Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 1998. / Spine title: Regulations of epididymal GGT gene. Includes bibliographical references (p. 177-211). Also available online through Digital Dissertations.

Mit vorliegender Arbeit wurde die Aussagekraft der gamma-Glutamyltransferase (GGT) im Serum des Rindes geprüft. Anhand der Krankheitsbilder von 1128 Rinderpatienten der Medizinischen Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig der letzten sieben Jahre und eines breiten Untersuchungsspektrums zum Fett- und Leberstoffwechsel, Parametern zur Beurteilung des Nieren- und Muskelstoffwechsels, sowie dem Blutbild, der Blutgasanalyse, den Elektrolyten, Mengen- und Spurenelementen wurde untersucht, welche Parameter Beziehungen zur Aktivitätshöhe der GGT haben. Zusätzlich erfolgten Untersuchungen zum Verlauf der Enzymaktivität, der prognostischen Aussagekraft und anhand einer lebergesunden Population von 1450 Rindern die Einschätzung eines Referenzwertes der GGT. Der in der Humanmedizin nachgewiesene Einfluss, einer Vielzahl von extrahepato-biliären Erkrankungen und Parametern auf die Aktivitätshöhe der GGT, konnte in den Untersuchungen dieser Studie am Rind nicht bestätigt werden. Die GGT korrelierte hoch signifikant (p£ 0,01) mit den untersuchten Leberparametern [Glutamat-dehydrogenase (GLDH), Aspartataminotransferase (AST), Alkalische Phosphatase (AP) und Gesamtbilirubin], der Beurteilung der Gallenblase intra operationem sowie dem cholestaseinduzierenden Krankheitsbild der rechten Labmagenverlagerung (LMV). Nur geringe Bezüge ließen sich zu den anderen Parametern der klinisch-chemischen Serumanalyse, des Blutbildes und der Blutgase sowie Erkrankungen anderer Organsysteme errechnen. Somit kann die Leberspezifität der GGT in der Buiatrik und ihre Funktion als cholestaseanzeigendes Enzym bestätigt werden. Untersuchungen zur Aussage des Enzyms über den Gesamtlipidgehalt der Leber erfolgten anhand der Auswertung von Leberbioptaten, mittels Kupfersulfat-Schwimmtest und durch pathohistologische Untersuchung. Eine Korrelation der gamma-GT mit dem Gesamtlipidgehalt der Leber konnte mit r= 0,45 bzw. r= 0,39 statistisch signifikant (p£ 0,01) nachgewiesen werden. Ein schneller, hochgradiger Anstieg des Enzyms, der nach Therapie auch schnell wieder absank, sprach für Enzyminduktion durch Cholestase, wie sie auch das Krankheitsbild der rechten LMV verursacht. Langsame Anstiege, wie sie in der Literatur beschrieben worden sind, scheinen auf Leberzellschäden unterschiedlicher Genese hinzudeuten. Ein Absinken der Enzymaktivität in den Referenzbereich, erfolgte in solchen Fällen im Median nach fünfeinhalb Wochen. Die durch periphere Insulinresistenz induzierten Hyperglycämien scheinen aufgrund des verzögerten Enzymanstieges nicht mit der Höhe der GGT-Aktivität zu korrelieren. Eine generelle prognostische Aussagekraft konnte der GGT nicht nachgewiesen werden. Die Aktivitäten der Eingangsuntersuchungen von Patienten mit exitus letalis unterschieden sich nicht statistisch signifikant von den Aktivitäten der überlebenden Rinder. Auch aus den Verlaufs- und Enduntersuchungen konnten keine Aussagen quo ad vitam getroffen werden. Patienten, die eine rechte LMV aufwiesen und mit einer hochgradigen Erhöhung der GGT vorgestellt wurden, waren prognostisch schlechter zu bewerten, als Rinder mit dem gleichen Krankheitsbild und einer niedri-geren Enzymaktivität. Bei Patienten mit linker LMV und solchen ohne LMV ergab sich in der Regel, unabhängig vom Ausgang, ein Anstieg der Enzymaktivität im Verlauf des stationären Aufenthaltes. Ein Referenzwert der GGT-Aktivität im Serum des Rindes konnte anhand einer lebergesunden Population bei 30 U/l ermittelt werden. 