A obtenção de novas cultivares de uvas de mesa e a compreensão da regulação da expressão gênica, associada à formação do fruto de uma cultivar de uva sem semente, constituem pré-requisitos essenciais para o desenvolvimento de ferramentas aplicadas ao melhoramento genético para essas espécies. Com este objetivo, dois trabalhos foram conduzidos a partir do estudo de transcritos derivados de frutos da cultivar (cv) Sultanina de videira. No primeiro trabalho, três bibliotecas subtraídas foram construídas a partir de RNA total de frutos em diferentes estádios de formação, utilizando-se uma metodologia modificada da análise representacional diferencial (RDA), denominada análise representacional de transcritos em grupos (BRAT). Um total de 2.500 fragmentos derivados de transcritos (TDFs) foram identificados e clonados a partir de estádios específicos do desenvolvimento do fruto. Após sequenciamento e análise in silico, 1.554 (62,16%) dos transcritos foram validados de acordo com a qualidade da sequência. A montagem das sequências derivadas de genes expressos (ESTs) resultou em 726 singletos e 69 clusters, com aproximadamente 76% de redundância. Entre os TDFs identificados, onze genes candidatos e dois genes-referência foram selecionados e submetidos a uma análise aprofundada dos seus perfis de expressão temporal por RT-qPCR. A expressão de sete genes foi concordante com os estádios específicos do desenvolvimento dos frutos. Entre os candidatos selecionados os genes a seguir listados são possivelmente os mais promissores quando se considera o desenvolvimento do fruto da cv. Sultanina: (i) VvUBP1 (proteína de ligação a oligouridilatos), (ii) VvRIP1 (proteínas induzidas pelo amadurecimento), (iii) VvP450 (citocromo P450), (iv) VvDOF1 (proteína do tipo Dof); (v) VvERF1 (fator de transcrição responsivo ao etileno), e (vi) VvGID1L1 (receptor de ácido giberélico). Num segundo momento, foi realizado um estudo mais detalhado dos genes Dof de videira. Tais genes correspondem a um grupo de fatores de transcrição específicos de plantas, os quais estão envolvidos na regulação de diferentes funções, tais como, resposta ao estresse, hormônios e luz, sinalização de fitocromo, germinação de sementes e expressão gênica tecido-específica. A família de genes Dof de videira compreende 26 membros, sendo que as sequências de aminoácidos de todos os domínios Dof alinham perfeitamente, incluindo resíduos de cisteína que são críticos para a ligação de zinco e outros resíduos conservados em fatores de transcrição Dof de A. thaliana, O. sativa e outras plantas. Baseado na análise de domínios Dof, sugere-se que estes domínios sejam possivelmente funcionais em videira. A localização física dos genes Dof nos cromossomos de videira foi realizada. Além disso, foi conduzida uma análise filogenética comparando o grupo de genes Dof em videira com os seus homólogos em outras duas eudicotiledôneas completamente sequenciadas, A. thaliana e Populus, permitindo identificar claramente clusters de genes parálogos e ortólogos. Por fim, os perfis de expressão de todos os 26 genes Dof foram estudados por RT-qPCR em nove órgãos de videira. / Table grapes production and kwnolegment about the gene expression regulation associated with the formation of seedless grape cultivar, constitute essential prerequisites for the development of tools applied to genetic improvement of this plant species. To this end, two studies were conducted using the analysis of transcripts derived from fruits of the Sultanina cultivar (cv.) grapevine. In the first study, three subtracted libraries were constructed from total RNA from fruit different developmental stages using a modified methodology of Representational Difference Analysis (RDA), named Bulk Representational Analysis of Transcripts (BRAT). A total of 2,500 transcripts-derived fragments (TDFs) were identified and cloned from specific stages of fruit development. After sequencing and analysis in silico, 1,554 (62.16%) transcripts were validated in accordance with the sequence quality. The assembly of sequences derived from expressed genes (ESTs) resulted