A inversão do sexo em peixes hermafroditas sequenciais (protândricos ou protogínicos) ocorre em decorrência de diversos fatores, dentre eles, fisiológicos, genéticos, podendo ser ainda decorrência do comportamento social. Nos peixes hermafroditas marinhos as alterações sexuais são acompanhadas por alterações anátomo-funcionais das gônadas, coloração e comportamento dos animais. A espécie Epinephelus marginatus (garoupa verdadeira), serranídeo da fauna nativa e amplamente difundida no litoral brasileiro, é um hermafrodita protogínico que apresenta dificuldade na manutenção de indivíduos do sexo masculino em seus cardumes e, além disso, encontra-se na lista de espécies sobreexplotadas. Utilizando-se técnicas de inversão sexual induzida, em cativeiro, para a obtenção de machos, este trabalho teve como objetivo estudar as alterações de alguns tecidos endócrinos durante o processo de inversão sexual, utilizando tratamentos com inibidores de aromatase (AI) e metiltestosterona (MT) em animais jovens. Ao longo de 90 dias de experimento a utilização do AI e do MT promoveu uma aparente desorganização da arquitetura gonadal padrão, massiva degeneração das células germinativas femininas, surgimento de centros melanomacrofágicos, proliferação de estruturas associadas ao sexo masculino (tecido intersticial e células germinativas masculinas) e a maturação das células germinativas masculinas. A utilização do andrógeno sintético MT (sozinho ou combinado com AI) possibilitou a obtenção de gônadas em fases mais avançadas de espermatogênese, inclusive a fase de espermiogênese inicial, com redução significativa dos valores do índice gonadossomático (IGS). Já com a utilização do AI foram encontradas gônadas em processos de intersexo mais clássicos após 90 dias experimentais. As análises de imunomarcação das células gonadotrópicas hipofisárias foram viáveis utilizando-se anticorpos de salmão e os resultados mostraram que as células produtoras de FSH (hormônio folículo-estimulante) e LH (hormônio luteinizante) distribuem-se pela proximal pars distalis e pars intermedia da adenohipófise. Os resultados obtidos com as análises imunohistoquímicas da hipófise demonstraram uma marcação de pouca intensidade utilizando-se o anticorpo anti-βFSH no grupo tratado com AI após 90 dias. A análise dos esteróides gonadais mostrou que nos animais tratados com AI, não houve diminuição na concentração do estradiol aos 90 dias, desta forma a alça de feedback negativo provavelmente foi acionada, e a produção de FSH diminuiu, causando o aumento da concentração plasmática de 11 cetotestosterona (11 KT) (via ação do LH). Já nos grupos onde o MT foi administrado, houve uma diminuição na concentração de estradiol após o tratamento, causando possivelmente uma menor intensidade na alça de feedback negativo na hipófise, sendo a ação do andrógeno sintético mais efetiva na espermiogênese nestes animais. As análises das gônadas e da hipófise sugerem a atuação do FSH no início da transição do sexo, sendo proposta a liberação desta glicoproteína como o gatilho para a inversão sexual em hermafroditas protogínicos. Estudos mais detalhados ao longo dos 90 dias de transição gonadal em E. marginatus precisam ser realizados para constatar o real envolvimento do FSH na inversão do sexo e verificar se a liberação do LH estaria envolvida com a produção de 11-ceto-testosterona, a espermiogênese completa e espermiação / The sex inversion in sequential hermaphrodite fish (protandrous or protogynous) occurs due to several factors, including physiological, genetics, and also can be associated with the social behavior. In marine hermaphrodite fish, the sex alterations are followed by anatomic and functional alterations in the gonads, color patterns and animal behavior. The species Epinephelus marginatus (dusky grouper), a native serranid and broadly distributed in the Brazilian coast, is a protogynous with problems in maintaining males in the shoal and, additionally, this species is part of the overexploited marine fish red list. Induction of sex change, in captivity, using aromatase inhibitors (AI) and 17α-methyltestosterone (MT) has been conducted with the purpose to study the morphophysiological alteration in some endocrine tissues in juveniles. During 90 experimental days, the use of AI and MT promoted an apparent disorganization of the standard gonad architecture, a massive degeneration of the female germ cells, the appearance of melanomacrophagic centers, a proliferation of the structures associated with the male sex (interstitial tissue and male germ cells) and the maturation of male germ cells. The use of the synthetic androgen, MT (alone or combined with AI) allowed the obtaining of gonads in a more advanced spermatogenesis phase, including an initial spermiogenesis phase, with a significant reduction of gonadossomatic index (GSI). With the use of AI, the gonads