Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são uma alternativa promissora aos antibiróticos. Os AMPs, compostos de menos de 80 aminoácidos, apresentam caráter anfipático o que lhes dá a capacidade de agir em membranas lipídicas. Podem formar poros na membrana causando morte da célula. Seu espectro de ação é variado, sendo seus alvos bactérias até células de mamíferos. Os AMPs são encontrados em todos os seres vivos, desde bactérias, plantas, insetos e mamíferos, apresentam diferentes estruturas, composição de aminoácidos e agem por diversos mecanismos. Dois peptídeos antimicrobianos têm sido estudados por sua grande eficiência: a Cecropina A, peptídeo não hemolítico e que sofre degradação por proteases, e a Melitina, de grande potencial antimicrobiano, mas que apresenta atividade hemolítica hemólise. Para se obter uma melhor ação terapêutica, foram sintetizados híbridos de Cecropina e Melitina, dentre eles, o BP100, cuja sequência é KKLFKKILKYL-NH2. O BP100, além de atuar sobre a membrana de bactérias causando a sua morte, é pouco hemolítico e possui alta seletividade por membranas carregadas negativamente, o que é característica das membranas bacterianas. Estudamos a interação do BP100 com vesículas unilamelares grandes, LUVs obtidas por extrusão, preparadas com misturas de fosfatidilcolina de ovo (PC) e fosfatidilglicerol (PG) utilizando técnicas de fluorescência, dicroísmo circular, mobilidade eletroforética, espalhamento de luz dinâmico e microscopia óptica (neste caso utilizando-se vesículas gigantes, GUVs), a fim de obter informações sobre o mecanismo de ação do BP100. Nossos resultados mostraram que o BP100 permeabiliza LUVs preparadas com diferentes misturas de PC:PG, mesmo em alta força iônica. A presença de carga negativa nas LUVs aumenta significativamente a atividade do peptídeo enquanto o colesterol diminui a sua atividade. Quanto a sua estrutura secundária, em meio aquoso o BP100 apresentou uma estrutura ao acaso. Na presença de vesículas de PC sua estrutura não apresentou alteração e em vesículas de PC:PG, observou-se estrutura típica de alfa-hélice. Mostrou-se também que as LUVs de PC não se agregam na presença de BP100, mas o peptidio altera a sua mobilidade eletroforética. Nas LUVs contendo PG, entretanto, observou-se agregação e alteração da mobilidade eletroforética, confirmando a forte ligação do BP100 a essas vesículas. A observação direta da ação do BP100 sobre as GUVs preparadas com PC e PC:PG, mostrou que o peptídeo forma agregados na superfície da membrana e diminui o diâmetro das GUVs. Observou-se agregação de vesículas, formação de brotos na superfície das vesículas e, posteriormente, rompimento das mesmas com o vazamento de todo conteúdo interno. O conjunto dos dados obtidos é sugestivo de que o BP100 atua formando estruturas similares a poros na membrana das vesículas, através dos quais o conteúdo interno extravasa. A formação de estrutura em -hélice do BP100 em LUVs contendo PG que deve favorecer estruturação do poro / Antimicrobial peptides (AMPs) have been a promising alternative therapy to antibiotics. These molecules, consisting of less than 80 amino acids, with different structures and amino acids composition, have amphipathic character which gives them the ability to act on lipid bilayers. They act, by different mechanisms, over bacteria to mammal cells. The AMPs are found in all kinds of living creatures, bacteria, plants, insects and mammals. Two important antimicrobial peptides have been studied because of their high efficiency: the Cecropin A, a non-hemolytic peptide which undergoes degradation by proteases, and Melittin, which has high antimicrobial potential but with hemolytic activity. In order to obtain peptides with better therapeutic action, hybrids peptides of Cecropin and Mellitin were synthesized. One of them, BP100, which has the sequence KKLFKKILKYL-NH2, is a target of several studies because it acts on bacteria´s membrane causing it´s death, but do not cause hemolysis and has a high selectivity for negatively charged membranes, characteristic of bacterial membranes. Here we study the properties of BP100 and its interaction with large unilamellar vesicles, LUVs, prepared with egg phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylglycerol (PG) by extrusion. Fluorescence techniques, circular dichroism, CD, electrophoretic mobility, dynamic light scattering and optical microscopy with giant vesicles (GUVs) were used in order to obtain informations about its action mechanisms. Our results showed that BP100 is able to cause leakage of vesicles prepared with different mixtures of PC:PG, even at high ionic strength. The increase in negative charge of the vesicles significantly raises the activity of the peptide whereas the presence of cholesterol decreases its activity. The secondary structure of BP100 was studied by CD technique in water and a random coil structure was observed. In the presence of PC vesicles, BP100 did not change its structure. However, it aquires a typical alpha-helix structure in the presence of negative vesicles of PC:PG. Analysis of hydrodynamic diameter of LUVs in the presence of BP100 showed that BP100 didn\'t cause significant change in PC vesicles diameter but,with anionic vesicles at low ionic strength, large aggregates are formed. BP100 also changed the electrophoretic mobility of both LUVs containing only PC and mixtures of PC:PG, confirming the binding of BP100 at all membranes. The data set obtained is suggestive that BP100 acts binding to the vesicle membrane forming pores through which the internal contents overflows. The negative surface of the vesicle induces BP100 to acquire an α -helix conformation which favors the formation of a pore structure. BP100 also forms aggregates at the membrane surface of giant lipid vesicles (GUVs) and reduce its diameter. Aggregation of vesicles, formation of buds on the vesicle´s surface and finally the rupture and leakage of internal contents was also observed in GUVs of PC and PC:PG

Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são uma alternativa promissora aos antibiróticos. Os AMPs, compostos de menos de 80 aminoácidos, apresentam caráter anfipático o que lhes dá a capacidade de agir em membranas lipídicas. Podem formar poros na membrana causando morte da célula. Seu espectro de ação é variado, sendo seus alvos bactérias até células de mamíferos. Os AMPs são encontrados em todos os seres vivos, desde bactérias, plantas, insetos e mamíferos, apresentam diferentes estruturas, composição de aminoácidos e agem por diversos mecanismos. Dois peptídeos antimicrobianos têm sido estudados por sua grande eficiência: a Cecropina A, peptídeo não hemolítico e que sofre degradação por proteases, e a Melitina, de grande potencial antimicrobiano, mas que apresenta atividade hemolítica hemólise. Para se obter uma melhor ação terapêutica, foram sintetizados híbridos de Cecropina e Melitina, dentre eles, o BP100, cuja sequência é KKLFKKILKYL-NH2. O BP100, além de atuar sobre a membrana de bactérias causando a sua morte, é pouco hemolítico e possui alta seletividade por membranas carregadas negativamente, o que é característica das membranas bacterianas. Estudamos a interação do BP100 com vesículas unilamelares grandes, LUVs obtidas por extrusão, preparadas com misturas de fosfatidilcolina de ovo (PC) e fosfatidilglicerol (PG) utilizando técnicas de fluorescência, dicroísmo circular, mobilidade eletroforética, espalhamento de luz dinâmico e microscopia óptica (neste caso utilizando-se vesículas gigantes, GUVs), a fim de obter informações sobre o mecanismo de ação do BP100. Nossos resultados mostraram que o BP100 permeabiliza LUVs preparadas com diferentes misturas de PC:PG, mesmo em alta força iônica. A presença de carga negativa nas LUVs aumenta significativamente a atividade do peptídeo enquanto o colesterol diminui a sua atividade. Quanto a sua estrutura secundária, em meio aquoso o BP100 apresentou uma estrutura ao acaso. Na presença de vesículas de PC sua estrutura não apresentou alteração e em vesículas de PC:PG, observou-se estrutura típica de alfa-hélice. Mostrou-se também que as LUVs de PC não se agregam na presença de BP100, mas o peptidio altera a sua mobilidade eletroforética. Nas LUVs contendo PG, entretanto, observou-se agregação e alteração da mobilidade eletroforética, confirmando a forte ligação do BP100 a essas vesículas. A observação direta da ação do BP100 sobre as GUVs preparadas com