A técnica de aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som (TUGA) foi utilizada pela primeira vez em reprodução assistida de eqüinos em 1992 e desde então vem sendo aperfeiçoada. Com o crescente interesse nos procedimentos de transferência de oócitos (TO), transferência de gametas intrafallopiana (GIFT) e mais recentemente na transferência nuclear (TN), a recuperação de oócitos de boa qualidade tornou-se um passo fundamental do processo. Diversas técnicas e equipamentos podem ser empregados com esta finalidade. Os experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a taxa de recuperação de oócitos de folículos pré-ovulatórios de cinco protocolos de punções. Dois níveis de pressão negativa: Baixa (B) (150 – 200 mmHg) e Alta (A) (250 – 300 mmHg) e três modelos de agulha: curta 14 G (C14); curta 18 G (C18) e longa 18 G (L18) foram testados. Cinqüenta e quatro folículos de 48 éguas foram aspirados. Estes animais foram distribuídos completamente ao acaso em cinco grupos experimentais (G) GI: (B-C14) (n=22); GII: (B-L18) (n=3); GIII: (B-L18) (n=18); GIV: (A-C18) (n=5); GV: (A-L18) (n=6). Vinte e duas éguas receberam 2500 UI de hCG, 14 tiveram seus folículos aspirados e 2 oócitos foram recuperados (14,3%) Dos 54 folículos aspirados, 4 oócitos foram recuperados (7,41%): GI (n=1), GIII (n=1) e GIV (n=2). Três destes oócitos foram transferidos para o oviduto de éguas receptoras através das técnicas de GIFT (n=2) e TO (n=1). Não foi observado desenvolvimento embrionário nas receptoras nos 14, 15 e 16 dias pós-transferência.

A técnica de aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som (TUGA) foi utilizada pela primeira vez em reprodução assistida de eqüinos em 1992 e desde então vem sendo aperfeiçoada. Com o crescente interesse nos procedimentos de transferência de oócitos (TO), transferência de gametas intrafallopiana (GIFT) e mais recentemente na transferência nuclear (TN), a recuperação de oócitos de boa qualidade tornou-se um passo fundamental do processo. Diversas técnicas e equipamentos podem ser empregados com esta finalidade. Os experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a taxa de recuperação de oócitos de folículos pré-ovulatórios de cinco protocolos de punções. Dois níveis de pressão negativa: Baixa (B) (150 – 200 mmHg) e Alta (A) (250 – 300 mmHg) e três modelos de agulha: curta 14 G (C14); curta 18 G (C18) e longa 18 G (L18) foram testados. Cinqüenta e quatro folículos de 48 éguas foram aspirados. Estes animais foram distribuídos completamente ao acaso em cinco grupos experimentais (G) GI: (B-C14) (n=22); GII: (B-L18) (n=3); GIII: (B-L18) (n=18); GIV: (A-C18) (n=5); GV: (A-L18) (n=6). Vinte e duas éguas receberam 2500 UI de hCG, 14 tiveram seus folículos aspirados e 2 oócitos foram recuperados (14,3%) Dos 54 folículos aspirados, 4 oócitos foram recuperados (7,41%): GI (n=1), GIII (n=1) e GIV (n=2). Três destes oócitos foram transferidos para o oviduto de éguas receptoras através das técnicas de GIFT (n=2) e TO (n=1). Não foi observado desenvolvimento embrionário nas receptoras nos 14, 15 e 16 dias pós-transferência.

