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Haloferax mediterranei es un microorganismo halófilo extremo que se incluye dentro del Dominio Archaea. Es capaz de crecer utilizando carbohidratos, ácidos carboxílicos, alcoholes y aminoácidos como fuentes de carbono y energía. Además, puede crecer en medio definido en presencia de glucosa como única fuente de carbono, y con nitrato o nitrito como única fuente de nitrógeno a través de la vía de asimilación utilizando las nitrato y nitrito reductasas asimilativas. El nitrato lo utiliza reduciéndolo a amonio, el cual es incorporado a esqueletos carbonados vía glutamato deshidrogenasa (GDH) en condiciones de exceso de nitrógeno o mediante la ruta glutamina sintetasaglutamato sintasa (GS-GOGAT) bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno. La glutamina sintetasa (GS; EC 6.3.1.2) se encuentra en todos los Dominios, que participa en la asimilación del amonio y en la biosíntesis de glutamina, actuando como donador de nitrógeno para la síntesis de proteínas y de ácidos nucleicos. Esta enzima cataliza la biosíntesis de glutamina mediante la reacción biosintética dependiente de magnesio o manganeso, a partir de glutamato, ATP y amonio. En el genoma de Hfx. mediterranei se localizaron tres genes que presentaron homología con glutamina sintetasa, en base a la presencia de tres dominios conservados (COG0174: transporte y metabolismo de aminoácidos; pfam00120: dominio catalítico y pfam03951: dominio beta-Grasp) que se utilizan para identificar a las GSs. También se observó que uno de los genes mantiene conservadas las tres secuencias consenso características de GSs (glnA), mientras que los otros dos genes (glnA-2 y glnA-3) contienen parcialmente conservada una de ellas. Con el objetivo de conocer qué funciones desempeñan estas tres proteínas en la asimilación del nitrógeno, y si concretamente glnA-2 y glnA-3 ejercen un papel importante en este proceso, cada una de las tres proteínas halofílicas se clonó y expresó heterólogamente en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, utilizando el vector de expresión pET3a, obteniéndose las proteínas en forma de cuerpos de inclusión. Cada una de estas fracciones sólidas se solubilizaron utilizando urea 8 M, y posteriormente se diluyeron en un tampón conteniendo NaCl 2 M y DTT 5 mM para conseguir su renaturalización. Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de cada una por separado mediante una única etapa a través de una cromatografía en DEAE-celulosa; obteniéndose puras cada una de las proteínas y concentradas de forma rápida y con un buen rendimiento. La caracterización de la GS (GlnA) recombinante indicó que se trataba de una enzima dependiente de metales catiónicos divalentes, regulada por los efectores 2-oxoglutarato y glutamina. La proteína fue activada por 2-oxoglutarato e inhibida por glutamina. Mediante la técnica de velocidad de sedimentación se determinó que su estructura oligomérica consistía en 12 subunidades y se clasificó como GS tipo I, incluida en la subdivisión α. Se generaron mutantes de deleción de glnA y glnA-3 en Hfx. mediterranei mediante la técnica pop-in pop-out, que permitió la sustitución de una secuencia concreta del genoma por otra modificada in vitro. Para la obtención de los mutantes se utilizó la cepa HM26 (ΔpyrE2) de Hfx. mediterranei. Primeramente, se construyó un cassette de deleción para la obtención de un producto de fusión de 1000 pb (versión incompleta del gen) que se clonó en el vector pMH101N, conteniendo una copia del gen pyrE2, el cual se utilizó como marcador genético. Los mutantes pop-in se seleccionaron en un medio carente de uracilo, ya que sólo las células que codificaron el gen pyrE2, presente en el plásmidos suicida, pudieron sintetizar de novo dicho compuesto y crecer. Posteriormente, el plásmido suicida se perdió y junto con él una de las copias del gen, delecionada u original (mutante pop-out). Finalmente se obtuvieron los mutantes de deleción para los genes glnA y glnA-3, de los cuales glnA resultó ser un gen esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina, puesto que aquellos mutantes que presentaron la deleción de glnA fueron incapaces de crecer en un medio definido carente de glutamina; se trató por tanto de mutantes auxótrofos para este aminoácido, que únicamente crecieron al adicionar glutamina en el medio de cultivo. Finalmente, para conocer el efecto que produce la fuente de nitrógeno sobre la expresión global de los genes en Hfx. mediterranei, se realizó un array de expresión de la cepa R4 (silvestre) y se determinó la expresión global de genes en tres medios de cultivo con diferentes fuentes de