Les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs) sont impliqués dans la recapture du glutamate du cytosol vers les vésicules présynaptiques. Depuis leurs caractérisations récentes en 2000, leurs implications dans plusieurs maladies neurodégénératives ont été démontrées. Ils jouent ainsi un rôle primordial dans la transmission nerveuse glutamatergique. Deux colorants naturels, le Rose Bengale et le Bleu Trypan, restent les meilleurs inhibiteurs connus à ce jour, avec respectivement des CI50 de 25 et 50 nM. Dans un premier temps, nous avons conçu et optimisé une série d’analogues basée sur le synthon Rose Bengale (inhibiteur non-compétitif). Ce travail a notamment permis de mettre en évidence l’effet des formes tautomères (quinone et lactone) sur l’inhibition des VGLUTs. Ainsi la forme quinonique, présente à pH physiologique, a été confirmée comme étant la seule capable de bloquer la recapture du glutamate. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la famille du Bleu Trypan (inhibiteur compétitif) et nous avons déterminé la structure minimale active avec l’objectif de rendre ces molécules plus « drug-like ». En effet, l’intérêt de ce projet est de développer de petites structures aisément radiomarquables pour une utilisation dans un contexte physio-pathologique. / Vesicular glutamate transporters (VGLUTs) are involved in the recapture and storage of glutamate from cytol to secretory synaptic vesicules. Since their recent characterization in 2000, their implication in several neurodegenerative disorders have been demonstrated. They play a crucial role in glutamatergic neurotransmission. Natural dyes, such as Rose Bengal and Tryptan Blue are the best known inhibitors with IC50 values of 25 and 50 nM, respectively. Firstly, we designed and optimized a series of analogues based on the synthon Rose Bengal (non-competitive inhibitor). This work has especially enabled to highlight the effect of tautomeric forms (quinone and lactone) on the inhibition of VGLUTs. Thus, the quinone form, present at physiological pH, was confirmed as the only able to block the reuptake of glutamate. Secondly, we have been interested in the family of Trypan Blue (competitive inhibitor) and we determined the minimal active structure in order to render these molecules more "drug-like". Indeed, the interest of this project is to develop small structures easily radiomarquable to use in a physiopathological context.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluRs) sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) modulant la transmission synaptique au sein du système nerveux central. D'un point de vue structural, ils ont la particularité de posséder un large domaine extracellulaire, le Venus Flytrap (VFT), où se lie leur ligand endogène, le glutamate. Leur domaine transmembranaire à 7 hélices, commun à tous les RCPGs, est connu pour être la cible d'une nouvelle classe de molécules à visée thérapeutique, les modulateurs allostériques. Au contraire, le VFT est le siège du développement de ligands compétitifs du glutamate et peu de choses sont connues quant à l'existence de modulateurs allostériques du VFT. Des études récentes ont mis en évidence une sensibilité des mGluRs aux ions extracellulaires et en particulier au chlore (Cl-), sans que son site de liaison ne soit identifié. Dans ce contexte, ce travail de thèse explore la possibilité d'une modulation allostérique endogène des mGluRs par les ions Cl-, en identifiant leur(s) site(s) de liaison(s) et leur effet sur la dynamique conformationnelle et la fonction des récepteurs. En combinant une approche pharmacologique, biophysique basée sur la technique de FRET, et la modélisation, nous avons tout d'abord confirmé que le Cl- potentialise l'action du glutamate sur tous les mGluRs et qu'il favorise la conformation active des récepteurs en se liant au niveau du VFT. Les mGluRs présentent également une sensibilité différente au Cl-, mGlu4 étant le plus sensible et mGlu2 le moins. Ceci s'explique notamment par le nombre de sites fonctionnels, tous les mGluRs dont mGlu4 possédant 2 sites par monomère à l'exception de mGlu2 qui n'en possède qu'un, en raison d'une mutation « clé » d'une sérine en aspartate dans le lobe 1 du VFT. D'autre part, le récepteur mGlu3 est apparu comme un cas particulier ayant une sensibilité accrue au Cl-, son domaine VFT cumulant la présence et l'orientation adéquate d'acides aminés formant un « verrou » Cl-, qui favorise de manière drastique la conformation active et une activité