were found in a more classic intersex process after 90 days of experiment. The immunostaining analysis of the gonadotropic cells were viable using salmon antibodies and the results showed that FSH and LH cells were distributed in proximal pars distalis and pars intermedia in adenohypophysis. The immunohistochemistry analysis of the pituitary showed a low intensity of staining with the anti-βFSH in the AI group, after 90 experimental days. The analysis of the gonad steroids showed that in the animals from the AI group, there was no decrease in estradiol levels after 90 days, so the negative feedback loop probably was activated, the FSH secretion decreased, allowing the increase of plasma 11- ketotestosterone (11KT) (through LH action). In the MT groups there was a decrease in plasma estradiol, what probably decreased the intensity of the negative feedback loop in the pituitary, and in this case, the action of the synthetic androgen was predominant in spermiogenesis. The analysis of the gonads and pituitary suggest the action of FSH in the beginning of the sex transition, with the proposal that this glycoprotein acts triggering the sex inversion in protogynous hermaphrodites. We suggest that more detailed studies during the 90 days of gonad transition in E. marginatus must be done in order to find the real involvement of FSH in sex inversion and to elucidate the actual role of LH with 11KT production, the full spermiogenesis and spermiation

A puberdade é um processo biológico complexo do desenvolvimento sexual que tem início no final da infância e se caracteriza pela maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, aceleração do crescimento e finalmente pela capacidade reprodutiva. Nos últimos anos, o peptídeo kisspeptina e seu receptor KISS1R têm sido fortemente envolvidos na regulação da secreção pulsátil do GnRH hipotalâmico e, portanto, com o início da puberdade humana. Mutações nos genes KISS1R e KISS1 foram identificadas em crianças brasileiras com puberdade precoce central (PPC). Estudos em famílias e em irmãs gêmeas estimaram que 50-70% da variação na idade de menarca pode ser hereditária, porém, até pouco tempo atrás, não se tinha conhecimento de variantes genéticas comuns que influenciassem no tempo de puberdade. Recentemente, quatro estudos independentes de associação ampla do genoma estabeleceram que marcadores genéticos próximos ou dentro do gene LIN28B estavam relacionados com a idade da menarca em mulheres normais. Além disso, mutações recessivas no gene lin28 levaram ao desenvolvimento precoce no C. elegans. Camundongos que superexpressam Lin28a apresentaram um retardo no desenvolvimento sexual. Com base nesses achados, investigamos a presença de variantes conhecidas ou novas nos genes KISS1, KISS1R e LIN28B em um grupo de crianças portadoras de PPC idiopática com o intuito de estabelecermos a prevalência dessas mutações na etiologia do desenvolvimento sexual prematuro em humanos. Cento e sete crianças com PPC (101 meninas e 6 meninos) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares. A população controle consistiu de 200 indivíduos adultos com história de desenvolvimento puberal normal em idade apropriada. A região promotora e os três exons do gene KISS1, os cinco exons do gene K1SS1R e os quatro exons do gene LIN28B foram amplificados e submetidos à sequenciamento automático. Uma variante em homozigose no gene KISS1, descrita anteriormente por pesquisadores do nosso laboratório, p.H90D, foi identificada em mais três crianças não relacionadas, portadoras de PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 3 do KISS1, levando a substituição de uma histidina por um ácido aspártico na posição 90 da kisspeptina-1 (p.H90D), correspondendo à região amino-terminal da kisspeptina-54 e estava ausente em 200 controles brasileiros. Estudos prévios in vitro com a variante p.H90D não revelaram alterações na capacidade de ligação ou ativação do KISS1R e na resistência a degradação. As mutações ativadoras p.R386P do KISS1R e p.P74S da kisspeptina, previamente descritas em puberdade precoce central, não foram identificadas no estudo atual. Uma nova e rara variante em heterozigose no gene LIN28B, p.H199R, foi identificada em uma menina brasileira com PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 4 do LIN28B, levando a substituição de uma histidina conservada por uma arginina na posição 199 da proteína (p.H199R) e estava ausente em 200 controles brasileiros. O pai da paciente, que apresentou desenvolvimento puberal normal, era portador da mesma variante em heterozigose. Estudos in vitro revelaram que a variante p.H199R não afeta a função de LIN28B na regulação da expressão do miRNA let-7. Outra variante alélica no gene LIN28B foi identificada numa menina com PPC. Essa variante estava localizada no íntron 2 do gene e uma análise computacional demonstrou que ela não altera