nitrógeno: cultivo con amonio como fuente de nitrógeno en fase estacionaria y exponencial de crecimiento, cultivo con nitrato en mitad de fase exponencial de crecimiento y cultivos con carencia de nitrógeno. Las principales diferencias en expresión de genes se detectaron en los medios de nitrato y carencia de nitrógeno con respecto a amonio, los resultados sugirieron que la ausencia de amonio fue el factor responsable para la expresión de genes implicados en la ruta de asimilación de nitrato. Concretamente, en carencia de nitrógeno la GS mostró una mayor expresión que en medio con amonio. Para analizar los cambios de expresión en los genes glnA-2 y glnA-3 se realizó un nuevo array de expresión de la cepa HM26-A (ΔpyrE2 ΔglnA) utilizando como control la cepa parental HM26 (ΔpyrE2). Se determinó la expresión en dos medios de cultivo, en medio complejo suplementado con glutamina 40 mM en mitad de fase exponencial de crecimiento y en medio con carencia en nitrógeno. Tanto en la cepa HM26-A con carencia en nitrógeno como en la cepa parental HM26 se detectaron cambios de expresión en los genes relacionados con la vía asimilativa del metabolismo del nitrógeno de esta arquea halófila. En la cepa HM26 en carencia de nitrógeno con respecto a medio complejo con gln 40 mM se mostró una menor expresión de los genes glnA-2 y glnA-3 y una sobreexpresión de glnA. Mientras que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión.que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión. En conclusión, la glutamina sintetasa de Hfx. mediterranei es una enzima de tipo GSI-α, dodecamérica, resultando ser una proteína esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina; siendo activa en condiciones de deficiencia de nitrógeno, a diferencia de las isoformas GlnA-2 y GlnA-3 que podrían ejercer un papel regulador de GlnA y posiblemente actúen en la célula en condiciones de abundancia de nitrógeno.

Haloferax mediterranei es un microorganismo perteneciente al Dominio Archaea que fue aislado por primera vez en las Salinas de Santa Pola, Alicante. Esta arquea halófila es capaz de crecer con glucosa como única fuente de carbono y con nitrato como única fuente de nitrógeno. En el interior celular, el nitrato se convierte en amonio mediante la nitrato y nitrito reductasas asimilativas. En función de su disponibilidad intracelular el amonio puede asimilarse mediante dos vías: a altas concentraciones de amonio, este se asimila mediante la vía de la glutamato deshidrogenasa (GDH), mientras que a bajas concentraciones de amonio, este se asimila por el ciclo glutamina sintetasa (GS)-glutamato sintasa (GOGAT). La GS (EC 6.3.1.2) es una enzima clave tanto en la asimilación de amonio como en la biosíntesis de glutamina y de otros aminoácidos. Está presente en todos los Dominios de la vida, considerándose como un buen reloj molecular de la evolución ya que su secuencia muestra homología en todos los organismos. La familia de la GS está dividida en tres clases (GSI, GSII y GSIII) dependiendo de su secuencia, el gen que la codifique y del organismo al que corresponda. El genoma de Hfx. mediterranei contiene tres marcos de lectura abiertos que muestran homología con la GS y están codificados por los genes glnA-1, glnA-2 y glnA-3. Los genes glnA-2 y glnA-3 se encuentran localizados muy próximos en el genoma, únicamente separados por 1,6 kb, y a su vez dichos genes están separados del gen glnA-1. La proteína codificada por el gen glnA-1 tiene una identidad del 51,9% y del 49,1% con las proteínas codificadas por los genes glnA-2 y glnA-3, respectivamente. Las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 muestran una identidad entre sí de un 60,9%. La proteína GlnA-1 mantiene parcial o completamente conservadas las tres secuencias consenso características de las GS, mientras que las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 únicamente mantienen parcialmente conservada una de ellas (putative ATP_binding región signature PS00181). Además, en base a la presencia de los dominios conservados se determinó que las tres proteínas GlnA de Hfx mediterranei presentan el dominio catalítico PF00120 (Gln-synt_C) utilizado para la identificación de las GS tipo l. Analizando los aminoácidos presentes en cada una de las tres proteínas GlnA, se identificó que, de los 18 residuos aminoacídicos característicos de las GSI conservados universalmente, la secuencia de la proteína GlnA-1 presenta todos ellos, además del residuo de adenilación. Sin embargo, 8 de los residuos clave para la biosíntesis de glutamina se encuentran sustituidos por otros en las proteínas GlnA-2 y GlnA-3, careciendo además ambas proteínas del