basale élevée de ce récepteur. Enfin, la modélisation de la variation de la concentration extracellulaire en Cl- lors d'une activité synaptique GABAergique est compatible avec une modulation des mGluRs les plus sensibles. En conclusion, le Cl- est un modulateur allostérique endogène des mGluRs et l'exploitation de ses sites de liaison au sein du VFT pourrait permettre le développement de nouveaux agents thérapeutiques. / Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are G coupled-protein receptors (GPCRs) playing key roles in synaptic transmission in the central nervous system. They display a large extracellular domain, the Venus Flytrap (VFT) where the endogenous ligand, glutamate, binds. Their 7 transmembrane helices spanning domain, common to all GPCRs, is known to be the target of new therapeutic compounds, called allosteric modulators. In contrast, VFT domain is used to develop glutamate competitive ligands and there are only few data about allosteric modulators targeting the VFT. Recent studies have shown mGluRs are sensitive to extracellular ions, particularly to chloride (Cl-), although its binding site has not been elucidated. This thesis work explores the possibility of an endogenous allosteric modulation of mGluRs by Cl-, aiming to delineate its binding site(s) and its effect on receptor conformational dynamics and function. Using pharmacological, FRET based biophysical approaches and modelling, we have first confirmed that Cl- potentiates glutamate action in all mGluRs and that this ion favors agonist induced active conformation by binding to the VFT. mGluRs are also differently sensitive to Cl-, mGlu4 being the most and mGlu2 the least. This difference is notably explained by the number of Cl- functional sites within the VFT, all mGluRs including mGlu4 displaying 2 sites per monomer whereas mGlu2 has only 1 site due to a serine-aspartate “key” mutation in VFT lobe 1. Besides, mGlu3 receptor appears to be a “special case”, as this receptor is highly sensitive to Cl- because its VFT domain is carrying amino acids creating a “Cl- lock”, which dramatically favors active conformation and a high level of basal activity. Finally, modelling of extracellular Cl- concentration variations in a GABAergic synapse is compatible with a modulation of the most sensitive mGluRs. In conclusion, Cl- is an endogenous allosteric modulator of mGluRs and exploiting its binding sites may yield to the development of innovative therapeutic tools.

MeCP2 est une protéine multifonctionnelle agissant à de nombreux niveaux de contrôle des programmes génétiques. Un mauvais dosage de MeCP2 cause un groupe de maladies neurologiques dont le point commun est une déficience intellectuelle sévère. Des mutations ou une délétion de MECP2 causent le syndrome de Rett chez les filles, alors que sa surexpression cause chez les garçons le syndrome de duplication de MECP2. Plusieurs modèles murins de Mecp2-pathies ont été générés qui permettent d’expliciter les mécanismes qui sous-tendent l’apparition des symptômes dans ces différentes maladies. Dans notre laboratoire, deux modèles murins sont utilisés: le modèle Mecp2tm1Bird qui présente une déficience en Mecp2 et le modèle Mecp2Tg1 présentant une surexpression de Mecp2. Ce travail de thèse a permis de caractériser l’évolution postnatale des déficits moteurs et physiologique affectant la souris Mecp2Tg1. Nos résultats montrent que la surexpression de Mecp2 conduit à l’apparition de problèmes moteurs, et des convulsions chez la souris. En parallèle, nous avons étudié les déficits neuronaux affectants la voie GABAergique et glutamatergique chez la souris déficiente en Mecp2. Nous avons montré que la déficience en Mecp2 cause une dérégulation de la transmission synaptique dépendante du ‘territoire’ et de l’âge de la maladie. Ces dérégulations sous-tendent vraisemblablement des différences neurophysiologiques importantes entre les régions du cerveau qu’il nous reste encore à découvrir. Par ailleurs, nous avons constaté que la stimulation pharmacologique du système GABAergique par la Tiagabine, permet d’augmenter la survie des animaux Mecp2-déficients. / MeCP2 is a multifunctional protein acting on many levels of control of genetic programs. Thus, an abnormal dosage of MeCP2 protein causes a group of neurological disorders with a common feature of severe intellectual disability. Mutations or deletions in MECP2 gene cause Rett Syndrome in females, whereas in boys its overexpression causes the MECP2-duplication Syndrome. Several mouse