o sítio de splicing no RNA maduro. Em conclusão, observamos que mutações nos genes KISS1 e KISS1R têm uma baixa prevalência em crianças com puberdade precoce central idiopática. Descrevemos uma nova e rara variante no gene LIN28B (p.H199R) numa menina com puberdade precoce central e os estudos funcionais do LIN28B selvagem ou contendo a variante p.H199R sugeriram que essa variante não está relacionada ao fenótipo de puberdade precoce / Puberty is a complex biological process of sexual development that begins in the late childhood and it is characterized by the maturation of the hipothalamic-pituitary-gonadal axis, secondary sexual characteristics development, growth acceleration and acquisition of the reproductive capacity. Over the last years, the kisspeptin peptide and its receptor KISS1R have been envolved in the regulation of the pulsatile hipothalamic GnRH secretion and consequently with the beginning of the puberty human. Researchers from our laboratory identified mutations in the KISS1R and KISS1 genes in Brazilian children with central precocious puberty (CPP). Studies performed in families and twins estimated that 50%-70% of the variation in the menarce age can be hereditary, however, until last years, we did not have knowledgment of the influence of commun genetic variants in the puberty time. Recently, four independent Genome-Wide Association Studies established that genetic markers near or inside of LIN28B gene were related with the menarce age in normal women. Furthermore, recessive mutations in the LIN28B gene caused a precocious develpment in C. elegans. Interestingly, mouse that overexpress Lin28a exhibited a sexual development delay. Accordingly with these datas investigated the presence of known or new variants in the KISS1, KISS1R and LIN28B genes in a larger cohort of children with CPP to establish the prevalence of these mutations in the etiology of premature sexual development in humans. 107 children with CPP (101 girls and 6 boys) were selected, including sporadic and familial cases. The control population consisted of 200 adults with normal pubertal development. The promoter region and the three exons of KISS1 gene, five exons of KISS1R and four exons of LIN28B were amplified and automatically sequenced. A homozygous variant previously described by researchers from our laboratory in the KISS1 gene, p.H90D, was identified in more 3 no related children with CPP idiophatic. This variant is located in exon 3 of KISS1, resulting in substitution of a histidine to an aspartic acid at position 90 of kisspeptin-1 (p.H90D), in the amino-terminal region of the protein-54 and was absent in 200 Brazilian controls. Previous studies in vitro with the p.H90D variant did not show alterations in the binding or activation capacity and in the resistance to degradation. The activating mutations p.R386P of the KISS1R and p.P74S of the kisspeptin, previously described in central precocious puberty, were not identified in the present study. A new and rare heterozygous variant in the LIN28B gene, p.H199R, was identified in a Brazilian girl with CPP idiophatic. This variant is located in exon 4 of the LIN28B, resulting in substitution of a histidine to an arginine at position 199 of protein (p.H199R) and was absent in 200 Brazilian controls. Her father, which had normal pubertal development, carried the same heterozygous variant. Studies in vitro revealed p.H199R did not affect the function of Lin28B in the regulation of let-7 miRNA expression. Another allelic variant in the LIN28B gene was identified in a girl with CPP. This variant was located in intron 2 of the gene and an in silico analysis showed that it does not change the splicing site in mature RNA. In conclusion, we observed that mutations in the KISS1 and KISS1R genes have a low prevalence in children with idiopathic central precocious puberty. We described a new and rare variant in LIN28B gene (p.H199R) in a girl with central precocious puberty and functional studies of the wild LIN28B or containing p.H199R variant suggested that p.H199R variant of the LIN28B is not related to the precocious puberty phenotype

Um método de cromatografia líquida de alta eficiência por fase reversa (RP-HPLC) para análise qualitativa e quantitativa do hormônio folículo estimulante humano íntegro (hFSH), foi estabelecido e validado quanto à exatidão, precisão e sensibilidade. O FSH humano é um hormônio glicoprotéico dimérico largamente utilizado em medicina reprodutiva tanto para diagnóstico quanto para terapia. A metodologia desenvolvida preserva a integridade da proteína, permitindo a análise da forma heterodimérica intacta, e não somente de suas subunidades, como é normalmente obtida na maioria das condições geralmente empregadas. Esta técnica foi também utilizada para a comparação da hidrofobicidade relativa de preparações de hFSH hipofisária, urinária e