INTRODUCCIÓ: Les neoplàsies limfoides agrupen un conjunt de malalties que, tot i compartir certes característiques comunes, presenten una gran heterogeneïtat en la seva biologia i manifestacions clíniques. En la present tesi s´han estudiat els mecanismes moleculars implicats en el desenvolupament i progressió de diferents entitats que s´inclouen dins del grup dels Limfomes No-Hodgkin de cèl·lula B (NHL, de l´anglès Non-Hodgkin Lymphoma), especialment el limfoma de cèl·lules del mantell (MCL, de l´anglès Mantle Cell Lymphoma) i la leucèmia limfàtica crònica (CLL, de l´anglès Chronic Lymphocytic Leukemia), els quals són limfomes de cèl·lula B petita. MATERIAL I MÈTODES: En aquest treball s´han emprat una gran diversitat de tècniques experimentals, de les que destaquen la hibridació genòmica comparada (CGH, de l´anglès Comparative Genomic Hybridization) per estudiar les alteracions cromosòmiques dels tumors, la reacció en cadena de la polimerasa (PCR, de l´anglès Polymerase Chain Reaction) i la cromatografia líquida desnaturalitzant (DHPLC, de l´anglès Denaturing High Perfomance Liquid Chromatography) per determinar l´adquisició d´alteracions en el material genètic a nivell de DNA; així com la PCR quantitativa a temps real (qPCR) i la realització de microarrays d´oligonucleòtids d´alta densitat per analitzar l´expressió gènica a nivell de mRNA.RESULTATS I CONCLUSIONS: L´estudi de gens implicats en la proliferació de MCL ha permès la construcció d´un model predictor de la supervivència dels pacients basat en l´expressió dels cinc gens RAN, MYC, TNFRSF10B, POLE2 i SLC29A2. Aquest model es pot aplicar tant en material congelat com en teixits biològics fixats amb formol i inclosos en parafina (FFPE, de l´anglès Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded tissue), podent ésser útil en la presa de decisions terapèutiques1. També s´ha estudiat el gen MDM2, implicat en les vies de resposta al dany del DNA. S´ha observat que, a part de les alteracions del gen p53, l´augment de l´expressió gènica de MDM2 es correlaciona directament amb una disminució de la supervivència en MCL. En alguns casos aquest augment de l´expressió pot donar-se per guany del locus genòmic del gen, mentre que la presència del SNP309 al seu promotor no es relaciona amb els canvis d´expressió (2).La desregulació dels mecanismes implicats en la mort cel·lular programada o apoptosi també juga un paper clau en els processos de tumorogènesi. S´ha observat que els receptors de mort TNFRSF10A i TNFRSF10B es troben poc mutats en neoplàsies limfoides, indicant que la seva alteració no és rellevant per explicar la resistència a l´apoptosi observada en aquests tipus de limfomes. Tot i això, la presència del polimorfisme A1322G al domini de mort de TNFRSF10A s´associa amb un augment de risc a patir MCL i CLL; mentre que la presència del polimorfisme C626G al domini d´unió a lligand de TNFRSF10A sembla jugar un paper protector en MCL; suggerint un possible paper de dits polimorfismes en la resistència a la mort mediada per TRAIL (3).Finalment, l´estudi global de les alteracions que participen en els fenòmens de progressió clínica primerenca de la CLL ha permès determinar la modulació de l´expressió d´un petit grup de gens (58) que participen en diferents vies cel·lulars. Destaca un subconjunt de gens que actuen en la inhibició de l´adhesió i motilitats cel·lulars, els quals presenten una disminució de la seva expressió. També s´ha observat que la progressió clínica de les CLL s´associa, en alguns casos, amb la inactivació de certs gens supressors de tumors. Per altra banda, l´evolució primerenca d´aquest tips de leucèmia sembla implicar poca inestabilitat cromosòmica (4).ARTICLES GENERATS PER LA PRESENT TESI:(1). Hartmann E, Fernandez V, Moreno V, Valls J, Hernandez L, Bosch F, Müller-Hermelink HK, Ott G, Rosenwald A, Campo E. A five-gene model to predict survival in mantle cell lymphoma and its application to formalin-fixed paraffin-embedded tissue. J Clin Oncol, under revision (Journal impact factor 2006: 13.598).(2). Hartmann E, Fernandez V, Stoecklein H, Hernández L, Campo E, Rosenwald A. Increased MDM2 expression is associated with inferior survival in mantle cell lymphoma, but not related to the MDM2 SNP309, Haematologica, 92:574-575 (Journal impact factor 2006: 5.032).(3). Fernandez V, Jares P, Bea S, Salaverria I, Guino E, de Sanjose S, Colomer D, Ott G, Montserrat E, Campo E. Frequent polymorphic changes but not mutations of TRAIL receptors DR4 and DR5 in mantle cell lymphoma and other B-cell lymphoid neoplasms. Haematologica. 2004 Nov;89(11):1322-31 (Journal impact factor 2006: 5.032).