models of MECP2-pathologies were generated. The use of these models is crucial for understanding the mechanisms underlying the onset of symptoms related to the pathology. In our laboratory, two mouse models are under study: The Mecp2tm1Bird model with an Mecp2 deficiency and the transgenic Mecp2Tg1 model with a double expression of Mecp2. My thesis work enabled the characterization of the postnatal physiological and motor deficits affecting Mecp2Tg1 mice. My work led to a better understanding of the gene dosage effect. Our results showed that overexpression of Mecp2 in mice, led to the occurrence of motor problems, and seizures. In parallel, we studied the neural deficits affecting the GABA and the glutamate pathway in several structures of the Mecp2 deficient brain (Mecp2tm1bird). We showed that Mecp2-deficiency causes deregulation of the synaptic transmission, which is dependent on the area, and the age of the study. These deregulations underlie significant neurophysiological differences between the different regions of the brain that we still have to uncover. Furthermore, we found that pharmacological stimulation of the GABA system with Tiagabine, a molecule capable of acting on GABA transporters to prevent its uptake, increases the survival of Mecp2-deficients animals.

La synapse glutamatergique est formée par une présynapse axonale et une postsynapse dont le support est l'épine dendritique. L'épine présente des récepteurs membranaires du glutamate liés à des protéines d'échafaudage sous-membranaires. Ces protéines de la densité postsynaptique (PSD) permettent de relier les récepteurs à leurs voies de signalisation. Les récepteurs NMDA sont reliés aux récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR1/5) via le complexe PSD95/GKAP/Shank/Homer. Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé la dynamique d'interactions protéiques au sein de ce complexe et étudié les conséquences fonctionnelles sur l'activité des récepteurs.Homer est une protéine multimérique reliant mGluR5 au complexe PSD95/GKAP/Shank. La forme monomérique Homer1a est incapable de relier mGluR5 à Shank. Nous avons montré que la rupture du complexe par l'expression de Homer1a permet une interaction directe entre les récepteurs NMDA et mGluR5 et une inhibition des courants NMDA. Nous avons validé que ce processus intervient lors de la potentialisation synaptique. J'ai également étudié le rôle de l'interaction entre GKAP et DLC2, une chaîne légère de transporteurs moléculaires. Après avoir caractérisé l'occurrence et la dynamique de l'interaction GKAP-DLC2, j'ai montré que l'activité neuronale entraîne une augmentation de cette interaction et une accumulation synaptique de GKAP. De plus, cette interaction permet d'acheminer PSD95 dans les épines et d'augmenter les courants NMDA. L'ensemble de ces résultats montre que les protéines d'échafaudage participent à la signalisation des récepteurs, modulent la transmission synaptique et sous-tendent les mécanismes de plasticité à long terme. / The glutamatergic synapse is composed by an axonal presynapse and a postsynapse which is supported by a dendritic spine. The spine contains membrane glutamatergic receptors connected to sub-membrane scaffolding proteins. These postsynaptic density (PSD) proteins allow to link receptors to their signaling pathways. NMDA receptors are associated to metabotropic glutamate receptors (mGluR1/5) through the PSD95/GKAP/Shank/Homer protein complex. During my PhD, I have characterized protein-protein interactions dynamic in this complex and studied functional consequences on receptor activity.Homer is a multimeric protein linking mGluR5 to the PSD95/GKAP/Shank complex. The monomeric form Homer1a is unable to connect mGluR5 to Shank. We have shown that complex disruption by Homer1a expression induces a direct interaction between NMDA and mGluR5 and subsequent inhibition of NMDA currents. We have shown that this process occurs during synaptic potentiation.I have also studied the interaction between GKAP and DLC2, a light chain shared by molecular transporters. I have characterized the occurrence and dynamic of GKAP-DLC2 interaction and shown that neuronal activity increases this interaction leading to synaptic accumulation of GKAP. Moreover, this interaction allows PSD95 targeting into dendritic spines and NMDA currents increase. Together, these results show that scaffolding proteins participate to receptor signaling, modulate synaptic transmission and underlie long-term synaptic plasticity mechanisms.