A técnica de aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som (TUGA) foi utilizada pela primeira vez em reprodução assistida de eqüinos em 1992 e desde então vem sendo aperfeiçoada. Com o crescente interesse nos procedimentos de transferência de oócitos (TO), transferência de gametas intrafallopiana (GIFT) e mais recentemente na transferência nuclear (TN), a recuperação de oócitos de boa qualidade tornou-se um passo fundamental do processo. Diversas técnicas e equipamentos podem ser empregados com esta finalidade. Os experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a taxa de recuperação de oócitos de folículos pré-ovulatórios de cinco protocolos de punções. Dois níveis de pressão negativa: Baixa (B) (150 – 200 mmHg) e Alta (A) (250 – 300 mmHg) e três modelos de agulha: curta 14 G (C14); curta 18 G (C18) e longa 18 G (L18) foram testados. Cinqüenta e quatro folículos de 48 éguas foram aspirados. Estes animais foram distribuídos completamente ao acaso em cinco grupos experimentais (G) GI: (B-C14) (n=22); GII: (B-L18) (n=3); GIII: (B-L18) (n=18); GIV: (A-C18) (n=5); GV: (A-L18) (n=6). Vinte e duas éguas receberam 2500 UI de hCG, 14 tiveram seus folículos aspirados e 2 oócitos foram recuperados (14,3%) Dos 54 folículos aspirados, 4 oócitos foram recuperados (7,41%): GI (n=1), GIII (n=1) e GIV (n=2). Três destes oócitos foram transferidos para o oviduto de éguas receptoras através das técnicas de GIFT (n=2) e TO (n=1). Não foi observado desenvolvimento embrionário nas receptoras nos 14, 15 e 16 dias pós-transferência.

Velho, Ana Luiza Malhado Cazaux de Souza. Estratégias para o estudo de marcadores moleculares da fertilidade em modelos animais: perfil metabolômico do plasma seminal em touros e expressão da integrina subunidade beta 5 no espermatozoide, oócito e embrião bovino. 2017. 107 f. Tese (Tese em Zootecnia) – Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Francisca Gomes (francisbeserra@yahoo.com.br) on 2017-08-14T13:56:09Z No. of bitstreams: 1 2017_Tese_ almcsvelho.pdf: 2322234 bytes, checksum: 1d6b25f3dfd84db9848f1c12ca33f383 (MD5) / Approved for entry into archive by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-08-14T14:21:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_Tese_ almcsvelho.pdf: 2322234 bytes, checksum: 1d6b25f3dfd84db9848f1c12ca33f383 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T14:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_Tese_ almcsvelho.pdf: 2322234 bytes, checksum: 1d6b25f3dfd84db9848f1c12ca33f383 (MD5) Previous issue date: 2017 / Metabolites and proteins including integrins are important in the reproductive physiology of animals and humans. However, seminal plasma metabolites that are associated with bull fertility are still unknown and the possible roles of the integrin subunit beta 5 (ITGβ5) in fertilization and embryonic development of bovine are not yet known. Therefore, the objectives of the present study were (1) to determine comprehensive metabolome of seminal plasma from Holstein bulls with differing fertility scores, and (2) to ascertain potential metabolites as biomarkers associated with bull fertility, (3) to evaluate expression of ITGβ5 in sperm, oocytes and early bovine embryos, and (4) to ascertain the evolutionary conservation of ITGβ5. In the study 1, chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was employed to determine seminal plasma metabolome from 16 Holstein bulls with two fertility scores. Soon after, data were evaluated using multivariate and univariate analyses. Bioinformatics analyzes were performed in order to identify metabolic pathways associated with bull’s seminal plasma metabolites. Our results showed that 63 metabolites were identified in bull seminal plasma. Fructose was the most abundant metabolite detected followed by citric acid, lactic acid, urea, and phosphoric acid. Androstenedione, 4-ketoglucose, D-xylofuranose, 2-oxoglutaric acid and erythronic acid were the least predominant metabolites found in bull’s seminal fluid. PLS-DA showed a distinct separation between high and low fertility bulls as regard to scores plot. Metabolites with the greatest VIP score (VIP > 2) were 2-oxoglutaric acid and fructose. Heat-map analysis based on VIP score and univariate analysis indicated that 2-oxoglutaric acid was less (P = 0.02) and fructose was significantly greater (P = 0.02) in high-fertility bulls as compared to low-fertility bulls. To the best of our knowledge the current study is the first to identify the comprehensive metabolomic profiling of bull seminal plasma with differing fertility score and to present the