residuo de adenilación. El análisis del transcriptoma en función de la fuente de nitrógeno de la cepa mutante de deleción del gen glnA-1 (HM26-ΔglnA-1) reveló que los genes glnA-2 y glnA-3 no pueden sustituir la función del gen glnA-1. Además, estos últimos genes presentaron un perfil de expresión diferente al de glnA-1 en la cepa parental de Hfx. mediterranei HM26. En condiciones limitantes de nitrógeno, la deleción del gen glnA-1 afectó al nivel de expresión de genes involucrados en diferentes procesos metabólicos perteneciendo en su mayoría al metabolismo del nitrógeno, al metabolismo de las vesículas de gas y los relacionados con los sistemas CRISPR, sistemas de transporte y con reguladores transcripcionales. El estudio de expresión a nivel transcripcional en función de la fuente de nitrógeno de los genes glnA mediante RT-PCR reveló que los genes glnA-1 y glnA-2 se expresan en todas las condiciones analizadas (medio complejo, medio definido con amonio o nitrato 40 mM y en medio definido carente de nitrógeno) mientras que el gen glnA-3 no se expresa en estas condiciones. El estudio de expresión a nivel traduccional en función de la fuente de nitrógeno de las proteínas GlnA mediante Western blotting confirmó que la proteína GlnA1 se expresa en todas las condiciones analizadas (en medio complejo, y en los medios definidos con amonio, nitrato o glutamina 40 mM y en medio definido carente de fuente de nitrógeno) durante todas las etapas de crecimiento analizadas. Del mismo modo, este análisis de expresión reveló que la proteína GlnA-2 se expresa en todas las condiciones analizadas excepto al emplear medio complejo, pudiendo estar implicado algún mecanismo de regulación postranscripcional en la expresión de la proteína GlnA-2 en esta condición. Asimismo, la proteína GlnA-3 no mostró expresión en ninguna de estas condiciones analizadas ni en presencia de otras fuentes de nitrógeno (glutamato) o de carbono (citrato) ensayadas. La proteína recombinante GlnA-1, obtenida mediante expresión heteróloga, mostró una mayor actividad GS que las proteínas GlnA-2 y GlnA-3. Sin embargo, las proteínas recombinantes GlnA-2 y GlnA-3 mostraron valores elevados de actividad y-glutamil putrescina sintetasa mientras que GlnA-1 solo tiene cierta actividad residual cuando se emplea putrescina como sustrato. Los niveles de actividad y-glutamil putrescina sintetasa de las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 son unas 10 veces superiores a los valores de actividad GS. En los extractos de Hfx. mediterranei R4 crecidos en presencia de nitrato 40 mM como fuente de nitrógeno, en los cuales se expresan tanto la proteína GlnA-1 como GlnA-2, se observó una actividad GS mayor a la detectada en los extractos obtenidos a partir medio complejo. Por otra parte, Hfx. mediterranei R4 fue capaz de crecer con putrescina como única fuente de nitrógeno a diferentes concentraciones (20 - 250 mM), aunque las densidades ópticas alcanzadas fueron menores que las observadas al emplear otras fuentes de nitrógeno. En extractos proteicos obtenidos a partir de cultivos de Hfx. mediterranei empleando nitrato 40 mM o putrescina a diferentes concentraciones la actividad y-glutamil putrescina sintetasa fue mucho mayor a la detectada al emplear medio complejo como fuente de nitrógeno, condición donde la expresión de la proteína GlnA-2 no fue detectada. Para completar el análisis de las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 se generaron mutantes de deleción de los genes glnA-2 y glnA-3 a partir de la cepa parental de Hfx. mediterranei HM26 (ΔpyrE2) mediante la técnica pop-in/pop-out. Los mutantes obtenidos del gen glnA-2 resultaron ser mutantes homocigotos mientras que los mutantes del gen glnA-3 resultaron ser heterocigotos. La cepa mutante HM26-ΔglnA-2 se caracterizó fisiológicamente en diferentes medios de cultivos: medio complejo y medio definido con amonio, nitrato o glutamina como fuentes de nitrógeno. El análisis estadístico de los parámetros de crecimiento reveló que existían diferencias de crecimiento significativas entre la cepa parental HM26 y la cepa mutante HM26-ΔglnA-2 al emplear altas concentraciones de amonio y/o nitrato. El análisis de expresión a nivel traduccional de la cepa mutante HM26-ΔglnA-2 confirmó que la deleción del gen glnA-2 no afectó a la expresión de la proteína GlnA-1 ni a la ausencia de expresión de GlnA-3. Sin embargo, la deleción del gen glnA-2 afectó de forma significativa a la actividad y-glutamil putrescina sintetasa al emplear nitrato 40 mM como fuente de nitrógeno, confirmando la función del gen glnA-2 como una y-glutamil putrescina sintetasa más que una glutamina sintetasa.