Accidents Vasculaire Cérébraux (parfois appelés AVC ou attaques cérébrales) sont les 3èmes causes principales de mortalité et les causes de handicap dans les pays industrialisés. Ils représentent un problème de santé publique en raison de leurs fréquences, de leurs mortalités et des handicaps physiques et cognitifs qu'ils entraînent. Malgré d’importants progrès réalisés dans le domaine de la physiopathogénie de l’ischémie cérébrale, on ne dispose pas encore, aujourd’hui, de thérapeutiques efficaces pour traiter un accident vasculaire cérébral lors de sa phase aiguë. Les gangliosides GM1 sont des composants majeurs du feuillet externe de la membrane cellulaire au niveau du système nerveux central. Ces gangliosides ont des effets antineurotoxiques, neuroprotecteurs et les propriétés neurorestoratrices sur les divers neurotransmetteurs du SNC mais pour le moment ils n’ont pas des valeurs thérapeutiques en raison de leurs manques de biodisponibilités et de leurs manques de perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Nous avons synthétisé les structures simplifiées de ces gangliosides GM1, L’idée qui a prévalu pour la conception, des nouvelles structures a été : d’introduire des chaînes grasses saturées ou insaturées sur un motif sérine, tyrosine ou cystéine, de remplacer la fonction carboxylique par des groupements reconnus comme bioisostères classiques ou non classiques de cette fonction ; comme par exemple les fonctions phosphonique, tétrazolique, 2,4-oxadiazolidine-3,5-dione. Nous avons élaboré un nouveau modèle de composé neuroprotecteur dans lequel une chaîne grasse est couplée à une entité acide ascorbique pour améliorer le passage de la BHE. Pour étudier l’activité neuroprotectrice des composés synthétisés nous avons utilisé deux modèles biologiques in vitro : un modèle cellulaire (cellules HT22) et un modèle tissulaire (tranches de cerveaux). / Stroke is the third leading cause of mortality and the primary cause of disability in adults. Therefore, it is critical to identify new, efficacious pharmacological treatments. One pharmacological approach for treatment of stroke is called neuroprotective therapy. It has been reported that the amphiphilic, monosialotetrahexosylganglioside (GM1) (II3 NeuAc-GgOsc4Cer) has antineurotoxic, neuroprotective, and neurorestorative effects on various central neurotransmitter systems. Since GM1 is not of therapeutic value because of its lack of bioavailability and its low blood-brain barrier (BBB) permeation. Thus, molecules that mimic GM1 represent a novel approach to neuroprotection. We have synthesized the smalls GM1-like analogues whose simplified structure includes various lipophilic saturated, unsaturated, or cyclic polyunsaturated moieties have been introduced, while in the second series, thecarboxylic acid function was replaced by different hydrophilic groups including bioisosters of the carboxylate, such as a phosphonic acid, a tetrazole, the 1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione or an ascorbic acid moiety. Introduction of ascorbic acid was supported by several reports that showed that ascorbic acid conjugates can improve BBB permeation properties. We report their neuroprotective effects in two distinct models of nerve cell death using hippocampus-derived HT22 cells and an additional neuroprotective assays using cortical slices injured by glutamate confirmed these results.