potential of metabolites such as 2-oxoglutaric acid and fructose as biomarkers of bull fertility using GC-MS. In the study 2, expression levels of ITGβ5 protein in bull sperm were evaluated by western blotting. Real time-qPCR was carried out to evaluate the expression levels of ITGβ5 transcripts in oocytes and embryos from bovine species. In addition, bioinformatic tools were performed to determine to evolutionary conservation of ITGβ5 across species. Western blotting results showed the presence of ITGβ5 on bull spermatozoa. Moreover, RT-qPCR results demonstrated that ITGβ5 is present in bovine oocytes and that ITGβ5 levels were significantly higher in 2-cell embryos and 8-16 cell embryos. Bioinformatics analyses showed that ITGβ5 is conserved across species. Therefore, our results showed the presence of ITGβ5 in spermatozoa as well as oocytes and embryos in early stages of development, suggesting an important role of ITGβ5 upon fecundation and early embryo development in the bovine species. / Os metabólitos e as proteínas, incluindo as integrinas, são importantes na fisiologia reprodutiva de animais e seres humanos. Entretanto, ainda são desconhecidos os metabólitos do plasma seminal que estão associados com a fertilidade de touros e ainda não se sabe os possíveis papéis da integrina subunidade beta 5 (ITGβ5) na fecundação e no desenvolvimento embrionário de bovinos. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram: (1) determinar o metaboloma do plasma seminal de touros com diferentes escores de fertilidades, (2) identificar metabólitos que demonstram ser potenciais marcadores de fertilidade em touros, (3) avaliar a expressão da ITGβ5 em espermatozoides, oócitos e embriões bovinos em fases iniciais de desenvolvimento e, (4) verificar a conservação evolutiva da ITGβ5 por meio de ferramentas de bioinformática. No estudo 1 foi utilizada a técnica de cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas (CG-EM) para determinar o metaboloma do plasma seminal de 16 touros com alta e baixa fertilidade. Em seguida, os dados foram submetidos a análise estatística multivariada e univariada. A partir destes resultados, análises de bioinformática foram realizadas a fim de identificar as vias metabólicas associadas com o metaboloma do plasma seminal desses touros. Sessenta e três metabólitos foram identificados no plasma seminal de touros com diferentes escores de fertilidade. A frutose foi detectada como o metabólito mais abundante, seguido pelo ácido cítrico, ácido lático, ureia e ácido fosfórico. Já androstenediona, 4-cetoglicose, D-xilofuranose, ácido 2-oxoglutárico e o ácido eritrônico foram os metabólitos menos abundantes do fluído seminal de touros. A Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) revelou uma separação distinta entre os touros de alta e de baixa fertilidade. Os metabólitos com as maiores pontuações de Importância da Variável na Projeção (VIP > 2) foram o ácido 2-oxoglutárico e a frutose. A análise do mapa de calor (heatmap), com base na pontuação de VIP, e as análises univariadas indicaram que o ácido 2-oxoglutárico foi significativamente menor (P = 0,02) e a frutose foi significativamente maior (P = 0,02) em touros de alta fertilidade comparados aos touros de baixa fertilidade. O presente estudo foi o primeiro a identificar o perfil metabolômico do plasma seminal de touros empregando a CG-EM e o primeiro a mostrar o ácido 2-oxoglutárico e a frutose como potenciais biomarcadores de fertilidade em touros. No estudo 2, os níveis de expressão da proteína ITGβ5 em espermatozoide de touros foi avaliada pela técnica de western blotting. A reação de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi empregada para avaliar os níveis de expressão de transcritos da ITGβ5 em oócitos e embriões bovinos. Além disso, ferramentas de bioinformática foram utilizadas com o intuito de determinar a conservação evolutiva da proteína ITGβ5 entre várias espécies. Os resultados do western blotting confirmaram a presença da proteína ITGβ5 em espermatozoides de touros e, com base nas análises de RT-qPCR, foi observado que a ITGβ5 está presente nos óocitos e que os níveis dela são significativamente mais elevados nos embriões bovinos de 2 células, seguidos pelos embriões de 8-16 células. As análises de bioinformática mostraram que a ITGβ5 é conservada em várias espécies. Desta forma, nossos resultados demonstram a presença da ITGβ5 em espermatozoides, bem como em oócitos e embriões bovinos em estágios iniciais se desenvolvimento, sugerindo um importante papel da ITGβ5 na fecundação e no desenvolvimento embrionário inicial desta espécie.

