Escherichia coli is the best characterized bacterium; it grows rapidly, and it is easy to manipulate genetically. An increased knowledge about the physiology of this model organism will facilitate the development of engineered E.coli strains for applications such as production of biofuels and biofilm control. The aims of this work were the application of protein engineering to increase E. coli hydrogen production, the identification of the proteins regulating extracellular DNA production (eDNA), and the evaluation of the effect of the proteins synthesizing the signal 3'-5'-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) on biofilm formation. The Escherichia coli hydrogen production rate was increased 9 fold through random mutagenesis of fhlA. Variant FhlA133 (Q11H, L14V, Y177F, K245R, M288K, and I342F) enhances hydrogen production by increasing transcription of the four transcriptional units regulated by FhlA. The amino acid replacements E363G and L14G in FhlA increased hydrogen production 6 fold and 4 fold, respectively. The complete E. coli genome was screened to identify proteins that affect eDNA production. The nlpI, yfeC, and rna mutants increased eDNA production and the hns and rfaD mutants decreased eDNA production. Deletion of nlpI increases eDNA 3 fold while overexpression of nlpI decreases eDNA 16 fold. Global regulator H-NS is required for eDNA with E. coli since deletion of hns abolished eDNA production while overexpression of hns restored eDNA to 70 percent of the wild-type levels. Our results suggest that eDNA production in E. coli is related to direct secretion. Deletions of the genes encoding the diguanylate cyclases YeaI, YedQ, and YfiN increased swimming motility and eDNA as expected for low c-di-GMP levels. However, contrary to the current paradigm, early biofilm formation increased dramatically for the yeaI (30 fold), yedQ (12 fold), and yfiN (18 fold) mutants. Hence, our results suggest that c-di-GMP levels should be reduced for initial biofilm formation because motility is important for initial attachment to a surface.

Legionella pneumophila est un pathogène intracellulaire, agent de la Légionellose, et dont le réservoir dans l’environnement est constitué d’amibes aquatiques comme Acanthamoeba castellani. Mes objectifs de thèse étaient l’identification de mécanismes moléculaires contrôlant la virulence et la multi-résistance chez L. pneumophila, et en particulier l’exploration du rôle des protéines « GGDEF/EAL ». Les domaines GGDEF et EAL sont retrouvés dans des enzymes permettant respectivement de synthétiser (diguanylate cyclase, DGC) ou dégrader (phosphodiestérase, PDE) le di-GMP cyclique, un second messager spécifique des bactéries, qui participe au contrôle de fonctions clés comme la virulence ou la mobilité. L. pneumophila Lens possède 22 gènes codant des protéines GGDEF/EAL, et dont la plupart sont exprimés lorsqu’elle est dans sa phase virulente. L’activité enzymatique des 22 protéines « GGDEF/EAL » a été analysée in vitro : sur 10 protéines purifiées, 6 sont des DGC, dont 2 présentes une double activité DGC/PDE. L’inactivation de 5 gènes des 22 gènes et la surexpression de 2 autres entrainent une baisse de la virulence vis-à-vis d’A. castellanii. De plus, nous avons montré que l’activité DGC d’au moins 2 de ces protéines est requise lors du cycle infectieux. Enfin, nous avons décrit un système à deux composants original comprenant l’histidine kinase (HK) Lpl0330, capable de s’autophosphoryler sur un nouveau domaine HisKA, retrouvé dans 64 autres HK potentielles, et Lpl0329, le premier régulateur de réponse à double activité enzymatique caractérisé, dont la phosphorylation conduit à moduler le taux de di‐GMPc en favorisant une de ses deux activités (Levet-Paulo et al., 2011). / Legionella pneumophila is an intracellular pathogen found in aquatic environments where it replicates in protozoan hosts. My objectives were to identify molecular mechanisms that control virulence and multidrug resistance