La Drosophile produit des cellules sanguines aussi appelées hémocytes qui se rapprochent fonctionnellement des cellules de la lignée myéloïde des vertébrés. On en dénombre trois sortes : les plasmatocytes qui sont apparentées aux macrophages des vertébrés, les cellules à cristaux, qui participent à la coagulation, et les lamellocytes qui ne sont produits que suite à certains challenges immuns et qui participent à l'encapsulation de corps trop gros pour être phagocytés. Le choix de destin, la prolifération et la différenciation des cellules hématopoïétiques sont contrôlés par plusieurs familles de facteurs de transcription conservés de la Drosophile à l'Homme. En particulier, le gène serpent (srp), codant pour un facteur de transcription de type GATA, joue un rôle majeur à différentes étapes du développement des cellules sanguines embryonnaires et larvaires de la Drosophile. En effet, srp est non seulement requis pour la spécification et le maintien des progéniteurs sanguins (prohémocytes) mais il participe aussi à la différenciation des trois lignages hématopoïétiques. Cette diversité de fonction de Srp est notamment assurée par l'interaction avec d'autres partenaires dont le cofacteur de type FOG (Friend of GATA) U-shaped (Ush) qui participe au contrôle de la différenciation des plasmatocytes et des lamellocytes. Enfin un second facteur de transcription de type GATA, Pannier (Pnr), est quant à lui nécessaire à la différenciation et à la maturation des plasmatocytes. L'objectif de ma thèse est de mieux comprendre la fonction et le mode d'action de ces facteurs GATA et FOG dans le contrôle du développement des cellules sanguines larvaires, et en particulier des lamellocytes. Dans un premier temps, une analyse génétique m'a permis d'identifier des rôles spécifiques pour les deux complexes GATA/FOG, Srp/Ush et Pnr/Ush, dans le processus de formation des hémocytes larvaires circulants. Ainsi, mes résultats suggèrent que : 1) le complexe Srp/Ush réprime la prolifération et la différenciation des hémocytes circulants ; 2) Srp participe à la maturation des lamellocytes ; 3) le complexe Pnr/Ush contrôle le maintien de l'identité des plasmatocytes par répression de leur transdifférentiation en lamellocytes ; 4) le complexe Srp/Ush réprime l'expression de pnr, qui est nécessaire à la maturation des plasmatocytes. Il apparait donc que la combinatoire des trois facteurs Srp, Pnr et Ush régule différentes étapes du développement des cellules sanguines larvaires. Dans un second temps, j'ai cherché à mettre à jour les réseaux géniques contrôlés par ces facteurs. Pour cela, j'ai utilisé une lignée de cellules sanguines d'origine larvaire sur laquelle j'ai réalisé des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP-Seq) contre Srp, Pnr et Ush ainsi que des analyses transcriptomiques (RNA-Seq) en condition normale ou de perte de fonction de ush. Mes analyses montrent notamment que Ush participe à l'activation de l'expression de marqueurs des plasmatocytes comme les gènes codant pour les composants de la matrice extracellulaire et à la répression de l'expression de marqueurs des lamellocytes comme les gènes codant pour les récepteurs de la matrice extracellulaire. Ces analyses montrent aussi que Ush régule l'expression de composants de différentes voies de signalisation impliquées dans la formation des lamellocytes tels que shaggy (voie Wnt), wts (voie Hippo) et pi3k21B (voie mTor). Le cofacteur Ush, au travers de ses interactions avec Srp et Pnr, apparait donc comme un acteur central dans la régulation du destin des plasmatocytes et des lamellocytes au cours de l'hématopoïèse chez la Drosophile. L'ensemble de ces résultats apportent une meilleure compréhension des réseaux géniques mis en œuvre lors de la formation des cellules sanguines et notamment du rôle joué par les facteurs GATA et du cofacteur FOG au cours du processus hématopoïétique. / Drosophila produces blood cells or hemocytes, which are related to the myeloid lineage of vertebrates. There are three kinds of hemocytes: plasmatocytes are