in 726 singletons and 69 clusters, with overall EST redundancy of approximately 76%. Among the TDFs identified eleven candidate genes and two reference genes were selected and subjected to a thorough analysis of their temporal expression profiles by RT-qPCR. Among them, seven genes proved to be in agreement with the stage-specific expression. Among candidates selected from those differentially expressed, the genes listed below were considered the most promising when considering the fruit development in grapevine cv. Sultanina: (i) VvUBP1(oligouridylate binding protein), (ii)VvRIP1 (ripening induced protein), (iii) VvP450 (cytochrome P450), (iv) VvDOF1 (Dof-like protein), (v) VvERF1 (ethylene-responsive transcription factor), and (vi) VvGID1L1 (gibberellins receptor). The second study detailed the grapevine Dof gene family. Dof proteins are involved in the regulation of different functions such as plant response to stress, hormones and light phytochrome signaling, seed germination and tissue-specific gene expression. The Dof gene grapevine family includes 26 members. The amino acid sequences deduced from Dof domains matched perfectly including cysteine residues critical for zinc binding and other residues known to be conserved in Dof transcription factors from A. thaliana, O. sativa and other plants. Based on analysis of Dof domains, it is suggested that all grapevine Dof domains are possibly functional. The physical location of Dof genes in grapevine chromosome was determined. A phylogenetic study comparing grapevine Dof genes with their counterparts in two other eudicots completely sequenced, A. thaliana and Populus, allowed us to identify clear clusters of paralogous and orthologs genes. Finally, the expression profiles of all 26 Dof genes was studied by RT-qPCR in nine vegetative and reproductive grapevine organs.

A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.

Introdução: As Mucolipidoses II e III (MLII e MLIII) são doenças lisossômicas raras causadas pela deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (fosfotransferase), enzima envolvida na síntese do marcador M6P responsável pelo direcionamento de várias enzimas lisossomais para o lisossomo. A fosfotransferase é codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG. O gene GNPTAB codifica as subunidades e da enzima; mutações neste gene provocam tanto a MLII, forma mais grave, quanto a MLIII, forma mais atenuada da doença. O gene GNPTG codifica a subunidade ; mutações neste gene provocam a MLIII. Objetivos: Identificar as mutações no gene GNPTAB presentes em pacientes brasileiros com MLII e MLIII. Metodologia: Os pacientes com diagnóstico bioquímico de ML II/III foram identificados pelo Laboratório de Referência para EIM do HCPA (LREIM-HCPA), Brasil, de 1983 até 2009. Treze pacientes não relacionados (MLII:6, MLIII:5, ML tipo não definido: 2), filhos de casais não-consanguíneos, e oriundos de várias regiões do Brasil, foram incluídos no estudo. Informações clínicas foram obtidas a partir do banco de dados do LREIMHCPA, sendo que o tipo de ML e a altura foram fornecidos pelo médico assistente. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA genômico. Os 21 exons que compreendem o gene GNPTAB, e respectivas regiões flanqueadoras, foram amplificados a partir de sequências específicas de oligonucleotídeos projetadas para este trabalho. A sequência do gene GNPTAB utilizada como referência para o sequenciamento foi a GenBank NM_024312.3. Resultados: Com a estratégia utilizada, foi possível a identificação de ambas as mutações patogênicas em 6/13 pacientes, e de apenas uma mutação patogênica em cinco pacientes. Em dois pacientes, ambos com MLIII, não foram identificadas mutações patogênicas. Em todos os pacientes foi encontrada pelo menos uma variante não-patogênica, sendo a mais frequente a c.