PC e PC:PG, mostrou que o peptídeo forma agregados na superfície da membrana e diminui o diâmetro das GUVs. Observou-se agregação de vesículas, formação de brotos na superfície das vesículas e, posteriormente, rompimento das mesmas com o vazamento de todo conteúdo interno. O conjunto dos dados obtidos é sugestivo de que o BP100 atua formando estruturas similares a poros na membrana das vesículas, através dos quais o conteúdo interno extravasa. A formação de estrutura em -hélice do BP100 em LUVs contendo PG que deve favorecer estruturação do poro / Antimicrobial peptides (AMPs) have been a promising alternative therapy to antibiotics. These molecules, consisting of less than 80 amino acids, with different structures and amino acids composition, have amphipathic character which gives them the ability to act on lipid bilayers. They act, by different mechanisms, over bacteria to mammal cells. The AMPs are found in all kinds of living creatures, bacteria, plants, insects and mammals. Two important antimicrobial peptides have been studied because of their high efficiency: the Cecropin A, a non-hemolytic peptide which undergoes degradation by proteases, and Melittin, which has high antimicrobial potential but with hemolytic activity. In order to obtain peptides with better therapeutic action, hybrids peptides of Cecropin and Mellitin were synthesized. One of them, BP100, which has the sequence KKLFKKILKYL-NH2, is a target of several studies because it acts on bacteria´s membrane causing it´s death, but do not cause hemolysis and has a high selectivity for negatively charged membranes, characteristic of bacterial membranes. Here we study the properties of BP100 and its interaction with large unilamellar vesicles, LUVs, prepared with egg phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylglycerol (PG) by extrusion. Fluorescence techniques, circular dichroism, CD, electrophoretic mobility, dynamic light scattering and optical microscopy with giant vesicles (GUVs) were used in order to obtain informations about its action mechanisms. Our results showed that BP100 is able to cause leakage of vesicles prepared with different mixtures of PC:PG, even at high ionic strength. The increase in negative charge of the vesicles significantly raises the activity of the peptide whereas the presence of cholesterol decreases its activity. The secondary structure of BP100 was studied by CD technique in water and a random coil structure was observed. In the presence of PC vesicles, BP100 did not change its structure. However, it aquires a typical alpha-helix structure in the presence of negative vesicles of PC:PG. Analysis of hydrodynamic diameter of LUVs in the presence of BP100 showed that BP100 didn\'t cause significant change in PC vesicles diameter but,with anionic vesicles at low ionic strength, large aggregates are formed. BP100 also changed the electrophoretic mobility of both LUVs containing only PC and mixtures of PC:PG, confirming the binding of BP100 at all membranes. The data set obtained is suggestive that BP100 acts binding to the vesicle membrane forming pores through which the internal contents overflows. The negative surface of the vesicle induces BP100 to acquire an α -helix conformation which favors the formation of a pore structure. BP100 also forms aggregates at the membrane surface of giant lipid vesicles (GUVs) and reduce its diameter. Aggregation of vesicles, formation of buds on the vesicle´s surface and finally the rupture and leakage of internal contents was also observed in GUVs of PC and PC:PG

Le transport intracellulaire met en jeu des vésicules et nécessite ainsi des modifications de la membrane plasmique. En particulier, des nanotubes de membrane de quelques dizaines de nanomètres peuvent se former. Nous avons mis en place un système biomimétique à base de liposomes pour décrypter les mécanismes de changement de forme membranaire, en particulier sous l’action du cytosquelette d’actine. La physique des tubes de membrane est bien connue, notamment la force nécessaire au maintien de ce type de tube, qui dépend de l’élasticité de courbure du liposome et de sa tension de membrane imposée par l’aspiration d’une micropipette. En utilisant une diode quatre