(4). Fernandez V, Jares P, Salaverria I, Giné E, Beà S, Aymerich M, Colomer D, Villamor N, Bosch F, Montserrat E, Campo E. Gene expression profile and genomic changes in disease progression of early-stage chronic lymphocytic leukemia. Haematologica, accepted (Journal impact factor 2006: 5.032). / "ANALYSIS OF THE MOLECULAR MECHANISMS IMPLIED IN THE DEVELOPMENT AND PROGRESSION OF SMALL B CELL LYMPHOMAS" INTRODUCTION:Different molecular mechanisms implied in the development and progression of distinct subtypes of small B cell lymphomas that belong to Non-Hodgkin´s Lymphomas (NHL) have been studied in the present work, specially focusing on Mantle Cell Lymphoma (MCL) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).MATERIALS AND METHODS:Comparative genomic hybridization (CGH) has been aplied to study the chromosomal alterations of the tumors. Polymerase chain reaction (PCR) and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) techniques have been performed to detect nucleotide alterations in certain genes; whereas real time quantitative PCR (qPCR) and high density oligonucleotide microarrays have been used to analyse gene expression.RESULTS AND DISCUSSION:The gene expression model composed of the five genes RAN, MYC, TNFRSF10B, POLE2 and SLC29A2 allows the survival prediction of MCL patients with widely disparate clinical outcome and is superior to the immunohistochemical marker Ki-67. The predictor is applicable to fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor samples. On the other side, the study of the MDM2 gene has shown that increased gene expression correlates with inferior survival in MCL. MDM2 overexpression is associated with copy number gains of the MDM2 locus in single tumors, but not with the recently reported MDM2 promoter SNP309.The study of the death receptors TNFRSF10A and TNFRSF10B has shown that mutations in these genes are uncommon in lymphoid neoplasms, but the presence of certain TNFRSF10A polymorphisms (A1322G in the death domain and C626G in the extracellular binding domain) can contribute to the pathogenesis of these malignancies. The study of early clinical progression in CLL has allowed the identification of a significant modulation of the gene expression of 58 genes, with a particular downregulation of genes that are inhibitors of cell adhesion and motility. On the other side, our results indicate that clinical progression of early stage CLL is associated with karyotype evolution and inactivation of certain tumor suppressor genes.

L'ordre dels primats inclou l'home i els seus parents més propers. Actualment, més de la meitat dels primats no humans es troben en perill d'extinció, principalment com a conseqüència de l'activitat humana. Això doncs, l'estudi dels primats és de gran rellevància des de dos punts de vista ben diferents, tant a nivell de conservació de les espècies com en biomedicina, genòmica comparada i evolució. El treball de tesi doctoral presentat aquí s'emmarca dins d'aquest context bilateral i pretén ser una aportació tant pel que fa al desenvolupament i aplicació d'eines moleculars per a la conservació de les espècies de primat com per a l'estudi de l'evolució d'aquests éssers.Aquest estudi es divideix en cinc apartats principals. Comença amb una Introducció en què descriu la diversitat que amaga l'ordre dels primats, el gran ventall de possibilitats que obre la genètica de la conservació, la importància de les duplicacions en l'evolució de les espècies i la història del cromosoma Y. A continuació s'estableixen els Objectius fonamentals proposats en aquesta tesi. Les fites principals són: determinar l'aplicabilitat de la tècnica de l'MDA sobre mostres no invasives, contribuir a desenvolupar un microarray de miniseqüència per a l'estudi dels primats i desemmascarar la història evolutiva de la família gènica RPS4Y en primats.El cos principal de la tesi està format pels tres capítols que constitueixen l'apartat dels Resultats. En el primer treball, publicat a "Biotechnology Journal" amb el títol "Sequence quality is maintained after multiple displacement amplification of non-invasively obtained macaque semen DNA", s'analitza la possibilitat d'aplicar la tècnica d'amplificació de genomes complets Multiple Displacement Amplification (MDA) amb mostres recol·lectades de manera no invasiva. Amb aquest estudi s'ha pogut demostrar que els productes d'MDA obtinguts a partir de mostres no invasives de semen de macaco són adequades per a la realització d'estudis genètics. En el segon treball, titulat "A microarray system for Y-chromosomal and mitochondrial SNP analysis in chimpanzee populations" i enviat a Molecular Ecology, s'ha desenvolupat un "microarray" de miniseqüència per estudiar la variabilitat de les poblacions de ximpanzé, ja siguin captives com en estat salvatge. El "microarray" inclou SNPs tant de cromosoma Y i com de gens mitocondrials, de manera que permet analitzar simultàniament la línia paterna i la línia materna, informació que és de gran interès quan s'estudien espècies en què mascles i femelles presenten diferent patró de migració, com els ximpanzés. Finalment, en el tercer estudi es descriu la història evolutiva dels gens RPS4Y dins de la filogènia dels primats. S'ha pogut determinar en 35 milions d'anys el moment de la duplicació que originà el gen RPS4Y2 i s'ha proposat que el seu manteniment en el genoma es deu a l'adquisició d'una nova funció relacionada amb l'espermatogènesi, almenys en el llinatge humà. Aquests resultats es troben recollits a l'article titulat "Molecular evolution of primate RPS4Y gene family" enviat a la revista "Molecular Biology and Evolution".Finalment, els resultats obtinguts durant el desenvolupament d'aquesta tesi es discuteixen d'una manera general dins l'apartat del Resum global. La memòria acaba amb les Conclusions més rellevants a què s'ha pogut arribar, exposades de manera específica i resumida. / Primate order includes humankind and its closest relatives. Nowadays, more than half of nonhuman primates are in peril, mainly due to human activities. Therefore, primate studies are of great interest from two important points of view, both for species conservation purposes and also in biomedicine, comparative genomics, and evolution.The aim of this thesis is to contribute both to the conservation of primate species and to the study of their evolution.This thesis includes the results of three different studies, already published or in preparation. The first study analyses the Multiple Displacement Amplification (MDA) technique in order to test its applicability on non-invasively collected samples. We have demonstrated that MDA products obtained from non-invasively collected macaque semen are suitable to carry out genetic analyses. In the second study we have developed a minisecuencing microarray to study the genetic variability in chimpanzee populations, both captive and wild-living. The microarray includes SNPs from the Y chromosome and from mitochondrial genes, so that it allows to simultaneously analyse the paternal and maternal lineages. Finally, the third study aimed to describe the evolution of primate RPS4Y genes. We have dated in 35 million years the origin of RPS4Y2 and we proposed a neofunctionalization process as the reason of its maintenance in the genome.

L’splicing és el mecanisme pel qual els introns són eliminats del pre-mRNA per generar un trànscrit madur. Aquest procés és dut a terme per un complex macromolecular anomenat spliceosoma i requereix el reconeixement dels senyals d’splicing al pre-mRNA. Aquests senyals no són sempre identificats correctament, el que permet la producció de trànscrits diferents a partir d’un únic pre-mRNA mitjançant un procés anomenat splicing alternatiu. Aquest procés pot ser regulat mitjançant factors proteics específics o per altres mecanismes que alteren el reconeixement dels senyals d’splicing com l’estructura secundària adoptada pels pre-mRNAs. En aquesta tesi hem investigat els mecanismes de regulació de l’splicing en eucariotes mitjançant tècniques computacionals. També hem estudiat la relació existent entre les proteïnes que intervenen en la regulació de l’splicing i els senyals d’splicing, i com han coevolucionat en diferents espècies. Finalment, i tenint en compte les possibilitats que l’splicing alternatiu ofereix des del punt de vista evolutiu, també hem analitzat l’impacte de l’splicing alternatiu en l’evolució gènica. / Splicing is the mechanism by which introns are removed from the pre-mRNA to create a mature transcript. This process is performed by a macromolecular complex, the spliceosome, and involves the recognition of the splicing signals in the premRNA. These signals are not always perfectly recognized, which allows the production of different mature transcripts from a single pre-mRNA through a process called alternative splicing. This process can be regulated by specific protein factors or by other mechanisms that affect the recognition of the splicing signals, such as the secondary structure adopted by the pre-mRNA. In this thesis we have investigated the mechanisms of splicing regulation in eukaryotes using computational approaches. Moreover, we have also studied the relationship that exists between protein factors involved in splicing regulation and splicing signals, and how they have co-evolved across species. Finally, and considering the possibilities that alternative splicing can offer from the evolutionary point of view, he have also analyzed the impact of alternative splicing in gene evolution.