-41-39delGGC (16/26 alelos). A mutação c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) foi a mais frequente na amostra estudada (n= 7/26 alelos). Considerando regiões codificantes e não-codificantes, quatro novas mutações estão sendo descritas: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3) e c.365+96_97delGT (intron 4). Mutações sem sentido e deleções com alteração na fase de leitura parecem estar relacionadas ao fenótipo grave enquanto, mutações de sentido trocado, estão relacionadas ao fenótipo atenuado. Discussão/Conclusões: Este é o primeiro estudo do gênero realizado em pacientes brasileiros com MLII/III. Assim como é descrito em pacientes de outras populações, o gene GNPTAB apresentou grande heterogeneidade alélica e a mutação patogênica mais frequente encontrada foi a c.3503_3504delTC. Desta forma, sugere-se que a análise de DNA dos pacientes brasileiros com MLII/III seja iniciada pela pesquisa dessa mutação. Como a estratégia empregada detectou 17/26 dos alelos patogênicos, novas análises deverão ser realizadas para os pacientes que apresentam o genótipo parcialmente ou não estabelecido, incluindo a análise do GNPTG. Palavras-chaves: GNPTAB. Mucolipidose. Doenças Lisossômicas. M6P. Doença da Célula de Inclusão. Polidistrofia Pseudo-Hurler. / Introduction: Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are rare lysosomal diseases caused by a deficiency of GlcNac-1-phosphotransferase (phosphotransferase), the enzyme responsible for the synthesis of marker M6P, which directs several lysosomal enzymes to the lysosome. Phosphotransferase is codified by the GNPTAB and the GNPTG genes. The GNPTAB gene codifies subunits and of the enzyme; mutations in this gene cause both MLII, the most severe form, and MLIII, the most attenuated form of the disease. The GNPTG gene codifies subunit ; mutations in this gene cause MLIII. Objectives: To identify mutations in the GNPTAB gene that are present in Brazilian patients with MLII and MLIII. Methodology: Patients with a biochemical diagnosis of ML II/III were identified at the Reference Laboratory of Inborn Errors of Metabolism of HCPA, Brazil, from 1983 to 2009. Thirteen unrelated patients (MLII: 6, MLIII: 5, undefined ML: 2), born to nonconsanguineous couples and from several regions of Brazil were included in the study. Clinical information was obtained from the database of the LREIM-HCPA, and the type of ML and height of patients were obtained with the assistant physician. Peripheral blood samples were collected for extraction of genomic DNA. The 21 exons that comprise the GNPTAB gene and their respective flanking regions were amplified from the specific sequences of primers designed for this study. The sequence of the GNPTAB gene used as reference for sequencing was GenBank NM_024312.3. Results: As a result of the strategy used, it was possible to identify both pathogenic mutations in 6/13 patients and only one pathogenic mutation in five patients. In two patients, both with MLIII, no pathogenic mutations were identified. At least one non-pathogenic variant was found in all patients, and the most frequently found was c.-41-39delGGC (16/26 alleles). Mutation c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) was the most frequently found pathogenic mutation in the sample studied (n= 7/26 alleles). As to codifying and noncodifying regions, four novel mutations are being described herein: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3), and c.365+96_97delGT (intron 4). Nonsense mutations and frameshift mutations seem to be related to the severe phenotype, while inverse mutations are related to the attenuated phenotype. Discussion/Conclusions: This is the first study of its kind conducted in Brazilian patients with ML II/III. As it is described in patients of other populations, the GNPTAB gene presented great allelic heterogeneity, and the most frequently found pathogenic mutation was c.3503_3504delTC. Thus, we suggest the DNA analysis of Brazilian patients with MLII/III to be initiated by testing this mutation. As the strategy applied herein detected 17/26 of the pathogenic alleles, new analyses should be conducted for the patients who present a partial or unestablished genotype, including the analysis of the GNPTG gene. Key words: GNPTAB. Mucolipidosis. Lysosomal Disease. M6P. I-cell Disease. Pseudo-Hurler Polydystrophy.