Avant sa libération, le glutamate est accumulé dans des vésicules synaptiques par trois transporteurs vésiculaires (VGLUT1-3). Les cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée n'expriment que VGLUT3. Pour étudier son rôle dans la physiologie cochléaire, nous avons utilisé une lignée de souris dont le gène Slc17a8, qui code pour VGLUT3, a été invalidé par recombinaison homologue. Les mutants ne présentaient pas de réponse nerveuse à une stimulation sonore. Les mécanismes d'exocytose des CCI étaient normaux et leurs synapses normales en microscopie électronique. Des immunoblots montraient que le transporteur membranaire du glutamate GLAST, ainsi que les sous-unités GLUR2 et NR1 des récepteurs AMPA et NMDA étaient toujours exprimées. Enfin, des potentiels auditifs du tronc cérébral étaient enregistrés après une stimulation électrique au niveau de la fenêtre ronde. Toutefois, nos résultats indiquent des diminutions de ~50% des synapses afférentes et de ~40% des neurones auditifs primaires ainsi qu'une réduction importante des terminaisons efférentes latérales sous les CCI.SLC17A8 est responsable de la surdité de perception non syndromique dominante DFNA25. Nous avons identifié une mutation dans l'exon 5 conduisant au remplacement de l'Alanine211 en Valine. Cette Alanine est conservée dans les VGLUT3 de différentes espèces ainsi que dans les VGLUT1-3 humains, suggérant un rôle fonctionnel important pour cet acide aminé. Nous avons caractérisé les propriétés biochimiques de la mutation A211V en culture de cellules. Le transporteur muté était correctement adressé aux boutons présynaptiques. Cependant, la mutation pA211V entraîne un défaut d'expression important en partie expliqué par le fait que le codon codant la valine est un codon rare. De plus, les études du transport de glutamate ont montré que la forme mutée est hyperactive par rapport à la forme native. L'ensemble de ces résultats montre que la mutation entraine un phénotype cellulaire complexe. / Before its release, glutamate is accumulated into synaptic vesicles by three vesicular glutamate transporters (VGLUT1-3). Only VGLUT3 is expressed in the inner hair cells (IHCs) of the cochlea. To study its role in the hearing physiology, we used a mouse in which the Slc17a8 gene, which encodes VGLUT3, has been null-mutated. In this VGLUT3-/- mouse, no auditory nerve response to acoustic stimuli could be recorded. All the others cochlear potentials were normal. The genetic deletion of Slc17a8 in mice resulted in a profound deafness, without altering the IHCs synapse morphology and the synaptic vesicles turnover. Using western blot, we then observed that the glutamate-aspartate transporter GLAST and the GLUR2 and NR1 subunits of AMPA and NMDA receptors were always expressed. Finally, auditory brainstem responses could be elicited by electrical stimuli on the round window. However, VGLUT3-/- IHCs presented a ~50% loss of IHCs synapses and a ~40% loss of primary auditory neurons. The number of lateral olivocochlear synapses with primary auditory neurons dendrites was strongly reduced.The SLC17A8 gene is responsible for DFNA25, an autosomal dominant progressive, high-frequency nonsyndromic deafness. We identified a heterozygous non-synonymous missense mutation in exon 5, leading to the amino acid change p.A211V. The A211 residue is conserved in VGLUT3 across species and in all the human VGLUT subtypes (VGLUT1-3), suggesting an important functional role. We characterized the biochemical properties of the A211V mutation in cell culture. Our results suggest that the mutated VGLUT3 was correctly addressed at the presynaptic boutons. However, the pA211V mutation induced an expression decrease because the valine codon is a rare codon. Moreover, the glutamate uptake is increased with the mutated VGLUT3. All these results shows that this mutation involves a complex cellular phenotype.