quadrants, nous avons atteint une résolution temporelle de l’ordre de 4 µs, et une résolution en termes de force plus précise que le pN. Ce montage permet pour la première fois d’étudier les fluctuations de tels tubes. Cette thèse ouvre la voie à l’étude des effets de la polymérisation d’actine sur ces nanotubes / Intracellular transport involves membrane compartments and thus requires dynamic changes in the morphology of cell membranes. In this case, membrane tubes are formed whose radius is of the order of several tens of nanometers. We develop biomimetic systems based on model lipid membranes to decipher the mechanisms of membrane remodelling in particular under the action of the actin cytoskeleton. The mechanics of membrane nanotubes, especially the force needed to form and maintain a nanotube, are now well understood. The force depends on the curvature elasticity of the membrane and on its mechanical tension that is controlled in our experiment by micropipette aspiration. By using a four-quadrant diode, we obtain an unprecedented temporal resolution, in the order of 4 µs, and a force resolution under pN. This setup allows us to access unrivaled membrane nanotube properties.This thesis paves the way for studying the effect of actin dynamics on membrane nanotubes

L'obésité est une maladie définie par une accumulation de masse grasse dans le tissu adipeux ayant des conséquences néfastes pour la santé. Les causes de l’obésité sont multiples. Dans un travail récent, il y a été démontré le rôle de la pollution environnementale dans la prise de poids. Dans ce travail, les hypothèses selon lesquelles les récepteurs adrénergiques situés à la surface des cellules adipeuses seraient le siège de l’action des polluants aromatiques polycycliques ont été vérifiées par le dosage de plusieurs agonistes et antagonistes spécifiques et non spécifiques en présence ou non du benzo[a]pyrène sur des récepteurs humains et de cellules d’hamster chinois (CHO). Les quantités d’AMPc obtenues montrent que les HAP ne se déposent pas sur les récepteurs β1, β2, β3 adrénergiques.Cette accumulation se fait au niveau des phospholipides de la membrane cytoplasmique des cellules. Ce qui cause une rigidité des membranes.Cette observation tend à renforcer l'hypothèse selon laquelle le benzo[a]pyrène induirait une inhibition de la lipolyse par l'accumulation au niveau de la bicouche de phospholipides et des changements de conformation de la bicouche de phospholipides dans les environs des récepteurs à sept domaines transmembranaires qui sont β-adrénergiques.La liaison de la bicouche phospholipidique avec les HAP utilisés est une réaction exothermi-que avec un faible dégagement de chaleur / Obesity is a disease defined by an accumulation of fat in adipose tissue with adverse consequences for health. The causes of obesity are many.In recent work, there was demonstrated the role of environmental pollution in weight gain.In this work, the assumptions that the adrenergic receptors on the surface of fat cells would home to the accumulation of polycyclic aromatic pollutants have been verified by measurement of several agonists and antagonists specific and non-specific in the presence or absence of benzo[a]pyrene receptors on human cells and Chinese hamster (CHO). The amounts of cAMP obtained showed that PAHs are not deposited on β-receptors, β1, β2, β3 adrenergic receptors.This accumulation occurs at the cytoplasmic membrane phospholipids of the cells. What cau-ses stiffness of the membranes. This observation tends to reinforce the hypothesis that benzo [a]pyrene induce an inhibition of lipolysis by the accumulation in the phospholipid bilayer and conformational changes of the bilayer phospholipids in the vicinity of receptors seven transmembrane domains which are β-adrenergic receptors