in L. pneumophila, and especially to explore the role of proteins “GGDEF/EAL” in virulence. GGDEF and EAL domains are found in enzymes able to synthesize (diguanylate cyclase, DGC) or degrade (phosphodiesterase, PDE) c-di-GMP, respectively. C-di-GMP is a bacterial second messenger which plays a key role in regulating main functions including motility, and virulence. L. pneumophila Lens contains 22 genes encoding GGDEF/EAL proteins and most of them are expressed simultaneously with genes encoding virulence factors. The enzymatic activities of the 22 GGDEF/EAL proteins of L. pneumophila Lens were assayed in vitro. Among the 10 proteins purified, 6 showed a DGC activity and 2 contained both activities. The role of the GGDEF/EAL proteins of L. pneumophila Lens on virulence was investigated. Inactivation of 5 genes and overexpression of 2 other genes led to a significant decrease in virulence. Moreover, DGC activity of at least two of these proteins is required for bacterial virulence. Finally, an original two-component system was identified comprising Lpl0330, a histidine kinase able to autophosphorylate on a new HisKA domain, and Lpl 0329, a protein with dual in vitro DGC/PDE activity. Phosphorylation of Lpl0329 led to a decrease in its DGC activity only, giving the first example of a bifunctional enzyme which modulates synthesis and turnover of c-di-GMP in response to phosphorylation (Levet-Paulo et al., 2011).

c-di-GMP stellt einen wichtigen Regulator bei der Kontrolle von Motilität, Virulenz und der Biofilmbildung in Bakterien dar. Aufgrund der Vielfalt c-di-GMP-synthetisierender (Diguanylatzyklasen, DGC) bzw. abbauender (Phosphodiesterasen, PDE) Enzyme, c-di-GMP-bindender Effektoren und zellulärer Antworten etablierte sich die Theorie paralleler Regulationsmodule, die sich aus DGC, PDE, Effektor und Zielmolekül zusammensetzen und spezifische Prozesse wie die Cellulose-Synthese kontrollieren. Während die Aktivierung dieser durch c-di-GMP bereits verstanden und damit Effektor und Zielmolekül bekannt sind, konnten dem Modul bisher keine spezifisch wirkenden DGCs und PDEs zugeordnet werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Proteine DgcC und PdeK in E. coli spezifisch auf die Cellulose-Synthese in Makrokolonie-Biofilmen wirken und ein solches c-di-GMP-Modul bilden. Beide sind aktiv an der Umsetzung von c-di-GMP beteiligt und mittels Interaktionen Teil eines Multi-Protein-Komplexes, der auch die Cellulose-Synthase-Einheiten BcsA und BcsB umfasst. Aufgrund dieser Co-Lokalisation können DgcC und PdeK die c-di-GMP-Konzentration in unmittelbarer Umgebung zum c-di-GMP-bindenden Effektor BcsA kontrollieren. DgcC-PdeK somit stellen das erste Regulationsmodul dar, welches durch lokalisierte Synthese und Abbau von c-di-GMP wirkt und dessen Spezifität aufgrund multipler Protein-Interaktionen gewährleistet wird. 2011 kam es in Mitteleuropa zu einem schweren Ausbruch von Shiga-Toxin-produzierenden E. coli O104:H4, in dessen Verlauf fast 4000 Menschen erkrankten und etwa 20% ein Hämolytisch-urämisches Syndrom entwickelten. Die in dieser Arbeit erlangten Ergebnisse legen nahe, dass die einzigartige Kombination aus Toxin-Produktion und Biofilm-assoziierter Eigenschaften – das Potential zur c-di-GMP-Akkumulation (TL Povolotsky), verstärkte CsgD-Synthese und vor allem keine Cellulose-Produktion– möglicherweise zur erhöhten Virulenz dieses E. coli O104:H4 beitragen. / c-di-GMP represents an important regulator in the control of motility, virulence and biofilm formation. Due to the multiplicity of c-di-GMP-forming (diguanylate cyclases, DGCc) and -degrading (phosphodiesterases, PDEs) enzymes, c-di-GMP-binding effectors and cellular outputs, the theory of parallel existing c-di-GMP-regulation modules was established. Such a module consists of a DGC, a PDE, an effector and a target controlling a specific cellular output such as cellulose synthesis. Whereas the activation of cellulose synthesis is well understood, and therefore effector and