phagocytic cells akin to vertebrate macrophages; crystal cells are involved in the clotting process and lamellocytes are produced after immune challenges like wasp infestation in order to encapsulate objects too large to be phagocytized. Different families of transcription factor conserved from Drosophila to Human finely regulate blood cell fate, proliferation and differentiation. For instance, the GATA transcription factor Serpent (Srp), which plays a key role at different steps of embryonic and larval blood cell development in Drosophila. Indeed, srp is not only required for the specification and maintenance of blood cell progenitors (prohemocytes) but it is also involved in the differentiation of the three hemocyte lineages. This functional diversity is ensured in particular by the interaction with other partners such as the Friend of GATA (FOG) co-factor U-shaped (Ush), which is involved in the control of plasmatocytes differentiation into lamellocytes. Moreover, a second GATA factor, Pannier (Pnr) is necessary to plasmatocytes differentiation and maturation. The purpose of my work is to provide a better understanding of the function and mode of action of these two GATA proteins and of their FOG co-factor during Drosophila blood cell development and in particular for lamellocyte production. At first, a genetic analysis allowed us to identify specific role for each GATA / FOG complex in circulating larval hemocytes. Notably my results suggest that 1) the Srp / Ush complex represses hemocytes proliferation and differentiation; 2) Srp alone participates to lamellocytes maturation; 3) the Pnr / Ush complex maintains plasmatocytes identity by repressing their differentiation into lamellocytes; 4) the Srp / Ush complex represses Pnr expression, which is necessary for plasmatocytes maturation. These data indicate that the combinatorial interplay between Srp, Pnr and Ush participates in the fine-tuning of larval blood cell development. Second, I tried to decipher the gene networks regulated by these three factors. To do so, I used an ex vivo cellular model of larval hemocytes to identify Srp, Pnr and Ush direct target genes by chromatin immunoprecipitation (ChIP-Seq) experiments as well as Ush-regulated genes by transcriptomic analyses (RNAseq). My results revealed that Ush participates in the activation of plasmatocytes markers such as extracellular matrix (ECM) components whereas it represses the expression of lamellocytes markers such as ECM receptor. In addition, these analyses allowed us to identify components of different signalling pathway involved in lamellocytes formation that are directly regulated by Ush, including shaggy (Wnt pathway), wts (Hippo pathway) and pi3k21B (mTor pathway). Therefore, it appears that Ush, thanks to its interaction with Srp or Pnr, plays a central role in the regulation of plasmatocyte and lamellocyte fate. All together, these results shed new light on the genetic network involved in blood cell formation and on the role of the GATA / FOG complexes during haematopoiesis.

Cardiovascular diseases are among the leading causes of death in North America. Currently, there are no effective treatment options for directly repairing the damaged myocardial tissue. Therefore, cell-based therapies utilizing cardiomyocytes generated from stem cells to replace necrotic tissue will be a promising approach. However, the molecular mechanisms regulating stem cell differentiation into cardiomyocytes are not fully understood. Since GATA-4 is one of the primary regulators of cradiomyogenesis, we investigated the molecular basis of GATA-4 expression during the early stages of stem cell differentiation. Using chromatin immunoprecipitation, we have observed the direct involvement of p300 in GATA-4 gene expression. We have also examined the importance ofhHistone acetylation and acetyltransferase activity on GATA-4 expression during the early stage of cardiomyogensis using the histone deactylase inhibitor Valproic Acid and the acetyltransferase inhibitor Curcumin respectively.