derivadas de células de ovário de hamster chinês (CHO) bem como de outros dois hormônios glicoprotéicos, sintetizados na hipófise anterior: hormônio humano estimulante da tireóide (hTSH) e hormônio luteinizante humano (hLH). O menos hidrofóbico dos três hormônios analisados foi o hFSH, seguido do hTSH e do hLH. Uma diferença significativa (p<0,005) foi observada entre o tempo de retenção (tR) das preparações hipofisária e recombinante de hFSH, refletindo diferenças estruturais nas suas cadeias de carboidratos. Duas isoformas principais foram detectadas no hFSH urinário, incluindo uma forma que foi significativamente diferente (p<0,005) das preparações hipofisária e recombinante. Foram demonstradas linearidade da curva dose-resposta (r=0,9965, n=15) para esta metodologia de RP-HPLC, bem como uma precisão inter-ensaio, cujo coeficiente de variação é menor que 4%, para a quantificação de diferentes preparações de hFSH e uma sensibilidade da ordem de 40 ng. Foram também analisados o comportamento cromatográfico e a hidrofobicidade relativa das subunidades individuais das preparações recombinantes e hipofisária de hFSH. Além disso, a exata massa molecular das subunidades individuais de hFSH e do heterodímero foram simultaneamente determinadas por espectrometria de massa MALDI-TOF. A presente metodologia representa, em nossa opinião, uma ferramenta essencial para a caracterização e controle de qualidade deste hormônio, que ainda não consta das principais farmacopéias. / A reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for the qualitative and quantitative analysis of intact human follicle-stimulating hormone (hFSH) was established and validated for accuracy, precision and sensitivity. Human FSH is a dimeric glycoprotein hormone widely used as a diagnostic analyte and as therapeutic product in reproductive medicine. The technique developed preserves the protein integrity, allowing the analysis of the intact heterodimeric form rather than just of its subunits, as it is the case for the majority of the conditions currently employed. This methodology has also been employed for comparing the relative hydrophobicity of pituitary, urinary and two Chinese hamster ovary (CHO)-derived hFSH preparations, as well as of two other related glycoprotein hormones of the anterior pituitary: human thyroid-stimulating hormone (hTSH) and human luteinizing hormone (hLH). The least hydrophobic of the three glycohormones analyzed was hFSH, followed by hTSH and hLH. A significant difference (p<0.005) was observed in tR between the pituitary and recombinant hFSH preparations, reflecting structural differences in their carbohydrate moieties. Two main isoforms were detected in urinary hFSH, including a form which was significantly different (p<0.005) for the pituitary and recombinant preparations. The linearity of the dose-response curve (r = 0.9965, n = 15) for this RP-HPLC methodology, as well as an inter-assay precision with relative standard deviation less than 4% for the quantification of different hFSH preparations and a sensitivity of the order of 40 ng, were demonstrated. The chromatographic behavior and relative hydrophobicity of the individual subunits of the pituitary and recombinant preparations were also analyzed. Furthermore, the accurate molecular mass of the individual hFSH subunits and of the heterodimer were simultaneously determined by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectral analysis (MALDI-TOF-MS). The present methodology represents, in our opinion, an essential tool for characterization and quality control of this hormone that is not yet described in the main pharmacopoeias.

Lin Sze-Wah. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2005. / Includes bibliographical references (leaves 111-127). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract (in English) --- p.i / Abstract (in Chinese) --- p.iii / Acknowledgements --- p.iv / Table of Contents --- p.v / Abbreviations --- p.x / Scientific Names --- p.xii / Chapter CHAPTER 1 --- GENERAL INTRODUCTION --- p.1 / Chapter 1.1 --- Gonadotropins --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- Structure --- p.1 / Chapter 1.1.2 --- Function --- p.1 / Chapter 1.1.3 --- Regulation --- p.2 / Chapter 1.1.3.1 --- Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) --- p.3 / Chapter 1.1.3.2 --- Dopamine --- p.4 / Chapter 1.1.3.3 --- Sex steroids --- p.5 / Chapter 1.1.3.3.1 --- Functions --- p.5 / Chapter 1.1.3.3.2 --- Working mechanism´ؤEstrogen signaling pathway --- p.7 / Chapter 1.1.3.4 --- Gonadal peptides --- p.9 / Chapter 1.1.3.4.1 --- Functions --- p.9 / Chapter 1.1.3.4.2 --- Working mechanism一Activin signaling pathway --- p.11 / Chapter 1.2 --- Transcriptional regulation of pituitary gonadotropin subunit genes at the promoter level --- p.13 / Chapter 1.2.1 --- Transcriptional regulation of mammalian glycoprotein a subunits --- p.13 / Chapter 1.2.1.1 --- GnRH --- p.14 / Chapter 1.2.1.2 --- Activin --- p.15 / Chapter 1.2.1.3 --- Steroids --- p.15 / Chapter 1.2.2 --- Transcriptional regulation of mammalian FSHβ and LHβ subunits --- p.16 / Chapter 1.2.2.1 --- Regulation of LHβ expression by GnRH --- p.17 / Chapter 1.2.2.1.1 --- Roles of SP-1 binding sites on LHβ promoter --- p.17 / Chapter 1.2.2.1.2 --- Effect of SF-1 on LHp expression --- p.17 / Chapter 1.2.2.1.3 --- Effect of Egr-1 on LHp expression --- p.18 / Chapter 1.2.2.1.4 --- "Synergistic effect ofSP-1, SF-1 and Egr-1 on LHp expression." --- p.18 / Chapter 1.2.2.1.5 --- Effect of Pitx-1 on LHβ expression --- p.19 / Chapter 1.2.2.1.6 --- "Effect of SF-1, Egr-1 and Pitx-1 on LHβ expression of other mammalian counterparts" --- p.19 / Chapter 1.2.2.1.7 --- Effect of other transcription factors on mammalian LHβ expression --- p.19 / Chapter 1.2.2.2 --- Regulation of LHβ expression by steroids and activin --- p.20 / Chapter 1.2.2.3 --- Regulation of FSHβ expression by activin and GnRH --- p.20 / Chapter 1.2.2.4 --- Regulation of FSHβ expression by steroids --- p.21 / Chapter 1.2.2.5 --- Regulation of FSHβ expression by other transcription factors --- p.22 / Chapter 1.2.3 --- Transcriptional regulation of fish FSHβ and LHβ subunits --- p.22 / Chapter 1.3 --- The project objectives and long-term significance --- p.24 / Chapter CHAPTER 2 --- CLONING OF ZEBRAFISH FSHB AND LHB PROMOTERS. --- p.26 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.26 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods --- p.27 / Chapter 2.2.1 --- Chemicals --- p.27 / Chapter 2.2.2 --- Animals --- p.27 / Chapter 2.2.3 --- Isolation of genomic DNA --- p.28 / Chapter 2.2.4 --- Cloning of promoters of zebrafish FSHβ and LHβ from the genomic DNA --- p.28 / Chapter 2.2.5 --- Construction of the reporter plasmids containing zebrafish FSHβ and LHβ promoters --- p.30 / Chapter 2.2.6 --- Cell culture and transient transfection --- p.31 / Chapter 2.2.7 --- SEAP reporter gene assay --- p.32 / Chapter 2.2.8 --- β-galactosidase reporter gene assay --- p.32 / Chapter 2.2.9 --- Data analysis --- p.33 / Chapter 2.3 --- Results --- p.33 / Chapter 2.3.1 --- Cloning of zebrafish FSHβ and LHβ promoters --- p.33 / Chapter 2.3.2 --- Sequence characterization of zebrafish FSHβ and LHβ promoters --- p.34 / Chapter 2.3.3 --- Basal FSHp and LHβ promoter activities in LβT2 cells --- p.35 / Chapter 2.4 --- Discussion --- p.36 / Chapter CHAPTER 3 --- ROLES OF ACTIVIN/SMADS AND ESTROGEN/ERS IN THE REGULATION OF ZEBRAFISH FSHB AND LHB PROMOTER ACTIVITY --- p.51 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.52 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods --- p.56 / Chapter 3.2.1 --- Chemicals --- p.56 / Chapter 3.2.2 --- Animals --- p.56 / Chapter 3.2.3 --- Isolation of total RNA --- p.57 / Chapter 3.2.4 --- Rapid amplification of full-length cDNA (RACE) --- p.57 / Chapter 3.2.5 --- Construction of expression plasmids --- p.57 / Chapter 3.2.6 --- cell culture and transient transfection --- p.59 / Chapter 3.2.7 --- SEAP reporter gene assay --- p.59 / Chapter 3.2.8 --- p-galactosidase reporter gene assay --- p.59 / Chapter 3.2.9 --- Data analysis --- p.59 / Chapter 3.3 --- Results --- p.60 / Chapter 3.3.1 --- Cloning and sequence characterization of zebrafish Smad 4 (zfSmad 4) --- p.60 / Chapter 3.3.2 --- Smads regulate FSHβ transcription in LβT2 cells --- p.61 / Chapter 3.3.3 --- Smads regulate LHβ transcription in LPβT2 cells --- p.61 / Chapter 3.3.4 --- Functionality of the two forms of Smad 4 cloned --- p.62 / Chapter 3.3.5 --- Estrogen and ERs regulate zJFSHβ transcription in LβT2 cells --- p.63 / Chapter 3.3.6 --- Estrogen and ERs regulate zfLHβ transcription in LβT2 cells --- p.63 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.64 / Chapter CHAPTER 4 --- PROMOTER ANALYSIS FOR SMAD RESPONSIVE ELEMENT AND ESTROGEN RESPONSIVE ELEMENT IN ZEBRAFISH FSHB AND LHB PROMOTERS --- p.82 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.83 / Chapter 4.2 --- Materials and Methods --- p.85 / Chapter 4.2.1 --- Chemicals and animals --- p.85 / Chapter 4.2.2 --- Construction of SEAP reporter plasmids containing different lengths of zfFSHβ promoter --- p.85 / Chapter 4.2.3 --- Construction of SEAP reporter plasmids containing different lengths of zfLHβ promoter --- p.85 / Chapter 4.2.4 --- Site-directed mutagenesis --- p.86 / Chapter 4.2.5 --- cell culture and transient transfection --- p.87 / Chapter 4.2.6 --- SEAP reporter gene assay --- p.87 / Chapter 4.2.7 --- P-galactosidase reporter gene assay --- p.87 / Chapter 4.2.8 --- Data analysis --- p.88 / Chapter 4.3 --- Results --- p.88 / Chapter 4.3.1 --- Localization of Smad-responsive element (SRE) on zfFSHβ promoter --- p.88 / Chapter 4.3.2 --- Localization of estrogen-responsive element (ERE) on zfLHβ promoter --- p.89 / Chapter 4.3.3 --- Localization of estrogen-responsive element (ERE) on zfFSHβ promoter --- p.90 / Chapter 4.3.4 --- Confirmation of SRE by site-directed mutagenesis --- p.91 / Chapter 4.3.5 --- Confirmation of ERE by site-directed mutagenesis --- p.92 / Chapter 4.4 --- Discussion --- p.92 / Chapter CHAPTER 5 --- GENERAL DISCUSSION --- p.106 / Chapter 5.1 --- Overview --- p.106 / Chapter 5.2 --- Contribution of the present research --- p.107 / Chapter 5.3 --- Future research direction --- p.108 / REFERENCE: --- p.111