target molecule are known, so far no DGC or PDE has been associated with the cellulose-specific c-di-GMP-module. Within the framework of this work it was shown that DgcC and PdeK act specifically on the regulation of cellulose synthesis in macrocolony biofilms, thus forming a c-di-GMP module. Both proteins are enzymatically active concerning c-di-GMP metabolism and through protein-interactions part of a multi-protein-complex, which includes the cellulose synthase-subunits BcsA and BcsB, too. Due to this co-localisation DgcC and PdeK can control the c-di-GMP-concentration in close proximity to the c-di-GMP-binding cellulose-synthase BcsA. Therefore, DgcC-PdeK represents the first signalling module, which acts through local c-di-GMP-synthesis and -degradation and controls specifically cellulose because of multiple protein-interactions with the synthase-complex. In 2011 a serious outbreak of shiga toxin producing E. coli O104:H4 occurred in Middle Europe with nearly 4000 patients of whom approximately 20% developing haemolytic uraemic syndrome. The results obtained in this study suggest that a unique combination of shiga toxin production and biofilm-associated properties – the potential of c-di-GMP accumulation (see PhD Thesis T. L. Povolotsky), enhanced CsgD-synthesis at 37°C and especially no cellulose production – potentially contribute to the enhanced virulence of E. coli O104:H4.

Legionella pneumophila est une bactérie aquatique qui prolifère en se répliquant à l’intérieur de cellules amibiennes. Elle peut persister dans ces environnements en vivant en communauté sous forme de biofilms. L’inhalation par l’Homme d’eau contaminée, vaporisée par les réseaux d’eau chaude ou les tours aéro‐réfrigérantes, peut mener à l’infection des macrophages pulmonaires qui se traduit par une grave pneumonie appelée légionellose. Le di‐GMP cyclique (diGMPc) est impliqué, chez diverses espèces bactériennes, dans la transition entre les modes de vie mobiles et sessiles, et chez certains pathogènes, dans la régulation de la virulence. Mon travail de thèse vise à démontrer l’implication des voies de signalisation à diGMPc dans le contrôle de la virulence et de la formation de biofilms par L. pneumophila. Cette implication a été étudiée grâce à l’inactivation systématique de chacun des gènes codant les protéines du métabolisme du diGMPc chez la souche L. pneumophila Lens. Notre étude a révélé que trois de ces protéines, Lpl0780, Lpl0922 et Lpl1118, sont spécifiquement requises pour le contrôle de la virulence et, plus particulièrement, pour la survie précoce lors de l’infection de cellules‐hôtes via l’orchestration de la sécrétion de facteurs de virulence dans la cellule‐hôte. Lpl1118 participerait également à la biogénèse de la vacuole de réplication. Cinq autres de ces protéines sont impliquées dans la régulation de la formation et de l’architecture des biofilms. L’une d’elles est, plus particulièrement, requise pour la formation de biofilms en présence d’oxyde nitrique. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’organisation complexe et spécifique des voies de signalisation à diGMPc chez L. pneumophila et pourraient permettre d’envisager une lutte plus efficace contre ce pathogène / Legionella pneumophila is a bacterium that proliferates in fresh water environments through the replication within amoebas. These bacteria can persist in these environments through biofilm formation. The inhalation of aerosolized contaminated water through hot water systems or cooling towers can induce the infection of human lungs, leading to a severe pneumonia called legionellosis. Cyclic di‐GMP (c‐di‐GMP) in involved, in various bacterial species, in the motility‐to‐sessility transition, and in some pathogens, in virulence control. My work aims to demonstrate the involvement of signaling pathways that use c‐di‐GMP in virulence control and biofilm formation of L. pneumophila. This involvement was investigated by systematically inactivating each gene encoding a