Ingeniero Civil Mecánico / Las plataformas tipo gata son equipos que apoyan el mantenimiento de molinos de minería. Poseen una parrilla de trabajo para el personal y un brazo articulado que sostiene un martillo hidráulico que permite retirar los pernos del manto de los molinos. El equipo ajusta su altura y posición con respecto al molino gracias a un pistón hidráulico y a un sistema de base desplazable. El proyecto tiene como objetivo efectuar el diseño mecánico-estructural de plataformas tipo gata para una amplia variedad de condiciones de servicio en la minería chilena. Los objetivos específicos son: i) Formular una batería de configuraciones de plataformas de ancho variable entre 3-6 m., ii) efectuar una evaluación paramétrica de los esfuerzos, las deflexiones y el comportamiento estructural del emparrillado de piso y de su unión con el mástil principal y iii) evaluar el comportamiento estructural y el desempeño de los equipos parametrizados. El estudio sobre las plataformas tipo gata se centra en la parrilla principal, conformada por vigas UPN, como también en el nudo de unión entre esta parrilla y el mástil que la sostiene. Para analizar la parrilla principal se utiliza el software de rigidez directa SAP2000, mientras que el nudo se estudia mediante el software de elementos finitos ANSYS. Las variables de interés son los esfuerzos principales y la deflexión. Los resultados cumplen con los objetivos propuestos e indican que el diseño actual del emparrillado es muy seguro en cuanto a su resistencia, pues puede soportar cargas 6 veces mayores que las cargas de diseño, aunque las deformaciones de éste se encuentran en el límite de lo deseable. El nudo de unión, en cambio, es menos resistente que las parrillas, pues posee un factor de seguridad apenas mayor a 2. Finalmente, se recomienda realizar algunos ajustes al diseño, entre ellos, reforzar algunas zonas del nudo que poseen grandes concentraciones de esfuerzos. También se sugiere que las vigas del emparrillado que están sometidas a altas torsiones sean cambiadas por vigas con mayor resistencia a la torsión. Al mismo tiempo, existen vigas en la periferia del emparrillado que están sometidas a cargas muy bajas. En estos casos se recomienda evaluar un posible cambio por vigas más pequeñas o, incluso, por perfiles de acero más delgados que las vigas actuales. En tal caso se debe tener cuidado con un posible aumento en la deformación del emparrillado. En cuanto al material, no es necesario utilizar aceros de mejor calidad, ya que el diseño actual está sobredimensionado.

No description available.

xiii, 135 p. ; ill. (some col.) A print copy of this title is available through the UO Libraries. Search the library catalog for the location and call number. / This thesis explores the origin and evolution of animal germ layers via evolutionary-developmental analyses of the GATA family of transcription factors. GATA factors identified via a conserved dual zinc-finger domain direct early germ layer specification across a wide variety of animals. However, most of these developmental roles are characterized in invertebrate models, whose rapidly evolved sequences make it difficult to reconstruct evolutionary relationships. This study reconstructs the stepwise evolution of metazoan GATA transcription factors, defining homologous developmental roles based upon clear orthology assignments. We identified two GATA transcription factors ( PdGATA123 and PdGATA456 ) from the marine annelid Platynereis dumerilii to aid comparison of protostome and deuterostome GATA factors. Our phylogenetic analyses defined these as protostome orthologs of GATA1/2/3 and GATA4/5/6 vertebrate subfamilies, while the mRNA localization of the Platynereis GATAs showed ectodermal versus endomesodermal germ layer restrictions, similar to their vertebrate orthologs. To define the phylogenetic relationships of more divergent genes in the invertebrate models, we identified GATA homologs from recently sequenced protostome genomes. Molecular phylogenetic analyses, comparisons of intron/exon structure, and conserved synteny confirm all protostome GATA transcription factor genes are members of either the GATA123 or GATA456 class. These data allowed us to identify multiple protostome-specific duplications of GATA456 homologs and reconstruct the origin and relationships of all arthropod GATA genes. To probe GATA transcription factor evolution in deuterostomes, including vertebrates, we identified GATA factors in basal deuterostomes, including the cephalochordate Branchiostoma floridae and the hemichordate Saccoglossus kowalevskii. Phylogenetic analyses of these data independently confirmed that the ancestral deuterostome and chordate--like the bilaterian ancestor--possessed only two GATA transcription factors. This work was facilitated by a bioinformatics platform we are developing to identify gene families from preassembled genomic sequence. We generated anti- PdGATA antibodies to further explore the role of Platynereis GATAs in germ layer formation. We identified multiple presumptive endomesodermal cells in which nuclear localization of PdGATA456 protein first occurs and utilized PdGATA456 protein localization to follow endomesodermal cell populations throughout development. These analyses represent some of the first cellular and molecular analyses of Platynereis germ layer formation. This dissertation includes both my previously published and unpublished co-authored material. / Adviser: Stephan Q. Schneider