La salinidad y el estrés hídrico son los factores más importantes que limitan la producción de trigo duro, sobre todo en regiones áridas y semiáridas, como la región Mediterránea. El trigo duro es uno de los principales cultivos en el sur y este de la Cuenca Mediterránea, donde se cultiva frecuentemente en condiciones de secano y si es posible con riego deficitario, a menudo con agua de poca calidad, que junto a una elevada evapotranspiración, puede provocar una progresiva salinización del terreno. En este sentido, la mejora genética de trigo duro para una mejor adaptación a estas condiciones de estrés es una de las pocas alternativas viables. El objetivo general de esta Tesis es estudiar las bases fisiológicas y moleculares de las diferencias genotípicas en crecimiento potencial y tolerancia a la salinidad y el estrés hídrico. En un primer estudio (Experimento 1) publicado en “Functional Plant Biology” se investigó qué criterio fenotípico de selección era el más adecuado para seleccionar genotipos de trigo duro que crecieran mejor en condiciones de salinidad continuada. De esta forma se determinó la importancia de los isótopos estables como criterios eficientes para seleccionar genotipos tolerantes y susceptibles a la salinidad. Posteriormente, se realizó un segundo estudio (Experimento 2) donde se evaluó el efecto de la salinidad en la composición isotópica del carbono (δ13C) y el nitrógeno (δ15N) de genotipos de trigo duro y de dos amfiploides (un tritordeo y un triticale). Este trabajo está publicado en la revista “Journal of Experimental Botany”. En este segundo ensayo, la salinidad se aplicó durante la floración y el llenado del grano durante unas pocas semanas. Los resultados de este trabajo representaron la puesta a punto del estudio del comportamiento fisiológico del trigo duro durante la fase reproductiva y bajo diferentes combinaciones de salinidad y riego. Como continuación de los dos Experimentos (1 y 2) y en vista de los resultados obtenidos en el uso de las firmas isotópicas como criterio de evaluación bajo condiciones salinas, se planteó evaluar el uso combinado de la composición isotópica del carbono (δ13C), oxígeno (δ18O) y el nitrógeno (δ15N) en materia seca para observar las respuestas genotípicas de plantas de trigo duro sometidas a diferentes combinaciones de salinidad. Como contribución original, se elaboró un modelo conceptual de las tres firmas isotópicas juntas (δ13C, δ18O, δ15N) junto con características del metabolismo nitrogenado para explicar las diferencias genotípicas en tolerancia a distintas condiciones de salinidad y estrés hídrico. También se evaluaron las características fotosintéticas en relación con las firmas isotópicas y las actividades de enzimas clave del metabolismo nitrogenado. (Trabajo Publicado en la revista “New Phytologist”). Además de los resultados anteriores obtenidos, en esta Tesis se comparó la eficiencia de las firmas isotópicas del carbono, oxígeno y nitrógeno mediante dos vías: muestras de materia seca y muestras de fracción soluble en genotipos de trigo duro para la evaluación de diferencias genotípicas en tolerancia a diferentes condiciones de salinidad y regimenes hídricos. Posteriormente se analizó la respuesta genética de plantas de trigo duro a la salinidad evaluando el nivel de transcripción de genes específicos asociados a tolerancia a salinidad y estrés hídrico, junto a otros que codifican para enzimas claves del metabolismo nitrogenado. También se han estudiado las relaciones entre estas tasas de transcripción, las diferencias genotípicas en crecimiento, firmas isotópicas y actividades de enzimas del metabolismo nitrogenado. El trabajo ha mostrado la eficacia de los isótopos estables de carbono y del nitrógeno como herramientas de evaluación de la respuesta del trigo duro frente a la salinidad. / Inadequate irrigation for long term and under conditions of high evapotranspiration demand, combined with the use of poor water quality and the lack of adequate drainage frequently induces the salinization of arable land causing a significant increase in the area affected by salinity. Salinity is an environmental factor that limits in a remarkable manner the production of crops in many parts of the world, but especially in arid and semiarid regions like the Mediterranean. Under these conditions, which is often grown durum wheat improvement for tolerance to salinity under irrigation deficit may be one of the strategies to alleviate this problem. This Thesis shows that isotope compositions of carbon (δ13C), oxygen (δ18O), and nitrogen (δ15N) and the concentration of nitrogen in dry matter are potentially and effective criteria for discriminating between different growing conditions and between genotypes tolerant or susceptible to salt. Furthermore, the results of this study reflect the importance of nitrogen metabolism in tolerance to salinity. Additionally, this thesis develops a model relating genotypic tolerance to different conditions of salinity and drought with the signatures of the three isotopes (C, O, N), together with photosynthetic and transpiration exchanges and parameters key of nitrogen metabolism such as nitrogen concentration and activities of the glutamine synthetase and nitrate reductase. Finally, we study the relationship between the expression of genes potentially key in the tolerance to salinity and drought and genotypic variability in response to different combinations of these stresses.