Um método de cromatografia líquida de alta eficiência por fase reversa (RP-HPLC) para análise qualitativa e quantitativa do hormônio folículo estimulante humano íntegro (hFSH), foi estabelecido e validado quanto à exatidão, precisão e sensibilidade. O FSH humano é um hormônio glicoprotéico dimérico largamente utilizado em medicina reprodutiva tanto para diagnóstico quanto para terapia. A metodologia desenvolvida preserva a integridade da proteína, permitindo a análise da forma heterodimérica intacta, e não somente de suas subunidades, como é normalmente obtida na maioria das condições geralmente empregadas. Esta técnica foi também utilizada para a comparação da hidrofobicidade relativa de preparações de hFSH hipofisária, urinária e derivadas de células de ovário de hamster chinês (CHO) bem como de outros dois hormônios glicoprotéicos, sintetizados na hipófise anterior: hormônio humano estimulante da tireóide (hTSH) e hormônio luteinizante humano (hLH). O menos hidrofóbico dos três hormônios analisados foi o hFSH, seguido do hTSH e do hLH. Uma diferença significativa (p<0,005) foi observada entre o tempo de retenção (tR) das preparações hipofisária e recombinante de hFSH, refletindo diferenças estruturais nas suas cadeias de carboidratos. Duas isoformas principais foram detectadas no hFSH urinário, incluindo uma forma que foi significativamente diferente (p<0,005) das preparações hipofisária e recombinante. Foram demonstradas linearidade da curva dose-resposta (r=0,9965, n=15) para esta metodologia de RP-HPLC, bem como uma precisão inter-ensaio, cujo coeficiente de variação é menor que 4%, para a quantificação de diferentes preparações de hFSH e uma sensibilidade da ordem de 40 ng. Foram também analisados o comportamento cromatográfico e a hidrofobicidade relativa das subunidades individuais das preparações recombinantes e hipofisária de hFSH. Além disso, a exata massa molecular das subunidades individuais de hFSH e do heterodímero foram simultaneamente determinadas por espectrometria de massa MALDI-TOF. A presente metodologia representa, em nossa opinião, uma ferramenta essencial para a caracterização e controle de qualidade deste hormônio, que ainda não consta das principais farmacopéias. / A reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for the qualitative and quantitative analysis of intact human follicle-stimulating hormone (hFSH) was established and validated for accuracy, precision and sensitivity. Human FSH is a dimeric glycoprotein hormone widely used as a diagnostic analyte and as therapeutic product in reproductive medicine. The technique developed preserves the protein integrity, allowing the analysis of the intact heterodimeric form rather than just of its subunits, as it is the case for the majority of the conditions currently employed. This methodology has also been employed for comparing the relative hydrophobicity of pituitary, urinary and two Chinese hamster ovary (CHO)-derived hFSH preparations, as well as of two other related glycoprotein hormones of the anterior pituitary: human thyroid-stimulating hormone (hTSH) and human luteinizing hormone (hLH). The least hydrophobic of the three glycohormones analyzed was hFSH, followed by hTSH and hLH. A significant difference (p<0.005) was observed in tR between the pituitary and recombinant hFSH preparations, reflecting structural differences in their carbohydrate moieties. Two main isoforms were detected in urinary hFSH, including a form which was significantly different (p<0.005) for the pituitary and recombinant preparations. The linearity of the dose-response curve (r = 0.9965, n = 15) for this RP-HPLC methodology, as well as an inter-assay precision with relative standard deviation less than 4% for the quantification of different hFSH preparations and a sensitivity of the order of 40 ng, were demonstrated. The chromatographic behavior and relative hydrophobicity of the individual subunits of the pituitary and recombinant preparations were also analyzed. Furthermore, the accurate molecular mass of the individual hFSH subunits and of the heterodimer were simultaneously determined by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectral analysis (MALDI-TOF-MS). The present methodology represents, in our opinion, an essential tool for characterization and quality control of this hormone that is not yet described in the main pharmacopoeias.