A obtenção de novas cultivares de uvas de mesa e a compreensão da regulação da expressão gênica, associada à formação do fruto de uma cultivar de uva sem semente, constituem pré-requisitos essenciais para o desenvolvimento de ferramentas aplicadas ao melhoramento genético para essas espécies. Com este objetivo, dois trabalhos foram conduzidos a partir do estudo de transcritos derivados de frutos da cultivar (cv) Sultanina de videira. No primeiro trabalho, três bibliotecas subtraídas foram construídas a partir de RNA total de frutos em diferentes estádios de formação, utilizando-se uma metodologia modificada da análise representacional diferencial (RDA), denominada análise representacional de transcritos em grupos (BRAT). Um total de 2.500 fragmentos derivados de transcritos (TDFs) foram identificados e clonados a partir de estádios específicos do desenvolvimento do fruto. Após sequenciamento e análise in silico, 1.554 (62,16%) dos transcritos foram validados de acordo com a qualidade da sequência. A montagem das sequências derivadas de genes expressos (ESTs) resultou em 726 singletos e 69 clusters, com aproximadamente 76% de redundância. Entre os TDFs identificados, onze genes candidatos e dois genes-referência foram selecionados e submetidos a uma análise aprofundada dos seus perfis de expressão temporal por RT-qPCR. A expressão de sete genes foi concordante com os estádios específicos do desenvolvimento dos frutos. Entre os candidatos selecionados os genes a seguir listados são possivelmente os mais promissores quando se considera o desenvolvimento do fruto da cv. Sultanina: (i) VvUBP1 (proteína de ligação a oligouridilatos), (ii) VvRIP1 (proteínas induzidas pelo amadurecimento), (iii) VvP450 (citocromo P450), (iv) VvDOF1 (proteína do tipo Dof); (v) VvERF1 (fator de transcrição responsivo ao etileno), e (vi) VvGID1L1 (receptor de ácido giberélico). Num segundo momento, foi realizado um estudo mais detalhado dos genes Dof de videira. Tais genes correspondem a um grupo de fatores de transcrição específicos de plantas, os quais estão envolvidos na regulação de diferentes funções, tais como, resposta ao estresse, hormônios e luz, sinalização de fitocromo, germinação de sementes e expressão gênica tecido-específica. A família de genes Dof de videira compreende 26 membros, sendo que as sequências de aminoácidos de todos os domínios Dof alinham perfeitamente, incluindo resíduos de cisteína que são críticos para a ligação de zinco e outros resíduos conservados em fatores de transcrição Dof de A. thaliana, O. sativa e outras plantas. Baseado na análise de domínios Dof, sugere-se que estes domínios sejam possivelmente funcionais em videira. A localização física dos genes Dof nos cromossomos de videira foi realizada. Além disso, foi conduzida uma análise filogenética comparando o grupo de genes Dof em videira com os seus homólogos em outras duas eudicotiledôneas completamente sequenciadas, A. thaliana e Populus, permitindo identificar claramente clusters de genes parálogos e ortólogos. Por fim, os perfis de expressão de todos os 26 genes Dof foram estudados por RT-qPCR em nove órgãos de videira. / Table grapes production and kwnolegment about the gene expression regulation associated with the formation of seedless grape cultivar, constitute essential prerequisites for the development of tools applied to genetic improvement of this plant species. To this end, two studies were conducted using the analysis of transcripts derived from fruits of the Sultanina cultivar (cv.) grapevine. In the first study, three subtracted libraries were constructed from total RNA from fruit different developmental stages using a modified methodology of Representational Difference Analysis (RDA), named Bulk Representational Analysis of Transcripts (BRAT). A total of 2,500 transcripts-derived fragments (TDFs) were identified and cloned from specific stages of fruit development. After sequencing and analysis in silico, 1,554 (62.16%) transcripts were validated in accordance with the sequence quality. The assembly of sequences derived from expressed genes (ESTs) resulted in 726 singletons