Orientador: Henrique Nunes de [UNESP] Oliveira / Coorientador: Camila Urbano Braz / Banca: Maria Eugênia Zerlotti Mercadante / banca: Lucia Galvão de Albuquerque / Resumo: Com o avanço dos estudos em genética e da tecnologia aplicada à genotipagem de marcadores moleculares, a identificação de polimorfismos associados às características de interesse econômico se tornou mais acessível, possibilitando a sua utilização aumentar a acurácia de modelos de predição do mérito genético dos animais. Esse avanço também possibilitou aumentar a acurácia dos estudos para identificação de QTLs para características de interesse econômico. Entretanto, os marcadores comumente utilizados para tal fim são os SNPs, que por serem bi-alélicos podem não ser muito eficientes na identificação dos QTLs. Os haplótipos, multi-alélicos, apresentam maior possibilidade de estarem em desequilíbrios de ligação (DL) com os QTLs. Dessa forma, objetivou-se no presente trabalho identificar o melhor método de construção de haplótipos para utilização em estudos de detecção de QTLs, a partir da comparação dos três métodos mais comumente utilizados para este fim. Foram utilizadas três populações simuladas representando características com três diferentes valores de herdabilidade, para as quais foram armazenados os dados fenotípicos, genotípicos e de pedigree dos 6.000 animais da população mais recente: Pop1 com herdabilidade baixa (0,10); Pop2 com herdabilidade moderada (0,25); e, Pop3 com herdabilidade alta (0,35). Os genomas simulados consistiram de 750.000 marcadores do tipo SNP, e 750 QTLs, com dois a quatro alelos, dispostos aleatoriamente em 29 cromossomos com tamanho total de 2.3... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: With the advancement of genetic studies and the technology applied to the genotyping of molecular markers, the identification of polymorphisms associated with the characteristics of economic interest became more accessible, allowing its use to increase the accuracy of prediction models of the genetic merit of the animals. This advance also made it possible to increase the accuracy of studies to identify QTLs for characteristics of economic interest. However, the commonly used markers for this purpose are SNPs, which because they are bi-allelic may not be very efficient in identifying QTLs. The haplotypes, multi-allelic, are more likely to be in linkage disequilibrium (LD) with QTLs. Thus, the objective of this work was to identify the best haplotype construction method for use in QTLs detection studies, by comparing the three methods most commonly used for this purpose. Three simulated populations representing characteristics with three different heritability values were used for which the phenotypic, genotypic and pedigree data of the 6,000 animals were stored: Pop1 with low heritability (0.10); Pop2 with moderate heritability (0.25); and, Pop3 with high heritability (0.35). The simulated genomes consisted of 750,000 SNP-type markers, and 750 QTLs, with two to four alleles, arranged randomly on 29 chromosomes with a total size of 2,333 centimorgans (cM). From the simulation the SNPs whose frequency of the lowest allele was less than 0.1 were eliminated, leaving 576,027, 577,... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Elizabeth Romagosa / Banca: Laura Helena Orfão / Banca: Luis David Solis Murgas / Banca: Marcos Weingartner / Banca: Adilson Reidel / Resumo: O objetivo do trabalho foi de adaptar metodologias de análises espermáticas e aprimorar o processo de fertilização artificial e condições de estocagem de gametas de surubim-do-paraiba, Steindachneridion parahybae: espécie de peixe criticamente ameaçada de extinção. Para tanto, foram realizados quatro ensaios experimentais: (1) validação de método e avaliação dos parâmetros espermáticos por meio de software livre. (2) determinação da dose inseminante e volume de água empregados na fertilização artificial; (3) estocagem de ovócitos in natura em quatro temperaturas ao longo de 355 minutos; (4) estocagem do sêmen in natura em quatro temperaturas ao longo 112h. Observou-se que o método de análise espermática utilizando o software de código aberto ImageJ/plugin CASA é uma ferramenta eficiente, exata, objetiva e barata, além de possibilitar uma nova perspectiva de análises em peixes nativos. As configurações estabelecidas no presente trabalho poderão servir de base para novos trabalhos relacionados às