80 % der Leberbiopsien wiesen eine Leberverfettung auf, davon 50 % eine mittel- oder hochgradige. Eine prognostische Aussagekraft des Grades der Leberverfettung quo ad vitam konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden. Die Aussagekraft der untersuchten Leberenzyme zum Verfettungsgrad der Leber waren statistisch hoch signifikant (p£ 0,01) mit Korrelationskoeffizienten der AST mit r= 0,71, der GLDH mit r= 0,59, dem Gesamtbilirubin mit r= 0,43 und der AP mit r= 0,39. Schlussfolgerungen: Die GGT-Aktivität im Serum des Rindes kann (unter Berücksichtigung des herabgesetzten Referenzwertes) aufgrund der nachgewiesenen Spezifität und Sensitivität bei hepatobiliären Erkrankungen, durchaus als eine diagnostische Bereicherung im buiatrischen Lebersuchprogramm angesehen werden. Die Enzymaktivität korrelierte zwar mit dem Grad der intrahepatischen Lipidakkumulation, aufgrund des perakuten bis akuten Geschehens bei Kühen, konnten im Gegensatz zur Humanmedizin, latente Leberveränderungen nicht sicher diagnostiziert werden. Für die Therapie und Prognose wird sich (außer bei der rechten LMV) kaum ein Nutzen aus der Bestimmung der GGT-Aktivität im Serum des Rindes ziehen lassen.

Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2002. / Dateien im PDF-Format

Mit vorliegender Arbeit wurde die Aussagekraft der gamma-Glutamyltransferase (GGT) im Serum des Rindes geprüft. Anhand der Krankheitsbilder von 1128 Rinderpatienten der Medizinischen Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig der letzten sieben Jahre und eines breiten Untersuchungsspektrums zum Fett- und Leberstoffwechsel, Parametern zur Beurteilung des Nieren- und Muskelstoffwechsels, sowie dem Blutbild, der Blutgasanalyse, den Elektrolyten, Mengen- und Spurenelementen wurde untersucht, welche Parameter Beziehungen zur Aktivitätshöhe der GGT haben. Zusätzlich erfolgten Untersuchungen zum Verlauf der Enzymaktivität, der prognostischen Aussagekraft und anhand einer lebergesunden Population von 1450 Rindern die Einschätzung eines Referenzwertes der GGT. Der in der Humanmedizin nachgewiesene Einfluss, einer Vielzahl von extrahepato-biliären Erkrankungen und Parametern auf die Aktivitätshöhe der GGT, konnte in den Untersuchungen dieser Studie am Rind nicht bestätigt werden. Die GGT korrelierte hoch signifikant (p£ 0,01) mit den untersuchten Leberparametern [Glutamat-dehydrogenase (GLDH), Aspartataminotransferase (AST), Alkalische Phosphatase (AP) und Gesamtbilirubin], der Beurteilung der Gallenblase intra operationem sowie dem cholestaseinduzierenden Krankheitsbild der rechten Labmagenverlagerung (LMV). Nur geringe Bezüge ließen sich zu den anderen Parametern der klinisch-chemischen Serumanalyse, des Blutbildes und der Blutgase