and 69 clusters, with overall EST redundancy of approximately 76%. Among the TDFs identified eleven candidate genes and two reference genes were selected and subjected to a thorough analysis of their temporal expression profiles by RT-qPCR. Among them, seven genes proved to be in agreement with the stage-specific expression. Among candidates selected from those differentially expressed, the genes listed below were considered the most promising when considering the fruit development in grapevine cv. Sultanina: (i) VvUBP1(oligouridylate binding protein), (ii)VvRIP1 (ripening induced protein), (iii) VvP450 (cytochrome P450), (iv) VvDOF1 (Dof-like protein), (v) VvERF1 (ethylene-responsive transcription factor), and (vi) VvGID1L1 (gibberellins receptor). The second study detailed the grapevine Dof gene family. Dof proteins are involved in the regulation of different functions such as plant response to stress, hormones and light phytochrome signaling, seed germination and tissue-specific gene expression. The Dof gene grapevine family includes 26 members. The amino acid sequences deduced from Dof domains matched perfectly including cysteine residues critical for zinc binding and other residues known to be conserved in Dof transcription factors from A. thaliana, O. sativa and other plants. Based on analysis of Dof domains, it is suggested that all grapevine Dof domains are possibly functional. The physical location of Dof genes in grapevine chromosome was determined. A phylogenetic study comparing grapevine Dof genes with their counterparts in two other eudicots completely sequenced, A. thaliana and Populus, allowed us to identify clear clusters of paralogous and orthologs genes. Finally, the expression profiles of all 26 Dof genes was studied by RT-qPCR in nine vegetative and reproductive grapevine organs.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento. / Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio. / Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense.

Submitted by Marcelo Andrade Silva (marcelo.andradesilva@ufpe.br) on 2015-03-09T14:36:34Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Jussyêgles Niedja da Paz Pereira.pdf: 1257217 bytes, checksum: 95f84e63076d280fb3399a5761fde854 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T14:36:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Jussyêgles Niedja da Paz Pereira.pdf: 1257217 bytes, checksum: 95f84e63076d280fb3399a5761fde854 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / Os Staphylococcus spp. demonstraram, ao longo do tempo, a notável capacidade de desenvolver resistência a maioria dos antimicrobianos. Há um mecanismo de resistência aos macrolídeos, em Staphylococcus spp. que atinge também as lincosamidas e as estreptograminas B caracterizando a denominada resistência MLSB, cuja expressão pode ser constitutiva (MLSBc) ou induzível (MLSBi) e é codificada principalmente pelos genes ermA e ermC. A resistência MLSBc é facilmente detectada pelos testes de susceptibilidade utilizados na rotina laboratorial, mas a resistência MLSBi não é. A terapia com clindamicina nos casos de infecção por isolados com resistência MLSBi pode falhar. O objetivo deste estudo foi caracterizar o perfil fenotípico (ocorrência dos fenótipos MLSBc e MLSBi) e molecular (ocorrência dos genes ermA e ermC) da resistência MLSB dos isolados clínicos de Staphylococcus aureus e SCN (Staphylococcus coagulase negativos) sensíveis e resistentes à meticilina provenientes de pacientes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (HC-UFPE), durante o ano de 2012. A susceptibilidade antimicrobiana de 103 isolados foi determinada pela técnica de disco difusão em ágar Mueller-Hinton. Posteriormente, foi realizado o screening de oxacilina. O fenótipo MLSBi foi detectado através do teste D. Foram submetidos a reação em cadeia da polimerase (PCR), 13 isolados com fenótipos MLSBc e MLSBi para a detecção dos genes ermA e ermC. Os fenótipos MLSBc e MLSBi foram identificados respectivamente em 39 (37,9%) e cinco (4,9%) isolados. O fenótipo MLSBi foi encontrado apenas em quatro (10,8%) dos S. aureus sensíveis à meticilina e em um (4,5%) dos S. aureus resistentes a meticilina. Dos 13 isolados submetidos a PCR, seis (46,2%) apresentaram um gene erm. Foi verificada a mesma frequência três (23,1%) dos genes ermA e ermC entre os isolados. Os genes ermA e ermC se fizeram presentes entre alguns dos isolados de Staphylococcus spp. do hospital estudado e apesar do fenótipo MLSBi ter sido menos frequente que o MLSBc, é importante a realização do teste D para detectá-lo e assim, orientar condutas terapêuticas.