Neste trabalho investigamos efeitos de fotoirradiação e toxinas sob membranas celulares miméticas. Foram utilizadas, como modelo de membranas lipídicas, vesiculas unilamelares gigantes (GUVs) compostas pro lipídeos oxidados e não oxidados observadas por microscopia ótica de contraste de fase. Inicialmente estudamos a foto-resposta de membranas compostas por POPC e POPG dispersas em solução contendo azul de metileno (MB). Na sequência, estudamos o efeito de toxinas formadoras de poros, Esticolisina I (ST I) e Esticolisina II (ST II), em membranas contendo lipídeos oxidados e não oxidados. Os resultados de MB (10 µM) disperso em solução de membranas compostas por POPC e o lipídeo aniônico POPG indicaram que o aumento da densidade de carga negativa nas membranas das GUVs, que favorece a ligação da moléculas positivamente carregadas como MB nas membranas, tem como consequência um aumento de permeabilidade da membrana muito mais rápído em relação a membranas compostas apenas por POPC. Isto se deve ao fato que a localização preferencial do MB na membrana de POPC:POPG favorece a formação de oxigênio singlete próximo a dupla ligação da cadeia alquílica, dando início a reação de peroxidação lipídica de maneira mais efetiva que em membrana de POPC. Os resultados da ação das toxinas STI e STII (21 nM) em GUVs contendo lipídeos não oxidados PC e esfingomielina evidenciam que apenas STII é capaz de permear estas membranas a esta concentração. Mais ainda, nossos resultados sugerem que a existência de separação de fases fluida-gel na bicamada lipidica composta por PC:SM (razão molar 1:1) favorece a ação da toxina StII. Ao analisarmos membranas contendo lipídeos hidroperoxidados (POPC-OOH) dispersas em solução contendo STII (21 nM) observamos um aumento de permeabilidade na membrana num conjunto de GUVs, associado a formação de poros, apenas em bicamadas lipídicas formadas por misturas de lipídeos oxidados (POPC) e não oxidados (POPC-OOH). Quanto maior a concentração de lipídeos oxidados na membrana mais rapidamente ocorre o aumento de permeabilidade. / In this work we investigate the effects of photoirradiation and toxins on mimetic cell membranes. As a model of lipid membranes, giant unilamellar vesicles (GUVs) composed of oxidized and oxidized pro-lipids were observed by optical phase contrast microscopy. Initially we studied the photo-response of membranes composed of POPC and POPG dispersed in solution containing methylene blue (MB). Following, we studied the effect of pore-forming toxins, Sticolysin I (ST I) and Sticolysin II (ST II), on membranes containing oxidized and non-oxidized lipids. The results of MB (10 M) dispersed in solution of membranes composed of POPC and the anionic lipid POPG indicated that the increase in the negative charge density in the membranes of GUVs, which favors the binding of positively charged molecules as MB in the membranes, consequently increases membrane permeability in regard to membranes composed only of POPC. This is due to the fact that the preferred location of the MB in the POPC: POPG membrane favors the formation of singlet oxygen near the double bond of the alkyl chain, initiating the lipid peroxidation reaction more effectively than in the POPC membrane. The results of the action of the STI and STII toxins (21 nM) on GUVs containing non oxidised lipids PC and sphingomyelin show that only STII is able to permeate these membranes at this concentration. Moreover, our results suggest that the existence of fluid-gel phase separation in the lipid bilayer composed of PC:SM (molar ratio 1:1) favors the action of the StII toxin. When analyzing membranes containing hydroperoxidized lipids (POPC-OOH) dispersed in solution containing STII (21 nM) we observed an increase in membrane permeability in a set of GUVs, associated with pore formation, only in lipid bilayers formed by mixtures of oxidized lipids (POPC-OOH) and non-oxidized ones. The higher the concentration of oxidized lipids in the membrane, the faster the permeability increases.

Neste trabalho investigamos efeitos de fotoirradiação e toxinas sob membranas celulares miméticas. Foram utilizadas, como modelo de membranas lipídicas, vesiculas unilamelares gigantes (GUVs) compostas pro lipídeos oxidados e não oxidados observadas por microscopia ótica de contraste de fase. Inicialmente estudamos a foto-resposta de membranas compostas por POPC e POPG dispersas em solução contendo azul de metileno (MB). Na sequência, estudamos o efeito de toxinas formadoras de poros, Esticolisina I (ST I) e Esticolisina II (ST II), em membranas contendo lipídeos oxidados e não oxidados. Os resultados de MB (10 µM) disperso em solução de