análises espermáticas do surubim-do-paraíba, bem como de outras espécies. Verificou-se que a quantidade de espermatozóides e o volume de água interferem diretamente no procedimento de fertilização artificial, com melhores resultados na utilização de 5,5×106 espermatozóides ovócito-1 e 1,0mL de água g-1 de ovócitos. Foi observado que a estocagem de ovócitos e sêmen de forma in natura não é recomendada em ambientes com temperaturas superiores a 25ºC e inferiores a 15ºC. Temperaturas intermediárias (15-25ºC) possibilitam melhores condições e prolongam a qualidade dos gametas, entretanto, recomenda-se em procedimentos de fertilização artificial da espécie, a coleta do sêmen antes que os ovócitos. Os resultados obtidos no presente trabalho além de proporcionarem aumento das... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim was to adapt methodologies of sperm analysis and to improve the artificial fertilization process and gamete storage conditions of surubim-of-paraiba, Steindachneridion parahybae: critically endangered fish species. So that, four experimental tests were performed: (1) validation of method and evaluation of sperm parameters using free software. (2) determination of the inseminating dose and water volume used in artificial fertilization, (3) storage of fresh oocytes into four temperatures over 355 minutes, (4) storage of fresh semen into four temperatures over 112h. It was observed that the sperm analysis method using open source software ImageJ/plugin CASA is an effective tool, accurate, objective and inexpensive, besides enables a new perspective of the analysis on the native fish. The settings established in this study could serve as a basis for further work related at sperm analysis of surubim-do-paraiba and other species. It was found that sperm quantity and water volume interfere directly in the procedure of artificial fertilization, with improved results on usage of 5.5×106 spermatozoa oocyte-1 and 1.0 ml of water g-1 of oocyte. It was observed that the fresh oocytes and sperm storage is not recommended in environments with temperatures above 25ºC and below 15ºC. Intermediate temperatures (15-25ºC) enable better results and prolong the gametes quality, however, it is recommended in the artificial fertilization procedures the semen collection before the oocytes. The results obtained in this study providing increased rates of fertilization and hatching, besides to allow gametes optimization through of the utilization of controlled manner, and with satisfactory quality for more time after collection. Besides, these results provide a basis for future research, contributing to the... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Estudos taxonômicos foram conduzidos em onufídeos coletados na Baía do Araçá, em São Sebastião, litoral norte do estado de São Paulo, utilizando dados morfológicos e moleculares, e se confirmou que os espécimes coletados pertencem à espécie Diopatra neapolitana, originalmente descrita para o Golfo de Nápoles (Mar Mediterrâneo). Com a identidade específica dos animais confirmada, foi conduzido um estudo anual, com coletas mensais visando entender o ciclo reprodutivo a partir dos gametas femininos presentes no celoma, concluindo que, os indivíduos brasileiros possuem reprodução assíncrona, com o ciclo reprodutivo regido mais pelo tamanho de cada animal, do que pelos meses do ano. O estudo anual focou também na espermatogênese destes animais, que é caracterizada pela presença do citóforo, comum a outras espécies de poliquetas. Observou-se, entretanto, que a espermiogênese possui dois caminhos possíveis: formação de mórulas espermáticas e maturação do espermatozoide na própria estrutura unida pelo citóforo. Foi estudado o hermafroditismo sequencial desta espécie, caracterizado pelas papilas espermoducais, que para os indivíduos da Baía do Araçá, apresentam diferentes estágios de maturação, podendo representar as passagens de um gênero sexual para outro. Por fim foi estudado o desenvolvimento larval e dispersão de gametas, a partir de fertilizações in vitro, com registro de todos os estágios larvais para a espécie estudada, além da construção de protocolos importantes para a biologia do desenvolvimento / Taxonomic studies were conducted with onuphids collected at Araçá Bay, located in São Sebastião, in the northern coast of the state of São Paulo, using morphological and molecular data, and it is confirmed that