sowie Erkrankungen anderer Organsysteme errechnen. Somit kann die Leberspezifität der GGT in der Buiatrik und ihre Funktion als cholestaseanzeigendes Enzym bestätigt werden. Untersuchungen zur Aussage des Enzyms über den Gesamtlipidgehalt der Leber erfolgten anhand der Auswertung von Leberbioptaten, mittels Kupfersulfat-Schwimmtest und durch pathohistologische Untersuchung. Eine Korrelation der gamma-GT mit dem Gesamtlipidgehalt der Leber konnte mit r= 0,45 bzw. r= 0,39 statistisch signifikant (p£ 0,01) nachgewiesen werden. Ein schneller, hochgradiger Anstieg des Enzyms, der nach Therapie auch schnell wieder absank, sprach für Enzyminduktion durch Cholestase, wie sie auch das Krankheitsbild der rechten LMV verursacht. Langsame Anstiege, wie sie in der Literatur beschrieben worden sind, scheinen auf Leberzellschäden unterschiedlicher Genese hinzudeuten. Ein Absinken der Enzymaktivität in den Referenzbereich, erfolgte in solchen Fällen im Median nach fünfeinhalb Wochen. Die durch periphere Insulinresistenz induzierten Hyperglycämien scheinen aufgrund des verzögerten Enzymanstieges nicht mit der Höhe der GGT-Aktivität zu korrelieren. Eine generelle prognostische Aussagekraft konnte der GGT nicht nachgewiesen werden. Die Aktivitäten der Eingangsuntersuchungen von Patienten mit exitus letalis unterschieden sich nicht statistisch signifikant von den Aktivitäten der überlebenden Rinder. Auch aus den Verlaufs- und Enduntersuchungen konnten keine Aussagen quo ad vitam getroffen werden. Patienten, die eine rechte LMV aufwiesen und mit einer hochgradigen Erhöhung der GGT vorgestellt wurden, waren prognostisch schlechter zu bewerten, als Rinder mit dem gleichen Krankheitsbild und einer niedri-geren Enzymaktivität. Bei Patienten mit linker LMV und solchen ohne LMV ergab sich in der Regel, unabhängig vom Ausgang, ein Anstieg der Enzymaktivität im Verlauf des stationären Aufenthaltes. Ein Referenzwert der GGT-Aktivität im Serum des Rindes konnte anhand einer lebergesunden Population bei 30 U/l ermittelt werden. 80 % der Leberbiopsien wiesen eine Leberverfettung auf, davon 50 % eine mittel- oder hochgradige. Eine prognostische Aussagekraft des Grades der Leberverfettung quo ad vitam konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden. Die Aussagekraft der untersuchten Leberenzyme zum Verfettungsgrad der Leber waren statistisch hoch signifikant (p£ 0,01) mit Korrelationskoeffizienten der AST mit r= 0,71, der GLDH mit r= 0,59, dem Gesamtbilirubin mit r= 0,43 und der AP mit r= 0,39. Schlussfolgerungen: Die GGT-Aktivität im Serum des Rindes kann (unter Berücksichtigung des herabgesetzten Referenzwertes) aufgrund der nachgewiesenen Spezifität und Sensitivität bei hepatobiliären Erkrankungen, durchaus als eine diagnostische Bereicherung im buiatrischen Lebersuchprogramm angesehen werden. Die Enzymaktivität korrelierte zwar mit dem Grad der intrahepatischen Lipidakkumulation, aufgrund des perakuten bis akuten Geschehens bei Kühen, konnten im Gegensatz zur Humanmedizin, latente Leberveränderungen nicht sicher diagnostiziert werden. Für die Therapie und Prognose wird sich (außer bei der rechten LMV) kaum ein Nutzen aus der Bestimmung der GGT-Aktivität im Serum des Rindes ziehen lassen.