membranas compostas por POPC e o lipídeo aniônico POPG indicaram que o aumento da densidade de carga negativa nas membranas das GUVs, que favorece a ligação da moléculas positivamente carregadas como MB nas membranas, tem como consequência um aumento de permeabilidade da membrana muito mais rápído em relação a membranas compostas apenas por POPC. Isto se deve ao fato que a localização preferencial do MB na membrana de POPC:POPG favorece a formação de oxigênio singlete próximo a dupla ligação da cadeia alquílica, dando início a reação de peroxidação lipídica de maneira mais efetiva que em membrana de POPC. Os resultados da ação das toxinas STI e STII (21 nM) em GUVs contendo lipídeos não oxidados PC e esfingomielina evidenciam que apenas STII é capaz de permear estas membranas a esta concentração. Mais ainda, nossos resultados sugerem que a existência de separação de fases fluida-gel na bicamada lipidica composta por PC:SM (razão molar 1:1) favorece a ação da toxina StII. Ao analisarmos membranas contendo lipídeos hidroperoxidados (POPC-OOH) dispersas em solução contendo STII (21 nM) observamos um aumento de permeabilidade na membrana num conjunto de GUVs, associado a formação de poros, apenas em bicamadas lipídicas formadas por misturas de lipídeos oxidados (POPC) e não oxidados (POPC-OOH). Quanto maior a concentração de lipídeos oxidados na membrana mais rapidamente ocorre o aumento de permeabilidade. / In this work we investigate the effects of photoirradiation and toxins on mimetic cell membranes. As a model of lipid membranes, giant unilamellar vesicles (GUVs) composed of oxidized and oxidized pro-lipids were observed by optical phase contrast microscopy. Initially we studied the photo-response of membranes composed of POPC and POPG dispersed in solution containing methylene blue (MB). Following, we studied the effect of pore-forming toxins, Sticolysin I (ST I) and Sticolysin II (ST II), on membranes containing oxidized and non-oxidized lipids. The results of MB (10 M) dispersed in solution of membranes composed of POPC and the anionic lipid POPG indicated that the increase in the negative charge density in the membranes of GUVs, which favors the binding of positively charged molecules as MB in the membranes, consequently increases membrane permeability in regard to membranes composed only of POPC. This is due to the fact that the preferred location of the MB in the POPC: POPG membrane favors the formation of singlet oxygen near the double bond of the alkyl chain, initiating the lipid peroxidation reaction more effectively than in the POPC membrane. The results of the action of the STI and STII toxins (21 nM) on GUVs containing non oxidised lipids PC and sphingomyelin show that only STII is able to permeate these membranes at this concentration. Moreover, our results suggest that the existence of fluid-gel phase separation in the lipid bilayer composed of PC:SM (molar ratio 1:1) favors the action of the StII toxin. When analyzing membranes containing hydroperoxidized lipids (POPC-OOH) dispersed in solution containing STII (21 nM) we observed an increase in membrane permeability in a set of GUVs, associated with pore formation, only in lipid bilayers formed by mixtures of oxidized lipids (POPC-OOH) and non-oxidized ones. The higher the concentration of oxidized lipids in the membrane, the faster the permeability increases.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:32Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00399a.pdf: 1787027 bytes, checksum: 6cb684251c1894e3685b611ace5c9056 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:32Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00399a.pdf: 1787027 bytes, checksum: 6cb684251c1894e3685b611ace5c9056 (MD5) Publico-00399b.pdf: 1285455 bytes, checksum: 52050426f68cebcd4b7e00081ce49a38 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:32Z : No. of bitstreams: 3 Publico-00399a.pdf: 1787027 bytes, checksum: 6cb684251c1894e3685b611ace5c9056 (MD5) Publico-00399b.pdf: 1285455 bytes, checksum: 52050426f68cebcd4b7e00081ce49a38 (MD5) Publico-00399c.pdf: 2029206 bytes, checksum: 480bbfb2deea834d9cc92a52def4805e (MD5) / A gomesina (Gm) é um potente peptídeo antimicrobiano catiônico. Este peptídeo e