these specimens belong to the species Diopatra neapolitana, which type locality is the Gulf of Napoli. After confirming the species identity, an annual study was conducted, with mensal collects of specimens, aiming to understand the reproductive cycle, based on feminine gametes present on each celom, and the conclusion is that for the Brazilian specimen, the reproduction is asynchronous, with the reproductive cycle guided rather by the size of each animal, than by the months. The annual study also focused on the spermatogenesis, which is characterized by the presence of the cytophore, common on other polychaete species, however, the spermiogenesis can be accomplished by two paths: formation of spermatic morulae or maturation of spermatozoa linked in the cytophore structure. The sequential hermaphroditism, characterized by the presence of spermoducal papillae, was also studied, and, for the specimen of the Araçá Bay, there are different maturation stages for this feature, probably related to the transition from one gender to another. Lastly, the larval development and gametes dispersion were studied, using in vitro> fertilizations, registering all larval stages for the present species, as well as the origination of development biology protocols

A melatonina é um antioxidante muito eficaz e protege as células contra o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas, e indiretamente, modula a expressão de genes associados ao ciclo celular, metabolismo oxidativo e apoptose celular. Deste modo, a suplementação da melatonina ao meio de maturação in vitro, a torna uma alternativa para promover melhorias na viabilidade das células germinativas e embrionárias. O estudo 1 avaliou o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação por meio da maturação nuclear (progressão meiótica) e citoplasmática (migração de grânulos corticais) e dos níveis de ROS em oócitos suínos maturados in vitro. A suplementação do meio de maturação com melatonina estimulou a progressão da meiose, a migração de grânulos corticais e reduziu os níveis intracelulares de ROS nos oócitos. O estudo 2 avaliou o efeito da melatonina na expressão de genes antioxidantes (Catalase, SOD1, SOD2 e GPX) envolvidos na proteção celular de oócitos e células do cumulus. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou positivamente a expressão dos genes antioxidantes nos oócitos e células do cumulus. O estudo 3 avaliou o efeito da melatonina nos processos biológicos por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, em células do cumulus oriundas de oócitos suínos maturados in vitro. A partir da análise de expressão diferencial foi possível identificar que a adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 80 genes associados a nove processos biológicos (ciclo celular; proteólise; organização de citoesqueleto; via energética; adesão e transporte celular; via de sinalização; fator de transcrição; metabolismo oxidativo e apoptose; e componente celular). A suplementação do meio de maturação com melatonina potencialmente influencia a viabilidade e o funcionamento celular, uma vez que modulou a expressão de genes associados à processos fisiológicos essenciais, tais como: divisão celular, metabolismo energético e oxidativo, vias de sinalização e apoptose. O estudo 4, avaliou o efeito da melatonina sobre os genes associados à viabilidade oocitária e o subsequente desenvolvimento embrionário por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, de células do cumulus oriundas de oócitos suínos. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 59 genes associados a nove funções biológicas (expansão do cumulus, comunicação em COCs, maturação nuclear, maturação citoplasmática, reparo e integridade do DNA, viabilidade oocitária, esteroidogênese, fertilização e embriogênese). Em conclusão, a suplementação do meio de maturação com melatonina influencia positivamente a maturação oócitária, reduz os níveis intracelulares de ROS, aumenta a expressão de genes antioxidantes, em adição, interfere no transcriptoma de um número expressivo de genes associados à aquisição da competência oócitária, da viabilidade embrionária e desenvolvimento subsequente. / Melatonin is a very effective antioxidant and protects cells against oxidative stress caused by reactive species, and indirectly modulates expression of genes associated with cell cycle, oxidative metabolism, and apoptosis. Thus, melatonin