes do tratamento foram observados níveis de expressão relativa aumentados do RNAm de TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A e IFITM1 em pacientes GC-Hp+ em relação a MNHp- (p< 0,0001), exceto para PLAT e PAI-1, que apresentaram expressão reduzida (p< 0,0001). Os receptores TLR2 e TLR4, assim como TGF-β e IFITM1 ... / Abstract: Helicobacter pylori is the main pathogen associated with cancer due inflammatory and atrophic changes in the gastric mucosa, which through of progression may result in gastric adenocarcinoma. The eradication of H. pylori is considered a first-line treatment to reverse precancerous lesions and prevent malignant progression, but a portion of patients has no effective response to therapy. Few studies have evaluated the occurrence of genetic changes before and after eradication of the bacteria, which can evidence important changes related to response to therapy. Therefore, the objectives of this study were to assess the mRNA expression of genes that participate in the inflammatory and immune response and biological processes such as cell proliferation, migration, invasion, apoptosis, regeneration and angiogenesis (TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A, PLAT, PAI-1 and IFITM1) in dyspeptic patients before and after eradication therapy of H. pylori; to investigate the protein expression of the respective genes; to evaluate the influence of bacterial CagA and VacA genotypes in response to H. pylori eradication and levels of gene expression, and assess cell kinetics, as cell proliferation index (PI) and apoptotic index (AI). 38 gastric biopsies from patients with chronic gastritis-Hp+ (CG-Hp+) before the standard treatment for eradication of the bacteria, and 3 months after therapy were studied. As control, four biopsies from normal gastric mucosa without infection (NM-Hp-) were obtained. Relative quantification (RQ) of mRNA was assessed by TaqMan assay and protein expression, cell proliferation and apoptosis by immunohistochemistry. Before treatment increased mRNA relative expression levels of TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A and IFITM1 were observed in CG-Hp+ compared to NM-Hp- (p <0.0001), except for PLAT and PAI-1, which showed reduced expression (p <0.0001). The TLR2 and TLR4 receptors, as well as TGF-β and IFITM1 showed increased expression of ... / Doutor

Orientador: Agnes Cristina Fett-Conte / Banca: Ana Elizabete Silva / Banca: Karina Griesi Oliveira / Resumo: Os Transtornos do Espectro do Autismo (TEA) são afecções neuropsiquiátricas graves que se caracterizam por dificuldades, de início precoce, no domínio da comunicação social, por comportamentos atípicos, repetitivos e interesses restritos. Em cerca de 10 a 25% dos casos a etiologia pode ser esclarecida, o que reflete a natureza complexa e heterogênea da doença. Embora diversos fatores ambientais estejam relacionados com a etiopatogenia, muitos estudos, inclusive com gêmeos, mostram que a participação dos fatores genéticos é inequívoca. A literatura tem revelado, de maneira progressiva, muitos genes e variantes genéticas relacionados com a predisposição a estas afecções. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) têm sido considerados marcadores genéticos de predisposição a várias doenças complexas, o que sugere que também podem estar relacionados aos TEA. Há referências da associação de variantes comuns do gene sináptico CNTNAP2 com diferentes fenótipos neuropsiquiátricos e alterações no desenvolvimento da linguagem. SNPs do gene ADA, envolvido em neurotransmissão e metabolismo das purinas, também já foram associados a uma diminuição de atividade enzimática e predisposição ao fenótipo autista. Este estudo objetivou avaliar SNPs destes dois genes em autistas e controles, para investigar uma possível associação com o fenótipo comportamental. Foram avaliados dois SNPs (rs7794745 e rs2710102) do gene CNTNAP2 e o SNP G22A do gene ADA, genotipados em 210 indivíduos com TEA idiopático e em 200 indivíduos controles. A análise molecular foi feita por reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de fragmentos de restrição (PCR-RFLP). Para análise estatística foi adotado nível de significância de 5%. Os resultados revelaram associação entre o SNP rs7794745 (OR=1,802, IC95%=1,054-3,083, p=0,042) em homozigose (TT) com a predisposição aos TEA na população estudada. Os indivíduos do sexo ... / Abstract: Autism Spectrum Disorders (ASD) are severe neuropsychiatric disorders characterized by difficulties with early onset, in the field of social communication, atypical behaviors, restricted and repetitive interests. In about 10-25% of cases the etiology can be clarified, which reflects the complex and heterogeneous nature of the disease. Although several environmental factors are related to the pathogenesis, many studies, including twins, have showed that the involvement of genetic factors is clear. The literature has revealed, progressively, many genes and genetic variants related to the predisposition to these disorders. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been considered genetic markers of predisposition to various diseases complex, suggesting that can also be related to ASD. There are references of association the common variants of the CNTNAP2 synaptic gene with different neuropsychiatric phenotypes and changes in language development. SNPs of ADA gene, involved in neurotransmission and metabolism of purines, have also been associated with a decrease in enzyme activity and predisposition to autism phenotype. This study aimed to evaluate SNPs of these two genes in autistic patients to investigate a possible association with the behavioral phenotype. It was evaluated two SNPs (rs7794745 and rs2710102) of the CNTNAP2 gene and the SNP G22A of the ADA gene, genotyped in 210 individuals with idiopathic ASD and 200 control subjects. Molecular analysis was performed by polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). A 5% alpha error was considered significant in statistical analysis. The results revealed association between the SNP rs7794745 (OR = 1.802; 95%CI = 1.054 - 3.083; p = 0.042) in homozygous (TT) with predisposition to ASD at our study population. Affected individuals males also showed a significantly higher frequency of this polymorphism (p = 0.021) compared to men in the control group. For ... / Mestre