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T06:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_MarceloAddasde_D.pdf: 1285336 bytes, checksum: 9f0a8c27299796261470ed0167c4e315 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Citocinas inflamatórias como IL-1a e ß, IL-1RA, IL-6, IL-10 e TNF estão envolvidas na resposta imune inclusive na ocorrência de reação febril não hemolítica. Podem acumular nos concentrados de plaquetas (CPs) durante o armazenamento ou serem liberadas por células do receptor de transfusão. Alguns polimorfismos dos genes destas citocinas interferem na produção frente a estímulos. O presente trabalho tem como objetivo avaliar a importância dos polimorfismos IL1B-511C/T, IL1+3953C/T, IL1RN intron2 VNTR, IL6-174G/C, IL10-1082G/A, IL10-819C/T, TNF308G/A e TNF+252G/A em pacientes multitransfundidos e em doadores de sangue, utilizado para produção de CPs, através da avaliação da ocorrência precoce de RFNH associada a transfusão de concentrado de hemácias ou do acúmulo de IL-1a e ß, IL-1RA e TNF nos CPs. Utilizamos o método PCR e digestão com enzimas de restrição (PCR-RFLP) ou sequenciamento automatizado para identificações destes polimorfismos. Em nossa amostra de população da região de Campinas, São Paulo, encontramos freqüências genotípicas comparáveis às populações européia e norte americana e diferenças significativas das populações asiática e de origem africana. O raro alelo IL1RN*0 foi identificado em nosso grupo, não foi demonstrado interferência deste alelo, em heterozigose, na expressão do gene IL1RN em modelo in vitro. Nos CPs obtidos de plasma rico em plaquetas (CP-PRP) foi observado maior acúmulo de IL-1ß nos doadores IL1B-511CC, evidenciado no D5 e D7 de armazenamento. Foi observada correlação inversa entre o conteúdo de plaquetas nos CP-PRP e o acúmulo de IL-1ß e TNF, não havendo correlação com a contaminação leucocitária. Não houve acúmulo de IL-1a e IL- 1RA durante o armazenamento. No grupo de pacientes multitransfundidos, o alelo IL1RN*2 e o genótipo IL1RN*2.2 correlacionaram-se com a ocorrência de RFNH precoce. Concluímos que, o estudo de características genéticas dos doadores de sangue e pacientes pode ajudar a esclarecer as variações de ocorrência e gravidade dos efeitos adversos associados à transfusão de sangue, identificando grupos de maior risco e delineia uma nova linha de investigação / Abstract: Inflammatory cytokines such as IL-1a e ß, IL-1RA, IL-6, IL-10 and TNF have been related with immune responses including febrile non-hemolytic reactions. These biological mediators may accumulate in platelet concentrates (PCs) during storage or be secreted by receptor immune cells. Many cytokine gene polymorphisms interfere in the production of cytokines after stimulus. The present study aims to value the significance of polymorphisms IL1B-511C/T, IL1B+3953C/T, IL1RN intron2 VNTR, IL6-174G/C, IL10-1082G/A, IL10-819C/T, TNF308G/A and TNF+252G/A in multitransfused patients and in PCs donors using the evaluation of precocious FNHTR occurrence associated with red blood cells (RBCs) transfusion or accumulations of IL-1a e ß, IL-1RA and TNF in PCs during storage. The methods used were based on PCR and restriction enzymes (PCR-RFLP) or automated DNA sequencing for polymorphism characterizations. In our population sample from Campinas, southeast Brazilian region, we detected similar genotype frequencies to European and North American populations and significant differences to the Asiatic and African ones. A rare allele IL1RN*0 was detected in our control group, we did not demonstrate the interference of this allele in