En dépit de progrès considérables, le cancer reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Actuellement, 90% des décès liés au cancer sont causés par la propagation de cellules cancéreuses vers des organes distants. Une fois implantées et disséminées, les métastases sont beaucoup plus difficiles à détruire par les moyens de la chimiothérapie.A la suite d’un processus d’intravasation, certaines cellules tumorales s’échappent de la tumeur primaire et empruntent les systèmes circulatoires avant d’être ensuite extravasées, puis distribuées et finalement disséminées dans divers organes. Ainsi, dans l’environnement circulatoire, ces cellules tumorales circulantes (CTCs) se trouvent particulièrement accessibles aux agents thérapeutiques. Dans ce cadre, nous avons imaginé d’utiliser des nanoparticules à architecture contrôlée, afin d’intercepter de manière sélective ces cellules dans l’environnement sanguin.Dans cet objectif, nous avons synthétisé par ouverture de cycle de la lactone correspondante des copolymères amphiphiles di- et tri-blocs du poly(glutamate de benzyle). Leur auto-assemblage a permis d'obtenir des nanoparticules amphiphiles de taille inférieure à 100 nm et de potentiel ζ négatif, dont la géométrie contrôlable va de la forme sphérique (rapport d'aspect 1.3) à la forme ellipsoïdale (oblats) (rapport d'aspect 2,6) et qui présentant en surface des chaînes de PEG sous des conformations et des densités de surface contrôlées.En raison de leur capacité de circuler dans le compartiment sanguin, ces nanoparticules ont une probabilité d’interaction optimale avec les CTCs.L’impact de la modification de leur architecture a été établi en étudiant les capacités d’interactions des différentes nanoparticules préparées, d’une part avec les protéines plasmatiques et d’autre part, avec les différents types cellulaires rencontrés dans le compartiment sanguin.Les résultats les plus marquants montrent que l’élongation des nanoparticules (oblats) et l’anisotropie de leur surface, caractérisée par leur balance hydrophile/lipophile, gouvernent profondément leurs interactions. De manière fort intéressante, il apparaît que l’élongation des particules dont la surface est uniformément hydrophile diminue l’intensité de leur capture par les différents types cellulaires modèles étudiés (HUVECs modèle de cellules endothéliales), cellules RAW 276.7 (modèle de macrophages) et cellules PC3 (cancer de la prostate) et B16 (mélanome). En revanche, lorsque ces nanoparticules présentent une anisotropie de surface, leur capture par ces différents types cellulaires est augmentée avec l’élongation des particules (facteur d’élongation de 2,1).Dans un dernier volet expérimental, ces nanoparticules ont été modifiées par greffage de la protéine MART1 à leur surface. Ces immuno-nanoparticules ont montré une certaine capacité de reconnaissance des cellules B16 (modèle du mélanome). Leur efficacité après injection intraveineuse devra toutefois être précisée in vivo. / Despite the considerable progress, cancer remains one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. Currently, 90% of cancer deaths are caused by the spread of cancer cells to distant organs. Once implanted and disseminated, metastases are much more difficult to destroy by means of chemotherapy.Following a process of intravasation, some tumor cells escape from the primary tumor and migrate through the circulatory systems before being extravasated, then distributed and finally disseminated in various organs. Thus, in the circulatory environment, these circulating tumor cells (CTCs) are particularly accessible to therapeutic agents. In this context, we have imagined the use of nanoparticles with controlled architecture, in order to selectively intercept these cells in the blood environment.For this purpose, we have synthesized by ring opening of the corresponding lactone, amphiphilic di- and tri-block copolymers of poly (benzyl glutamate). Their self-assembly made it possible to obtain amphiphilic nanoparticles smaller than 100 nm in size and with a negative ζ potential, whose controllable geometry ranges from spherical (aspect ratio 1.3) to ellipsoidal (oblates) (aspect ratio 2, 6) and having PEG chains on the surface under controlled surface conformations and densities.Due to their ability to circulate in the blood compartment, these nanoparticles have an optimal probability of interaction with CTCs.The modification impact of their architecture has been established by studying the interaction capacities of the different nanoparticles prepared. On the one hand with the plasma proteins and on the other hand, with the different cell types encountered in the blood compartment.The most striking results show that the elongation of the nanoparticles (oblates) and the anisotropy of their surface, characterized by their hydrophilic / lipophilic balance, strongly govern their interactions. Interestingly, it appears that the elongation of particles whose surface is uniformly hydrophilic decreases the intensity of their capture by the different types of cell models studied (HUVEC model endothelial cells), RAW 276.7 cells (macrophage model) and cells PC3 (prostate cancer) and B16 (melanoma). Although, when these nanoparticles exhibit surface anisotropy, their capture by these different cell types is increased with the elongation of the particles (elongation factor of 2.1).In a final experimental part, these nanoparticles were modified by grafting the MART1 protein on their surface. These immuno-nanoparticles showed a certain recognition capacity of B16 cells (melanoma model). However, their efficacy after intravenous injection should be specified in vivo.