A puberdade é um processo biológico complexo do desenvolvimento sexual que tem início no final da infância e se caracteriza pela maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, aceleração do crescimento e finalmente pela capacidade reprodutiva. Nos últimos anos, o peptídeo kisspeptina e seu receptor KISS1R têm sido fortemente envolvidos na regulação da secreção pulsátil do GnRH hipotalâmico e, portanto, com o início da puberdade humana. Mutações nos genes KISS1R e KISS1 foram identificadas em crianças brasileiras com puberdade precoce central (PPC). Estudos em famílias e em irmãs gêmeas estimaram que 50-70% da variação na idade de menarca pode ser hereditária, porém, até pouco tempo atrás, não se tinha conhecimento de variantes genéticas comuns que influenciassem no tempo de puberdade. Recentemente, quatro estudos independentes de associação ampla do genoma estabeleceram que marcadores genéticos próximos ou dentro do gene LIN28B estavam relacionados com a idade da menarca em mulheres normais. Além disso, mutações recessivas no gene lin28 levaram ao desenvolvimento precoce no C. elegans. Camundongos que superexpressam Lin28a apresentaram um retardo no desenvolvimento sexual. Com base nesses achados, investigamos a presença de variantes conhecidas ou novas nos genes KISS1, KISS1R e LIN28B em um grupo de crianças portadoras de PPC idiopática com o intuito de estabelecermos a prevalência dessas mutações na etiologia do desenvolvimento sexual prematuro em humanos. Cento e sete crianças com PPC (101 meninas e 6 meninos) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares. A população controle consistiu de 200 indivíduos adultos com história de desenvolvimento puberal normal em idade apropriada. A região promotora e os três exons do gene KISS1, os cinco exons do gene K1SS1R e os quatro exons do gene LIN28B foram amplificados e submetidos à sequenciamento automático. Uma variante em homozigose no gene KISS1, descrita anteriormente por pesquisadores do nosso laboratório, p.H90D, foi identificada em mais três crianças não relacionadas, portadoras de PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 3 do KISS1, levando a substituição de uma histidina por um ácido aspártico na posição 90 da kisspeptina-1 (p.H90D), correspondendo à região amino-terminal da kisspeptina-54 e estava ausente em 200 controles brasileiros. Estudos prévios in vitro com a variante p.H90D não revelaram alterações na capacidade de ligação ou ativação do KISS1R e na resistência a degradação. As mutações ativadoras p.R386P do KISS1R e p.P74S da kisspeptina, previamente descritas em puberdade precoce central, não foram identificadas no estudo atual. Uma nova e rara variante em heterozigose no gene LIN28B, p.H199R, foi identificada em uma menina brasileira com PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 4 do LIN28B, levando a substituição de uma histidina conservada por uma arginina na posição 199 da proteína (p.H199R) e estava ausente em 200 controles brasileiros. O pai da paciente, que apresentou desenvolvimento puberal normal, era portador da mesma variante em heterozigose. Estudos in vitro revelaram que a variante p.H199R não afeta a função de LIN28B na regulação da expressão do miRNA let-7. Outra variante alélica no gene LIN28B foi identificada numa menina com PPC. Essa variante estava localizada no íntron 2 do gene e uma análise computacional demonstrou que ela não altera o sítio de splicing no RNA maduro. Em conclusão, observamos que mutações nos genes KISS1 e KISS1R têm uma baixa prevalência em crianças com puberdade precoce central idiopática. Descrevemos uma nova e rara variante no gene LIN28B (p.H199R) numa menina com puberdade precoce central e os estudos funcionais do LIN28B selvagem ou contendo a variante p.H199R sugeriram que essa variante não está relacionada ao fenótipo de puberdade precoce / Puberty is a complex biological process of sexual development that begins in the late childhood and it is characterized by the maturation of the hipothalamic-pituitary-gonadal axis, secondary sexual characteristics development, growth acceleration and acquisition of the reproductive capacity. Over the last years, the kisspeptin peptide and its receptor KISS1R have been envolved in the regulation of the pulsatile hipothalamic GnRH secretion and consequently with the beginning of the puberty human. Researchers from our laboratory identified mutations in the KISS1R and KISS1 genes in Brazilian children with central precocious puberty (CPP). Studies performed in families and twins estimated that 50%-70% of the variation in the menarce age can be hereditary, however, until last years, we did not have knowledgment of the influence of commun genetic variants in the puberty time. Recently, four independent Genome-Wide Association Studies established that genetic markers near or inside of LIN28B gene were related with the menarce age in normal women. Furthermore, recessive mutations in the LIN28B gene caused a precocious develpment in C. elegans. Interestingly, mouse that overexpress Lin28a exhibited a sexual development delay. Accordingly with these datas investigated the presence of known or new variants in the KISS1, KISS1R and LIN28B genes in a larger cohort of children with CPP to establish the prevalence of these mutations in the etiology of premature sexual development in humans. 