seu análogo linear [Ser2,6,11,15]-Gm, com menor atividade lítica, foram sintetizados pela metodologia da fase sólida, empregando-se a estratégia t-Boc. Neste estudo, investigamos a interação da Gm e da [Ser2,6,11,15]-Gm com vesículas unilamelares gigantes (GUVs), compostas por membranas lipídicas de POPC ou POPC/POPG, através de microscopias óticas de contraste de fase e fluorescência. As análises se dividiram em duas diferentes partes. Na primeira, observou-se o efeito da injeção de uma solução peptídica, com micropipeta, na vizinhança das GUVs. Como resultado da interação peptídeo/lipídio, as GUVs foram desestabilizadas e romperam-se rapidamente, sem observação de formação de poros estáveis durante todo o experimento. Nos estudos controles, em ausência de peptídeo, as GUVs não romperam de forma espontânea. Peptídeos marcados com a sonda fluorescente rodamina (Rh) foram injetados e mostram que a Gm primeiramente acumula-se na superfície da vesícula, na qual, então, pequenas partículas de alto-contraste são formadas e ocorre, eventualmente, a destruição das GUVs. Este fato leva-nos a especular que a Gm rompe as membranas via modo carpete. Na segunda parte, uma solução contendo GUVs foi misturada a crescentes concentrações peptídicas para quantificação da ação lítica destes peptídeos em vesículas de diferentes composições lipídicas. O efeito de atividade lítica observado foi maior que 90% em baixas concentrações tanto de Gm quanto de [Ser2,6,11,15]-Gm em GUVs compostas de POPC, lipídio eletricamente neutro, e de uma mistura de POPG, negativamente carregados, a POPC em diferentes proporções. Estudos conformacionais foram feitos por duas técnicas espectroscópicas distintas: dicroísmo circular (CD) e fluorescência. A Gm e seu análogo linear aparentemente interagiram com as cargas negativas de SDS nas concentrações acima e abaixo da CMC. Os espectros de CD da [Ser2,6,11,15]-Gm em água apresentaram uma banda fortemente negativa em 198 nm, indicando tratar-se de uma estrutura desordenada, como esperado para peptídeos livres em solução, e não de uma dobra beta como apresentada pela Gm. A partir dos resultados obtidos, foi possível concluir que ambos os peptídeos analisados interagem com vesículas compostas por fosfolipídios e induzem o vazamento de seu conteúdo interno dependentemente da carga de membrana destas, o que corrobora estudos prévios que sugerem que as interações eletrostáticas com a bicamada lipídica dos micro-organismos representam um importante papel no mecanismo de ação da Gm. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Il est difficile d'étudier in vivo le rôle de la membrane dans l'excitabilité des cellules car les paramètres pertinents (composition et état mécanique de la membrane, densité de canaux...) sont activement régulés par la cellule elle-même et donc difficilement ajustables expérimentalement. J'ai donc développé une méthode pour reconstituer un canal voltage-dépendant dans une membrane où ces paramètres peuvent être contrôlés. Pour cela j'ai exprimé, purifié et marqué KvAP, un canal potassique voltage-dépendant. J'ai ensuite adapté une méthode existante pour le reconstituer dans des Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs). J'ai mesuré la densité des canaux dans les GUVs grâce à la microscopie confocale. Des expériences d'électrophysiologie ont, de plus, montré que le canal reste fonctionnel après reconstitution. Ce système m'a permis d'étudier tout d'abord l'affinité du canal pour les membranes courbées. Pour cela, j'ai tiré des nanotubes de rayon contrôlé à partir de ces GUVs et j'ai mesuré la distribution du canal entre la vésicule et le tube par microscopie confocale. J'ai montré que le canal est enrichi dans le tube proportionnellement à sa courbure. Ce résultat est en accord avec une théorie basée sur l'élasticité de la membrane. Nous avons également étudié l'effet du confinement de la membrane sur la diffusion de KvAP. Par des expériences de suivi de particule unique, nous avons montré que le coefficient de diffusion le long du tube diminue d'un facteur 3 lorsque le rayon du tube décroît de 250 à 10 nm. Ce résultat est en accord avec le modèle hydrodynamique de Saffman et Delbrück appliqué à la géométrie cylindrique.