heterozygousity, in the IL1RN gene expression in the in vitro model. In PCs from plasma rich in platelet (PRP-PC), we observed increased IL-1ß accumulation in PCs from IL1B-511CC blood donors on storage days 5 and 7 (D5 and D7). IL-1ß and TNF levels were inversely correlated with platelet content in PRP-PCs and no correlation with leukocyte content. There was no increase in IL-1a e IL-1RA levels during storage. In the multitransfused patients group, the IL1RN*2 allele and IL1RN*2.2 genotype were correlated with the occurrence of precocious FNHTR. We concluded that studies of genotypic characteristics of blood donors and patients might contribute to explain the variations in frequencies and gravity of side effects related with blood transfusion characterizing high risk groups and may outline a new and promising investigation field / Doutorado / Hematologia e Hemoterapia / Doutor em Clínica Médica

Orientador : Maricilda Palandi de Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T02:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_Marcelade_D.pdf: 7604801 bytes, checksum: 0b23f9a3d92f5bcf70fdc90d708e3c03 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado / Genetica Humana e Medica / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

FAPEAL - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas / Estima-se que 50% dos genes codificadores de proteínas possuem oscilação rítmica em diferentes tecidos de mamíferos. Curiosamente, metade das proteínas desses genes possuem seus RNAm correspondentes com expressão constitutiva (arrítmica), ressaltando a relevância de eventos pós-transcricionais para a oscilação de proteínas. Os “High throughput Assays” (HTA) circadianos são extremamente importantes, pois fornecem informações acerca da expressão de milhares de transcritos e de proteínas, uma rica coleção cronobiológica que pode ajudar na resolução de diferentes problemas científicos, não apenas os abordados nas pesquisas originais. Embora altamente reprodutivos e informativos, ensaios de biologia molecular circadiana apresentam algumas divergências em seus resultados, ressaltando a necessidade do aprimoramento de métodos de normalização e análise dos diferentes ensaios de expressão. Até o momento, não se conhecem os impactos da normalização do RNA em ensaios de expressão de pequenos RNAs, como miRNAs. Este estudo objetivou: (1) analisar a co-expressão de miRNAs e RNAm e proteínas de genes alvos; (2) identificar e validar miRNAs candidatos ao sistema molecular circadiano; (3) analisar o impacto da normalização do RNA total em estudos circadianos de miRNAs. Através da sistematização de diferentes dados circadianos de HTA (RNA-seq, small RNA-seq, Chip-seq e proteoma), de bioinformática e de interações miRNA:RNAm validadas, identificamos uma lista de 152 microRNAs (miRNAs) candidatos ao controle pós-transcricional dos ritmos moleculares. Desses, os dois mais relevantes, miR29b-3p e miR-23b-3p, foram experimentalmente validados como importantes para a manutenção do período dos ritmos das células U2OS PER2:LUC. Análises de HTA também permitiram a identificação de diferenças nas fases de expressão de miRNAs 3p e 5p, com genes alvos divergentes. Interessantemente, a identificação de padrões de expressão de RNAm e proteínas de genes alvos de miRNAs, permite sugerir um mecanismo de ajuste das amplitudes dos ritmos das proteínas dependente da fase do RNAm. Por fim, através do controle de etapas experimentais, demonstramos oscilação circadiana na concentração do RNA total de diferentes regiões de cérebros de camundongos. A normalização desse ritmo, durante a síntese de cDNA, afeta o perfil de expressão de transcritos, incluindo os dos genes relógio Per1-2 e Bmal1. Ademais, através de análises com RNA exógeno, ou spike-ins, demonstramos que o ajuste da concentração do RNA compromete a análise de miRNAs, possivelmente por interferências nos rendimentos de extração e nas reações de síntese de cDNA. Este estudo apresenta dois novos miRNAs importantes para a manutenção da ritmicidade circadiana e uma nova estratégia de análise de qPCR para estudos cronobiológicos de miRNAs.