supplementation to in vitro maturation media becomes an alternative to improve the viability of germ and embryonic cells. The first study assessed the effects of adding melatonin to the maturation medium on nuclear (meiotic progression) and cytoplasmic (cortical granules migration) maturation and ROS levels in in vitro matured porcine cumulus-oocyte complexes (COCs). Melatonin supplementation stimulated meiosis progression and cortical granules migration, and reduced intracellular ROS levels in oocytes. The second study evaluated the effects of melatonin on the expression of antioxidant genes (Catalase, SOD1, SOD2, and GPX) involved in cellular protection in oocytes and cumulus cells. The addition of melatonin to the maturation medium positivity influence the expression of antioxidant genes in oocytes and cumulus cells. The third study evaluated the effect of melatonin on genes associated with biological processes through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs in vitro matured. Melatonin addition to maturation medium differentially affected expression of 80 genes associated with nine biological processes (cell cycle, proteolysis, cytoskeletal organization, energy pathaway, cell adhesion and transport, signalling pathway, transcription factor, oxidative metabolism and apoptosis, and cell components). The fourth study assessed the effect of melatonin on genes associated with oocyte viability and subsequent embryo development through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs. Melatonin in the maturation medium affected 59 genes associated with nine biological functions related with oocyte viability and embryo development (cumulus expansion, communication between cumulus cells and oocytes, nuclear maturation, cytoplasmic maturation, DNA repair and integrity, oocyte viability, steroidogenesis, fertilization and embryogenesis). In conclusion, supplementation of melatonin to maturation environment influences oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, reduces intracellular ROS levels, positivity influence the expression of antioxidant and also interferes in the transcriptome of a significant number of genes associated with oocyte competence acquisition, embryo viability and subsequent development.

Orientador: Cynthia Peralta de Almeida Prado / Coorientador: Fernando José Zara / Banca: Ana Cristina Prado Veiga-Menoncello / Banca: Cinthia Aguierre Brasileiro / Resumo: As espécies da subfamília Leptodactylinae apresentam grande diversidade de modos reprodutivos, acompanhada de diferentes estratégias reprodutivas, dentre elas os acasalamentos poliândricos. A análise da morfologia de gônadas e espermatozoides em um contexto filogenético é uma importante ferramenta para se compreender a evolução desta estratégia reprodutiva alternativa em anuros. Assim, neste estudo descrevemos a morfologia e ultraestrutura de espermatozoides de 11 espécies de Leptodactylus e de Lithodytes lineatus, bem como investigamos as relações entre as características das gônadas e espermatozoides em espécies poliândricas e não poliândricas de Leptodactylus, utilizando métodos comparativos filogenéticos. Nossa análise ultraestrutural mostrou que os espermatozoides dos leptodactilíneos são semelhantes aos de outros anuros. As principais diferenças ocorreram na região do complexo acrossomal. Além disso, detectamos dois tipos morfologicamente distintos de espermatozoide, sendo um deles observado em todas as espécies poliândricas analisadas. As espécies poliândricas de Leptodactylus apresentaram maior comprimento e densidade de espermatozoides, além de maior massa relativa de testículo e diâmetro do túbulo seminífero em comparação com as não poliândricas. O teste de correlação de caracteres evolutivos mostrou que estas características, todas com valores acima da média, foram correlacionados com a ocorrência de poliandria no gênero. Dessa forma, nossos resultados sugerem que a competição de esperma em espécies de Leptodactylus exerce importante pressão de seleção, levando, principalmente, a um aumento no tamanho e densidade de espermatozoides e aumento no investimento em gônadas, provavelmente como forma de aumentar o sucesso de fertilização dos machos / Abstract: Species in the subfamily Leptodactylinae exhibit a great diversity of reproductive modes and adopt different reproductive strategies, including polyandrous matings. The analysis of the gonad and sperm