Site-directed bioorthogonal conjugation techniques have substantially advanced research in numerous areas. Their exceptional value reflects in the extent of applications, that have been realized with spacial-controlled bioorthogonal reactions. Specific labeling of surfaces, proteins, and other biomolecule allows for new generations of drug delivery, tracking, and analyzing systems. With the continuous advance and refinement of available methods, this field of research will become even more relevant in the time to come. Yet, as individual as the desired purpose is, as different can be the most suitable modification strategy. In this thesis, two different bioconjugation approaches, namely CuAAC and factor XIIIa mediated ligation, are used in distinct application fields, featuring eGFP as a model protein showcasing the advantages as well as the challenges of each technique. The introduction of a unique accessible functionality is the most critical feature of a site-specific reaction, and the first considerable hurdle to clear. While most surfaces, peptides, or small molecules might require less expenditure to modulate, equipping large biomolecules like proteins with additional traits requires careful consideration to preserve the molecule’s stability and function. Therefore, the first section of this project comprises the engineering of eGFP via rational design. Initially, wild-type eGFP was subcloned, expressed, and characterized to serve as a reference value for the designed variants. Subsequently, eGFP was mutated and expressed to display a recognition site for factor XIIIa. Additionally, a second mutant harbored a TAG-codon to enable amber codon suppression and consequently the incorporation of the alkyne bearing unnatural amino acid Plk to support a CuAAC reaction. Fluorescence spectroscopy was used to confirm that the fluorescent properties of all expressed muteins were identically equal to wild-type eGFP, which is a reliable marker for the intact barrel structure of the protein. Trypsin digestion and HPLC were deployed to confirm each protein variant's correct sequence and mass. The second part of this work focuses on the conjugation of cargo molecules deploying the chosen approaches. Solid-phase peptide synthesis was used to create a peptide that served as a lysine donor substrate in the crosslinking mechanism of FXIIIa. Additionally, the peptide was provided with a cysteine moiety to allow for highly flexible and simple loading of desired cargo molecules via conventional thiol-Michael addition, thus establishing an adaptive labeling platform. The effective ligation was critically reviewed and confirmed by monitoring the exact mass changes by HPLC. Protocols for attaching payloads such as biotin and PEG to the linker peptide were elaborated. While the biotin construct was successfully conjugated to the model protein, the eGFP-PEG linkage was not achieved judging by SDS-PAGE analysis. Furthermore, featuring isolated peptide sequences, the properties of the FXIIIa-mediated reaction were characterized in detail. Relative substrate turnover, saturation concentrations, by-product formation, and incubation time were comprehensively analyzed through HPLC to identify optimal reaction conditions. CuAAC was successfully used to label the Plk-eGFP mutein with Azide-biotin, demonstrated by western blot imaging. Within the last part of this study, the application of the conjugation systems was extended to different surfaces. As regular surfaces do not allow for immediate decoration, supplementary functionalization techniques like gold-thiol interaction and silanization on metal oxides were deployed. That way gold-segmented nanowires and Janus particles were loaded with enoxaparin and DNA, respectively. Nickel and cobalt nanowires were modified with silanes that served as linker molecules for subsequent small molecule attachment or PEGylation. Finally, the eGFP muteins were bound to a particle surface in a site-specific manner. Beads displaying amino groups were utilized to demonstrate the effective use of FXIIIa in surface modification. Moreover, the bead’s functional moieties were converted to azides to enable CuAAC “Click Chemistry” and direct comparison. Each modification was analyzed and confirmed through fluorescence microscopy. / Techniken zur ortsspezifischen bioorthogonalen Konjugation von Biomolekülen haben die Forschung in zahlreichen Bereichen erheblich vorangebracht. Ihr außerordentlicher Wert spiegelt sich in der Vielzahl der Anwendungen wider, die mit bioorthogonalen Reaktionen realisiert werden konnten. Die kontrollierte Bestückung von Oberflächen, Proteinen und anderen Biomolekülen ermöglicht neue Generationen von Systemen zur Arzneimittelapplikation als auch zu Tracking- und Analyseverfahren. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung und Verfeinerung der verfügbaren Methoden wird dieses Forschungsgebiet in Zukunft noch mehr an Bedeutung gewinnen. Doch so individuell wie der gewünschte Zweck ist, so unterschiedlich kann auch die am besten geeignete Modifikationsstrategie sein. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Biokonjugationsansätze, nämlich CuAAC und Faktor-XIIIa-vermittelte Ligation, in unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt, wobei eGFP als Modellprotein dient, um sowohl die Vorteile als auch die Herausforderungen der jeweiligen Technik aufzuzeigen. Die Einführung einer genau abgrenzbaren Funktionalität ist das wichtigste Merkmal einer ortsspezifischen Reaktion und die erste große Hürde, die es zu nehmen gilt. Während die meisten Oberflächen, Peptide oder kleinen Moleküle mit geringem Aufwand moduliert werden können, erfordert das Ausstatten von Proteinen mit zusätzlichen Merkmalen sorgfältige Überlegung und weitreichende Kenntnis, um die Stabilität und Funktion der Molekülstruktur zu erhalten. Der erste Abschnitt dieses Projekts umfasst daher das Protein-Engineering von eGFP durch rationales Design. Zunächst wurde der Wildtyp von eGFP subkloniert, exprimiert und charakterisiert, um als Referenzwert für die entworfenen Varianten zu dienen. Anschließend wurde eGFP so mutiert und exprimiert, dass es eine Erkennungsstelle für Faktor XIIIa aufweist. Zusätzlich enthielt eine zweite Mutante ein TAG-Codon, um die Unterdrückung des Amber-Codons und damit den Einbau der Alkin-tragenden unnatürlichen Aminosäure Plk zu ermöglichen, um wiederum eine CuAAC-Reaktion zu unterstützen. Mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie wurde bestätigt, dass die Fluoreszenzeigenschaften aller exprimierten Muteine identisch mit denen des Wildtyps eGFP sind, was ein zuverlässiger Marker für die intakte Barrel-Struktur des Proteins ist. Trypsinverdau und HPLC wurden eingesetzt, um die korrekte Sequenz und Masse der einzelnen Proteinvarianten zu bestätigen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Konjugation von „Cargo-Molekülen“ unter Verwendung der gewählten Ansätze. Mittels Festphasen-Peptidsynthese wurde ein Peptid hergestellt, das als Lysin-Donor-Substrat im Vernetzungsmechanismus von FXIIIa diente. Zusätzlich wurde das Peptid mit einem Cystein-Element versehen, um eine hochflexible und einfache Beladung mit gewünschten Frachtmolekülen durch konventionelle Thiol-Michael-Addition zu ermöglichen und so eine adaptive Koppelungsplattform zu schaffen. Die effektive Ligation wurde durch die Überwachung der genauen Massenänderungen mittels HPLC kritisch überprüft und bestätigt. Es wurden Protokolle für die Anbringung von Nutzlasten wie Biotin und PEG an das Linker-Peptid ausgearbeitet. Während das Biotin-Konstrukt erfolgreich an das Modellprotein konjugiert wurde, konnte die eGFP-PEG-Bindung nach Auswertung der SDS-PAGE-Analyse nicht erreicht werden. Darüber hinaus wurden anhand der isolierten Peptidsequenzen die Eigenschaften der FXIIIa-vermittelten Reaktion im Detail charakterisiert. Relativer Substratumsatz, Sättigungskonzentrationen, Nebenproduktbildung und Inkubationszeit wurden mittels HPLC umfassend analysiert, um optimale Reaktionsbedingungen zu ermitteln. CuAAC wurde erfolgreich zur Markierung des Plk-eGFP-Muteins mit Azid-Biotin eingesetzt, was durch Western-Blot-Darstellung nachgewiesen wurde. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Anwendung der Konjugationssysteme auf verschiedene Oberflächen übertragen. Da normale Oberflächen keine unmittelbare Dekoration erlauben, wurden zusätzliche Funktionalisierungstechniken wie Gold-Thiol-Wechselwirkung und Silanisierung auf Metalloxiden eingesetzt. Auf diese Weise wurden goldsegmentierte Nanowires und Januspartikel mit Enoxaparin bzw. DNA beladen. Nickel- und Kobalt-Nanowires wurden mit Silanen modifiziert, die als Verbindungsmoleküle für die anschließende Anlagerung kleiner Moleküle oder PEGylierung dienten. Schließlich wurden die eGFP-Muteine ortsspezifisch an eine Partikeloberfläche gebunden. Beads mit Aminogruppen wurden verwendet, um den effektiven Einsatz von FXIIIa bei der Oberflächenmodifikation zu demonstrieren. Darüber hinaus wurden die funktionellen Einheiten der Beads in Azide umgewandelt, um eine CuAAC-„Klickchemie" und somit einen direkten Vergleich zu ermöglichen. Jede Modifikation wurde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie analysiert und bestätigt.

Universiẗat, Diss.--Kiel, 2000.