Submitted by Mateus Dassie Maximino (mateusmaximino23@gmail.com) on 2018-04-23T13:55:51Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado - Mateus Dassie Maximino.pdf: 5933036 bytes, checksum: 96040f746ca01578e5036f01f3d89e6e (MD5) / Approved for entry into archive by Claudia Adriana Spindola null (claudia@fct.unesp.br) on 2018-04-23T14:37:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 maximino_md_me_prud.pdf: 5933036 bytes, checksum: 96040f746ca01578e5036f01f3d89e6e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T14:37:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 maximino_md_me_prud.pdf: 5933036 bytes, checksum: 96040f746ca01578e5036f01f3d89e6e (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho trata do estudo da interação entre os poluentes emergentes amoxicilina (AMX) e azul de metileno (AM) com modelos-simples de membrana biológica compostas de fosfolipídios zwiteriônicos (DPPC e DOPC), através de filmes de Langmuir e vesículas unilamelares gigantes (GUVs). As membranas foram expostas aos poluentes de forma individual e também misturados (MIX) para que se aproximasse de uma situação real, neste caso, o chamado efeito coquetel, no qual os poluentes são encontrados misturados no ambiente. O objetivo principal foi investigar as possíveis interações entre os poluentes e os fosfolipídios e os consequentes efeitos nas membranas. Nos filmes de Langmuir, as isotermas π-A (pressão superficial por área molecular média) de DPPC revelaram que a AMX e o AM são expulsos da interface ar-água conforme a fase condensada é atingida. O DOPC demonstrou ser menos afetado pela AMX, uma vez que a isoterma não apresentou deslocamento. Contudo, o DOPC se mostrou mais susceptível a interagir com o AM, visto que um deslocamento significativo foi observado. Para ambos os lipídios a MIX causou maiores efeitos, evidenciados por deslocamentos maiores nas isotermas. Análises de módulo compressional mostraram um pequeno aumento na fluidez do filme de DPPC, não observado para o DOPC. As medidas de microscopia de ângulo de Brewster (BAM) na presença dos poluentes revelaram mudanças na morfologia dos filmes, afetando a formação dos domínios de DPPC e impedindo a formação dos mesmos nas monocamadas de DOPC. Os espectros de PMIRRAS para o DPPC indicaram possíveis interações eletrostáticas dos poluentes com a cabeça polar do lipídio, assim como uma desordem na região da sua cauda apolar. A monocamada de DOPC foi bastante afetada pois ocorreram mudanças nas vibrações de quase todos os grupos químicos do lipídio, apresentando inclusive mudanças na região da cauda do lipídio. Os espectros de emissão da sonda LAURDAN nas LUVs revelaram um aumento da rigidez para ambos os lipídios, diferentemente do observado pelas análises de elasticidade da monocamada de Langmuir. As GUVs para ambos os fosfolipídios, ao contrário das monocamadas, apresentaram maior efeito sobre os poluentes aplicados de forma individual, visto que para os poluentes avaliados individualmente foram observados a perda de contraste de fase para os lipídios na presença do AM, assim como mudanças na estabilidade para as GUVs de DOPC em AMX. Tais efeitos não foram observados para a MIX, devido as diferenças estruturais dos modelos de membrana. / The present work is about the interaction between the emerging pollutants amoxicillin (AMX) and methylene blue (MB), with biological membrane models of zwitterionic phospholipids (DPPC and DOPC), through Langmuir films and giant unilamellar vesicles (GUVs). The membrane was exposed to the presence of the pollutants individually, still being performed the analysis with the mixture (MIX) of both in order to get closer to a real situation, in which the pollutants are found mixed in the environment. The main goal was to investigate the possible interactions between the pollutants and phospholipids. The π-A (surface pressure by mean molecular area) isotherms of DPPC reveal that in the condensed phase the lipid expelled the AMX and MB of the air-water interface. The DOPC showed to be less affected by the AMX, once the isotherm did not present a displacement. However, the DOPC showed to be more susceptible to interact with the MB, since significant displacements were observed. In both lipids, the MIX showed to be more effective, causing bigger displacements. The analysis of compressional modulus showed a small increase of the fluidity of the DPPC film, which was not observed to the DOPC. The Brewster Angle Microscopy (BAM) measurements in the presence of the pollutants revealed changes in the morphology, affecting the domains formation of DPPC and inhibiting the formation of the same in monolayers. The PM-IRRAS specters to the DPPC indicated possible electrostatic interactions with the head, as well as a disorder in the tail. The DOPC monolayer was quite affected because there have been changes in almost all chemical groups of lipid, including changes in the tail region of the lipid. The emission spectrum from the dye LAURDAN in the LUVs revealed an increase in the rigidity for both lipids, different from the observed in the analysis of elasticity in the Langmuir monolayers. The GUVs for both phospholipids, unlike the monolayers, showed a major effect on the pollutants applied individually since that were observed losses of phase contrast for the lipids in the presence of MB, such as changes in the stability of the DOPC GUVs in AMX. Such effects were not observed in the MIX, due to the structural differences in the membrane models.