morphology in a phylogenetic context is crucial to understand the evolution of this alternative reproductive strategy in anurans. Here, we describe the sperm morphology and ultraestructure of 11 Leptodactylus species and that of Lithodytes lineatus and investigated the relationship between gonad and sperm morphology in polyandrous and non polyandrous Leptodactylus species using phylogenetic comparative methods. Our analysis revealed that the sperm ultraestructure of the leptodactylines was very similar to that of other anurans. The main differences occurred at the acrosomal complex region. Furthermore, we detected two distinct sperm morphotypes, one of them observed in all polyandrous species analyzed. Polyandrous Leptodactylus species produced larger sperm at higher densities and presented larger relative testes mass and seminiferous tubules compared to non polyandrous species. The correlated character evolution test showed that these gonad and sperm traits, all with values above the mean, correlated with the presence of polyandry in the genus. Thus, our results suggest that the sperm competition is an important selective pressure, leading to an increase in sperm size and density in Leptodactylus males, also increasing gonad mass allocation, probably as a way to increase fertilization success / Mestre

Orientador: Laura Satiko Okada Nakaghi / Coorientador: George Shigueki Yasui / Banca: Carlos Alberto Vicentini / Banca: José Augusto Senhorini / Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos básicos dos gametas e o desenvolvimento inicial de Astyanax altiparanae, para futura aplicação na área de biotecnologia, incluindo manipulação cromossômica de embriões. No Capítulo I, os ovócitos foram analisados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e a dose inseminante foi determinada. O sêmen também foi coletado e analisado com sistema de análise computadorizada (CASA). A dose inseminante reduzida encontrada para a espécie foi explicada pela morfologia dos ovócitos através de análise em MEV, que revelou vilosidades que cercam a micrópila relacionadas à orientação do esperma para a fecundação. No capítulo II, vários parâmetros relacionados com a fertilização foram descritos, incluindo a extrusão do segundo corpúsculo polar, a fusão dos pronúcleos e a formação do cone de fertilização. Além disso, o efeito de três temperaturas (22°C, 26°C e 30°C) sobre os estádios de desenvolvimento foi determinado. A extrusão do segundo corpúsculo polar ocorreu em 4-6 minutos pós-fertilização (mpf), e os pronúcleos fundiram-se com 8-10 mpf. O espermatozoide apresentou uma cabeça esférica, peça intermediária e flagelo. Como esperado, as temperaturas mais elevadas deram origem a um desenvolvimento e incubação mais rápidos. As informações obtidas neste estudo irão abrir novas possibilidades no campo da manipulação cromossômica de embriões, incluindo poliploidia, quimerismo, transgenia e outras técnicas / Abstract: The aim of this study was to study basic aspects of gametes and early development of yellowtail tetra Astyanax altiparanae, for future application in biotechnology including chromosome and embryo manipulation. In Chapter I, the oocytes were analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and the insemination dose was determined. Semen was also collected and analyzed using a Computer Assisted Sperm Analysis (CASA). Such a reduced inseminating dose was explained by oocyte morphology because SEM analysis revealed villosities surrounding the micropyle that is related to the sperm guidance for fertilization. In addition, the duration of sperm motility was longer in comparison to most teleosts, what may improve fertilization ability. In Chapter II, several parameters related with fertilization were described, including the second polar body extrusion, fusion of the pronuclei and the formation of the fertilization cone. Moreover, the effect of three temperatures (22°C, 26°C and 30°C) on developmental stages was determined. 2nd polar body was extruded at 4-6 minutes post fertilization (mpf), and the pronuclei were formed at 8-10 mpf. The sperm showed a spherical head, midpiece and flagellum. As expected, higher temperatures gave rise to faster development and hatching. The information obtained in this study will open new possibilities in the field of chromosome and embryo manipulation including poliploidy, chimerism, transgenesis and other techniques / Mestre