Background: Diabetic nephropathy (DN) is defined as a rise in urinary albumin excretion rate, often associated with an increase in blood pressure. It is the leading cause of end-stage renal disease and carries an increased risk for cardiovascular mortality. Microalbuminuria is the first sign of diabetic renal impairment or incipient nephropathy and is generally considered the best noninvasive predictor for the development of DN. Urinary markers of tubular damage are mainly composed of enzymes or plasma proteins of low molecular weight that are normally freely filtered by the glomerulus, and these biomarkers can be useful for diagnosis of DN. Thus, the aim of this study was to test the diagnostic accuracy of the urinary excretion of gama-glutamyltransferase (GGT) and alkaline phosphatase (ALP) for diagnosis of diabetic nephropathy (DN). Methods: Fasting glucose, fructosamine, serum creatinine, glomerular filtration rate (GFR), serum uric acid, serum albumin, and urinary albumin, creatinine, GGT and ALP were assessed in 74 type 2 diabetic patients without nephropathy and 38 type 2 diabetic patients with nephropathy. Results: Urinary GGT and ALP were threefold higher in type 2 diabetic patients with nephropathy. Significant correlations were observed between urinary albumin and GGT (r=0.439, P<0.001) and urinary albumin and ALP (r=0.305, P<0.01). Areas under the curve for GGT and ALP were 0.7696 (P<0.001) and 0.7233 (P<0.001), respectively. At a cut-off value of 72 U/g creatinine, GGT demonstrated a sensitivity of 96.0% and a specificity of 52.6%. At a cut-off value of 20 U/g creatinine, ALP demonstrated a sensitivity and specificity of 83.8% and 36.8%, respectively. Conclusions: Urinary GGT and ALP have potential value in the diagnosis of nephropathy in type 2 diabetic patients, but GGT has a slightly higher ability to discriminate nephropathy than ALP. / Introdução: A nefropatia diabética (ND) é definida como um aumento na taxa de excreção urinária de albumina, sendo esta frequentemente associada ao aumento da pressão sanguínea. A ND é a principal causa de doença renal em estágio final, estando também associada ao aumento do risco de mortalidade cardiovascular. A microalbuminúria é o primeiro sinal de dano renal ou nefropatia incipiente, sendo geralmente considerado o melhor preditor não-invasivo para o desenvolvimento de ND. Os marcadores urinários de dano tubular são principalmente compostos por enzimas ou proteínas plasmáticas de baixo peso molecular que são normalmente filtradas pelo glomérulo, sendo que estes biomarcadores podem ser úteis para o diagnóstico da ND. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar as características diagnósticas dos níveis urinários de gama-glutamiltransferase (GGT) e fosfatase alcalina (FAL) para o diagnóstico da ND. Métodos: Glicemia de jejum, frutosamina, creatinina sérica, taxa de filtração glomerular (TFG), ácido úrico, albumina, além dos níveis urinários de albumina, GGT e FAL foram mensurados em 74 pacientes diabéticos tipo 2 sem nefropatia e 38 pacientes diabéticos tipo 2 com nefropatia. Resultados: As enzimas GGT e FAL, mensuradas em amostras de urina, foram três vezes mais elevadas nos pacientes diabéticos tipo 2 com nefropatia. Foram observadas correlações significativas entre a albumina urinária e GGT (r=0,439, P<0,001) e albumina urinária e FAL (r=0,305, P<0,01). As áreas sob a curva para GGT e FAL foram 0,7696 (P<0,001) e 0,7233 (P<0,001), respectivamente. Ao considerar o ponto de corte de 72 U/g de creatinina, a GGT demonstrou uma sensibilidade de 96,0% e especificidade de 52,6%. Considerando o ponto de corte de 20 U/g de creatinina, a FAL demonstrou uma sensibilidade e especificidade de 83,8% e 36,8%, respectivamente. Conclusões: As enzimas GGT e FAL mensuradas em amostras de urina apresentaram potencial valor para o diagnóstico de nefropatia em pacientes com diabetes tipo 2, mas a GGT apresentou uma habilidade discretamente superior à FAL nesta diferenciação.

Thesis (Ph.D. (Nutrition))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2009.

Thesis (Ph.D. (Nutrition))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2009.

Thesis (Ph.D. (Nutrition))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2009.