L’érythropoïèse inefficace joue un rôle central dans la physiopathologie de l’anémie des β-TM. Ses caractéristiques sont triple: accélération de la différenciation érythroïde, arrêt de maturation au stade d’érythroblaste polychromatophile et mort par apoptose à ce stade de différenciation. Les mécanismes précis de cette apoptose et de l’arrêt de la maturation n’ont pas encore été élucidés. Il a été montré, au cours de l’érythropoïèse physiologique, que la protéine chaperonne Hsp70, en se localisant dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation, protège GATA-1 (facteur de transcription érythroïde majeur) de sa destruction par la caspase-3. Cette enzyme clé de l’apoptose est en effet activée physiologiquement au cours de la différenciation érythroïde et peut cliver GATA-1. Notre travail se base sur l’hypothèse suivante : Hsp70 pourrait, au cours de l’érythropoïèse des β-TM, être séquestrée dans le cytoplasme des érythroblastes matures (stade d’une intense hémoglobinisation) afin d’exercer son rôle de chaperonne des chaînes d’α-globine libres. Cela aurait comme conséquence néfaste l’absence de localisation nucléaire d’Hsp70 et, en conséquence, la destruction de GATA-1 à l’origine de l’arrêt de maturation et de la mort cellulaire. Nous avons montré dans ce travail qu’Hsp70 était localisée principalement dans le cytoplasme des érythroblastes matures dans la moelle de patients β-TM, avec un défaut d’expression nucléaire. Par ailleurs, GATA-1 n’est plus exprimé dans ces cellules. Nous avons confirmé ces résultats dans un système de culture cellulaire érythroïde humaine en milieu liquide reproduisant les étapes de la différenciation érythroïde terminale. Une intéraction physique directe entre Hsp70 et l’α-globine a été identifiée par techniques de microscopie confocale, d’immunoprécipitation et de double hybride. Enfin, la transduction dans les érythroblastes de β-TM d’un mutant d’Hsp70-S400A, principalement nucléaire, ou d’un mutant de GATA-1 non clivable par la caspase-3 corrige l’érythropoïèse inefficace.Une modélisation mathématique du complexe Hsp70/α-globine nous a permis de préciser les domaines impliqués dans l’intéraction, ce qui ouvre la voie à une possibilité de criblage de petites molécules permettant la rupture de ce complexe afin de ramener Hsp70 dans le noyau avec un espoir thérapeutique pour améliorer l’érythropoïèse inefficace des β-TM. / Β-TM is an inherited hemoglobinopathy caused by a quantitative defect in the synthesis of the β-globin chains of hemoglobin, leading to the accumulation of free α-globin chains that form toxic aggregates. Despite extensive knowledge on the molecular defects causing β-TM, little is known about the mechanisms responsible for ineffective erythropoiesis (IE), which is characterised by accelerated erythroid differentiation, maturation arrest and apoptosis at the polychromatophilic stage. We have previously demonstrated that normal human erythroid cell maturation requires a transient activation of caspase-3. Although GATA-1, the master transcriptional factor of erythropoiesis, is a caspase-3 target, we have shown that during human erythroid differentiation, it is protected from cleavage through its association with the chaperone Hsp70 in the nucleus. Hsp70 is constitutively highly expressed in normal human erythroid cells. The best-known role of this ubiquitous chaperone is to participate in proteins folding and refolding of proteins denatured by cytoplasmic stress, thus preventing their aggregation.In this study, we have evidenced that during the maturation of human β-TM erythroblasts, Hsp70 is sequestrated in the cytoplasm by the excess of free α-globin chains, resulting in nuclear GATA-1 cleavage and, in turn, end-stage maturation arrest and apoptosis. A molecular modeling shows that α-globin binds to a highly electronegative cavity formed by all Hsp70 domains. Additionally, the transduction of a nuclear-targeted Hsp70 mutant (Hsp70-S400A) or caspase-3 uncleavable GATA-1 mutant (µGATA-1) corrects β-TM ineffective erythropoiesis in human cultured β-TM cells. Our data indicate that cytosolic Hsp70 sequestration by α-globin chains prevents its nuclear localization and is a key mechanism of the β-TM IE. In order to increase nuclear Hsp70 translocation, developing small molecules that could increase Hsp70 expression or disrupt the Hsp70/α-globin complex could be a novel approach of targeted therapies to improve erythropoiesis in β-TM.