There are currently over 430 known SLC transporters, over 30% of which have an unknown function. Compared to other transporter gene families, the SLC genes are relatively understudied with many orphan genes. SLC transporters have a high disease relevance and can be associated with many different diseases like gout, type 2 diabetes and different forms of cancer. SLC transporters also appear to be very druggable, thus offering a rare opportunity of an underexplored gene family, that can be linked to many diseases and seem to have a general druggability with small organic molecules. This thesis is evaluating three specific SLC transporters of the SLC38 family to discover their different roles and purposes. In this project CRISPR-Cas9 is used to knockout three SLC38 transporters, called SNAT6, SNAT8 and SNAT10. The cell-line used is HEK293 cells, as they are easy to transfect and are thought to express the three genes, however it is not certain that they do express the three SNAT genes. The project aims to optimize the method for best possible transfection by trying different protocols. A literature study is done on what the future experiments of the knocked-out cells could be, including; ensuring the HEK293 cells express the three genes, controlling the effectiveness of the transfection and analyzing the result of such a transfection. To confirm that the HEK293 cells do express the three SNATs a western blot assay could be performed. RT-qPCR is found to be useful in evaluating whether the knockouts are successful, by measuring if the three SNAT transporter proteins are present or not in the knocked-out cells. A metabolic analysis study to determine the result of the knockouts is also described as a future experiment. The experimental finding was a CRISPR-Cas9 transfection method that yielded enough RNA, enabling future experiments such as RT-qPCR.

This work reports a novel biocompatible and biodegradable arborescent amphiphilic polypept(o)ides-based polymer poly(γ-benzyl L-glutamate)-co-poly(γ-tert-butyl L-glutamate)-g-polysarcosine (P(BG-co-Glu(OtBu))-g-PSar) as a smart dual-responsive targeting drug vehicle. The synthesis pathway in this work highlighted the grafting reaction improvement of the polypeptides core and using polysarcosine (PSar) corona as a coating agent. The responsiveness of the polymer is caused by the pH sensitivity of the polypeptides and the reducible linker introduced between the core and corona. While adding the tripeptides arginine, glycine, and aspartate (RGD) as a ligand on the unimolecular micelles’ surface increases the targeting ability of the polymer. During the building of the arborescent, the coupling sites were controlled by using γ-tert-butyl L-glutamate (Glu(OtBu)-NCA) as a second monomer besides γ-benzyl L-glutamate (BG-NCA) since the deprotection conditions are different for Bz and tBu groups. Knowing the coupling sites provides accuracy in calculating the molecular weight (MW) of graft polymers since it facilitates the determination of the grafting yield (Gy). The arborescent unimolecular micelles were formulated by coating the hydrophobic core with PSar hydrophilic corona. The distribution of the coupling sites on the substrates in the last generation yielded end-grafted and randomly-grafted unimolecular micelles. A comparison between those micelles by DLS, TEM, and AFM revealed that the end-grafted micelles showed more uniformity in terms of morphology and size distribution. Also, the surface modification achieved via RGD addition increased the shape uniformity and contributed to avoiding the particles’ aggregation. The sizes and shapes of end-grafted unimolecular micelles match the drug delivery systems (DDSs) requirements. Doxorubicin (DOX) was encapsulated physically into the unimolecular micelles to study the drug loading capacity (DLC) and drug loading efficiency (DLE). The maximum DLC and DLE were 14% and 28% w/w, respectively. The drug release profiles were investigated in healthy- and cancer-mimicking media. The results showed that in cancer-mimicking microenvironment (low pH and high glutathione (GSH) content), the drug diffused out the micelles faster. In addition, a slower drug release was noticed for RGD decorated unimolecular micelles. Finally, the biocompatibility, cytotoxicity, and cellular uptake of the unimolecular micelles were studied. The obtained results were promising as the arborescent unimolecular micelles showed excellent biocompatibility; meanwhile, the DOX-loaded unimolecular micelles have good cytotoxicity compared to free DOX. RGD targeting ligand contributes to increasing the cellular uptake and supports the sustained release.

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