c‐di‐GMP‐metabolizing enzyme in L. pneumophila Lens strain. Our work revealed that 3 of these proteins, Lpl0780, Lpl0922 and Lpl1118 are specifically involved in virulence control and, particularly, in the early survival during host cell infection through the orchestration of virulence factors secretion within host cell. Lpl1118 is particularly required for replicative vacuole biogenesis. Five other proteins, participate in the formation and architecture of biofilms. One of them is more specifically involved in biofilm formation in the presence of nitric oxide. These results help to better understand the complexity and the specificity of c‐di‐GMP signaling pathways in L. pneumophila and should allow the exploration of more effective ways to fight this pathogen

Legionella pneumophila est un pathogène intracellulaire, agent de la Légionellose, et dont le réservoir dans l'environnement est constitué d'amibes aquatiques comme Acanthamoeba castellani. Mes objectifs de thèse étaient l'identification de mécanismes moléculaires contrôlant la virulence et la multi-résistance chez L. pneumophila, et en particulier l'exploration du rôle des protéines " GGDEF/EAL ". Les domaines GGDEF et EAL sont retrouvés dans des enzymes permettant respectivement de synthétiser (diguanylate cyclase, DGC) ou dégrader (phosphodiestérase, PDE) le di-GMP cyclique, un second messager spécifique des bactéries, qui participe au contrôle de fonctions clés comme la virulence ou la mobilité. L. pneumophila Lens possède 22 gènes codant des protéines GGDEF/EAL, et dont la plupart sont exprimés lorsqu'elle est dans sa phase virulente. L'activité enzymatique des 22 protéines " GGDEF/EAL " a été analysée in vitro : sur 10 protéines purifiées, 6 sont des DGC, dont 2 présentes une double activité DGC/PDE. L'inactivation de 5 gènes des 22 gènes et la surexpression de 2 autres entrainent une baisse de la virulence vis-à-vis d'A. castellanii. De plus, nous avons montré que l'activité DGC d'au moins 2 de ces protéines est requise lors du cycle infectieux. Enfin, nous avons décrit un système à deux composants original comprenant l'histidine kinase (HK) Lpl0330, capable de s'autophosphoryler sur un nouveau domaine HisKA, retrouvé dans 64 autres HK potentielles, et Lpl0329, le premier régulateur de réponse à double activité enzymatique caractérisé, dont la phosphorylation conduit à moduler le taux de di‐GMPc en favorisant une de ses deux activités (Levet-Paulo et al., 2011).

The second messenger cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP) has been proven to be a central regulator for physiological and metabolic processes including biofilm formation and sessile to motile transitioning (1,2). The synthesis and degradation of c-di-GMP are regulated by GGDEF- respectively EAL-domain proteins. Recently, c-di-GMP has been discovered in the Gram-positive Streptococcus genus including Streptococcus gallolyticus, which showed to have diguanylate cyclase activity (3). Characterisation of the c-di-GMP network in other Streptococcus is of relevance. Hence, the aim of this project was the assessment of the GGDEF- and EAL domains from the animal pathogenic Streptococcus uberis and Streptococcus henryi. In vivo recombination cloning was used for the analysis of the GGDEF, EAL and GGDEF-EAL domain proteins from S. uberis and S. henryi. The cloning was unsuccessful for most of the domain proteins, except, for EAL 2 of S. uberis. However, analysis of the sequencing results for the cloned EAL 2 presented mutations. Further studies testing alternative cloning methods should be applied. Research regarding probiotic streptococci is also of interest. Therefore, isolation of Streptococcus salivarius from human oral samples using Streptococcus Selection Agar was conducted. Isolation of S. salivarius from human saliva and tongue samples was successful using Streptococcus Selection Agar. Other Streptococcus spp., Lactobacillus, Staphylococcus, and additional bacterial species were also isolated.