Pour assurer la production de milliards de globules rouges, l’érythropoièse doit parfaitement contrôler les processus de prolifération et de différenciation. Ces deux processus sont régulés par l’expression de gènes spécifiques dépendant d’une coordination entre l’activité des facteurs de transcription (FT) et les fonctions épigénétiques portées par exemple par les protéines à bromodomaine. Cette étude se concentre sur les conséquences de l’association ou la dissociation du FT clef de l’érythropoièse GATA-1 avec les FT déterminant pour le cycle cellulaire, pRb et E2F. Dans la première partie de ma thèse, j’ai participé à l’étude du rôle de l’association/dissociation de GATA-1 et FOG-2 avec pRb/E2F dans le contrôle la balance prolifération/différenciation cellulaire. Nos résultats montrent que les souris exprimant une mutation de GATA-1 sur la sérine 310 (GATA-1S310A), qui a la capacité accrue à séquestrer E2F-2, présentent une anémie létale lorsqu’un mécanisme de compensation de production de E2F-2 induit par l’IGF-1 est inhibé. Puis, nous avons trouvé que les propriétés décrites pour GATA-1 sont partagées par le FT FOG-2 et montré que l’abrogation de sa fixation avec pRb induit une perturbation de l’adiposité dans des souris FOG-2pRb-. Dans la deuxième partie, l’expression de c-Myc étant régulé différentiellement par GATA-1 et E2F, j’ai testé si la drogue « JQ1 », premier inhibiteur épigenétique chimique de l’expression de c-Myc, pouvait contrôler l’érythropoièse. Pour cela, j’ai utilisé la ligné érythroleucémique UT7 qui prolifère sans se différencier en présence d’érythropoiétine (stade proérythroblaste). Les résultats montrent que le traitement par JQ1 bloque la prolifération des cellules UT7 et permet de réinitier le programme de différentiation érythroide terminale. J’ai alors recherché les mécanismes moléculaires impliqués dans cette régulation et trouvé que l’inhibition transcriptionnelle de c-Myc par JQ1 est associée à l’inhibition de l’activité transcriptionnelle de STAT5 sans modification de son état de phosphorylation. Enfin, j’ai montré que JQ1 pouvait avoir une activité comparable à celle du TGF-b mais sans implication les voies Smad. Des études in vivo montre que JQ1 augmente la viabilité cellulaire et accélère la maturation des cellules érythroides à la fois chez les souris sauvages et thalassémiques. Cette différence d’action de JQ1 sur l’érythropoièse normale et pathologique implique des modifications épigénétiques différentielles entre ces deux types cellulaires et sont à la base de nouvelles stratégies du traitement du cancer. Le rôle clef de la régulation de l’association/dissociation de GATA-1 ou FOG-2 avec pRb/E2F dans l’érythropoièse et l’adipogénèse, nous a conduit, dans une troisième partie, à déterminer in vivo, les conséquences physiologiques de la séquestration de E2F par pRb. Pour cela nous avons crée une souris transgénique exprimant de façon conditionnelle un peptide contenant la partie N terminale de GATA-1 qui se fixe à pRb (GATA-1Nter). In vitro, ce peptide séquestre E2F dans le complexe GATA-1Nter/pRb et inhibe la prolifération cellulaire de façon irréversible. In vivo, aucune souris transgéniques exprimant le peptide GATA-1Nter n’a pu être sélectionnée et une mortalité au stade embryonnaire est observée. Une expression induite de ce peptide au stade adulte ne produit que des souris chimériques avec une fréquence de recombinaison du transgène GATA-1Nter importante. L’établissement de lignées stables de souris exprimant le peptide GATA-1Nter permettra de déterminer les conséquences physiologiques de la séquestration de E2F dans le complexe GATA-1Nter/pRb. / To ensure the generation of billions of erythrocytes daily, erythropoiesis must be well controlled by proliferation and differentiation processes. These two processes are regulated by expressions of specific genes, coordinated by transcription factors (TFs) and epigenetic factors, such as bromodomain proteins. This study focused on the effects of the binding and dissociation of a key erythroid TF, GATA-1, to the crucial cell cycle TFs, pRb and E2F. In the first part of this thesis, the role of GATA-1 and FOG-2 binding to pRb/E2F in a control balances between cell proliferation and differentiation was studied. Mice bearing a GATA-1 mutation (GATA-1S310A) displayed higher levels of E2F2 sequestration and suffered from fatal anemia when the compensatory pathway of E2F2 production via IGF-1 signaling was also inhibited. The properties described for GATA-1 were found to be common to FOG-2, and the abolition of FOG-2 binding to pRb led to obesity resistance in FOG-2pRb- mice. In the second part of this work, as c-Myc is regulated by GATA-1 and E2F, the first chemical epigenetic inhibitor repressing c-Myc expression to be described, JQ1, was investigated to see if it could control erythropoiesis. The UT7 erythroleukemia cell line, which proliferates without differentiating was used. This cell line stops differentiation at the proerythroblast stage, in response to erythropoietin. JQ1 treatment inhibited UT7 proliferation and restored terminal erythroid differentiation. The molecular mechanism underlying this regulation by JQ1 was shown that the inhibition of c-Myc expression was associated with the inhibition of STAT5 transcription, with no change in the phosphorylation of this protein. It was found that JQ1 had a putative TGF--like activity, which did not involve the Smad pathway. It was shown in the ex vivo studies that JQ1 increased the viability of erythroid cells and accelerated the maturation of these cells in both WT and thalassemic mice. The observed differences between leukemic and normal erythropoiesis involved differential epigenetic modifications that could be at the basis of new strategies regarding cancer treatment.The key role of the association of GATA-1 or FOG-2 had with pRb/E2F, and the dissociation of these factors, in erythropoiesis and adipogenesis, respectively, led us to investigate, in vivo, the physiological consequences of E2F sequestration by pRb. As a result, transgenic mice displaying conditional expression of a peptide containing the N-terminal part of GATA-1 that binds to pRb (GATA-1Nter) were developed. In vitro, this peptide traps E2F in a GATA-1Nter/pRb complex, resulting in the irreversible inhibition of cell proliferation. The yield of transgenic mice expressing the GATA-1Nter peptide in vivo was unsuccessful, as this expression lead to lethality at the embryonic stage. Using an alternative approach, based on the inducible expression of the peptide in adults, chimeric mice with a high frequency of recombination of the GATA-1Nter transgene were obtained for this study. The establishment of a stable mouse line expressing the GATA-1Nter peptide should make it possible to determine the pathophysiological consequences of E2F sequestration in the GATA-1Nter/pRb complex.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La production de globules rouges dépend du taux apoptose des précurseurs érythroïdes et est principalement régulé par l'érythropoïétine (Epo). La privation en Epo aboutit à l'activation de la caspase-3 (casp-3) qui clive GATA-1 ce qui entraîne l'apoptose des érythroblastes immatures. L'activation de la casp-3 est également indispensable aux modifications morphologiques caractéristiques observées au cours de la différenciation érythroïde terminale humaine, sans qu'il n'y ait ni d'apoptose ni de clivage de GATA-1. L'objectif de cette thèse était de mettre en évidence si Hsp70 inductible, dont un des rôles principaux est la régulation de l'apoptose, est impliquée dans la protection sélective des substrats de la casp-3 activée au cours de la différenciation érythroïde terminale humaine. Nous avons mis en évidence que lors de la différentiation érythroïde terminale pendant la phase d'activation des caspases, Hsp70 a une expression nucléo-cytoplasmique constitutive et co-localise avec GATA-1 dans le noyau. La localisation nucléaire d'Hsp70 est régulée par l'Epo : après privation des cellules en Epo, il y a une importante diminution de la localisation nucléaire d'Hsp70 et GATA-1 est clivée. L'inhibition de l'expression d'Hsp70 par une approche siRNA a comme conséquence le clivage de GATA-1 lors de l'activation de la casp-3 avec un arrêt de différenciation et une augmentation de la mort cellulaire. Hsp70 est une nouvelle protéine anti-apoptotique de la différenciation érythroïde terminale. Nous proposons un modèle dans lequel l'Epo détermine le destin des érythroblastes (apoptose vs différenciation) en aval de la casp-3 en régulant la localisation nucléaire d'Hsp70.