107 children with CPP (101 girls and 6 boys) were selected, including sporadic and familial cases. The control population consisted of 200 adults with normal pubertal development. The promoter region and the three exons of KISS1 gene, five exons of KISS1R and four exons of LIN28B were amplified and automatically sequenced. A homozygous variant previously described by researchers from our laboratory in the KISS1 gene, p.H90D, was identified in more 3 no related children with CPP idiophatic. This variant is located in exon 3 of KISS1, resulting in substitution of a histidine to an aspartic acid at position 90 of kisspeptin-1 (p.H90D), in the amino-terminal region of the protein-54 and was absent in 200 Brazilian controls. Previous studies in vitro with the p.H90D variant did not show alterations in the binding or activation capacity and in the resistance to degradation. The activating mutations p.R386P of the KISS1R and p.P74S of the kisspeptin, previously described in central precocious puberty, were not identified in the present study. A new and rare heterozygous variant in the LIN28B gene, p.H199R, was identified in a Brazilian girl with CPP idiophatic. This variant is located in exon 4 of the LIN28B, resulting in substitution of a histidine to an arginine at position 199 of protein (p.H199R) and was absent in 200 Brazilian controls. Her father, which had normal pubertal development, carried the same heterozygous variant. Studies in vitro revealed p.H199R did not affect the function of Lin28B in the regulation of let-7 miRNA expression. Another allelic variant in the LIN28B gene was identified in a girl with CPP. This variant was located in intron 2 of the gene and an in silico analysis showed that it does not change the splicing site in mature RNA. In conclusion, we observed that mutations in the KISS1 and KISS1R genes have a low prevalence in children with idiopathic central precocious puberty. We described a new and rare variant in LIN28B gene (p.H199R) in a girl with central precocious puberty and functional studies of the wild LIN28B or containing p.H199R variant suggested that p.H199R variant of the LIN28B is not related to the precocious puberty phenotype

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06041.pdf: 4212913 bytes, checksum: fd1c8026a141fe44d8a936d7cfcd904d (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

A kisspeptina, codificada pelo gene KISS1, é um neuropeptídeo crucial na regulação do início da puberdade. A kisspeptina estimula a secreção hipotalâmica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) após se ligar ao seu receptor GPR54. Mutações inativadoras do GPR54 são atualmente consideradas como uma causa rara de hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) normósmico. Recentemente, uma mutação ativadora no receptor GPR54 foi implicada na patogênese da puberdade precoce dependente de gonadotrofinas (PPDG). Com base nesses achados, levantamos a hipótese de que alterações no gene KISS1 poderiam contribuir para a patogênese de distúrbios puberais centrais. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de variantes no gene KISS1 em pacientes com PPDG e HHI. Sessenta e sete crianças brasileiras com PPDG (63 meninas e 4 meninos) e 61 pacientes com HHI (40 homens e 21 mulheres) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares em ambos os grupos. A população controle consistiu de 200 indivíduos com história de desenvolvimento puberal normal. A região promotora e os 3 exons do gene KISS1 foram amplificados e submetidos a sequenciamento automático. Duas novas variantes no gene KISS1, p.P74S e p.H90D, foram identificadas em duas crianças não relacionadas, portadoras de PPDG idiopática. Ambas as variantes estão localizadas na região amino-terminal da kisspeptina-54 e estavam ausentes em 400 alelos controles. A variante p.P74S foi identificada em heterozigose em um menino que desenvolveu puberdade com um ano de idade. Sua mãe e avó materna, que apresentavam história de desenvolvimento puberal normal, eram portadoras da mesma variante em heterozigose, sugerindo penetrância incompleta e/ou herança sexo-dependente. A variante p.H90D foi identificada em homozigose em uma menina com PPDG, que desenvolveu puberdade aos seis anos de idade. Sua mãe, com história de menarca aos dez anos de idade, era portadora da mesma variante em heterozigose. Células transfectadas estavelmente com GPR54 foram estimuladas com concentrações crescentes de kisspeptina-54 (kp-54) humana selvagem ou contendo as mutações (kp-54 H90D e kp-54 P74S) e o acúmulo de fosfato de inositol (IP) foi medido. Nos estudos in vitro, a kp-54 P74S apresentou uma capacidade de ativação do receptor GPR54 semelhante à kp-54 selvagem. A kp-54 p.H90D mostrou uma ativação da sinalização do receptor significativamente mais potente que a kp-54 selvagem, sugerindo que essa é uma mutação ativadora. No grupo de HHI, uma nova variante (c.588-589insT) foi identificada em heterozigose na região 3 não traduzida do gene KISS1 em um paciente do sexo masculino. O papel dessa variante no fenótipo de HHI permanece indeterminado. Em conclusão, duas mutações no gene KiSS1 foram descritas pela primeira vez em associação com PPDG. / Kisspeptin, encoded by the KISS1 gene, is an important regulator of puberty onset. After binding to its receptor GPR54, kisspeptin stimulates gonadotropin-releasing hormone secretion by the hypothalamic neurons. Inactivating GPR54 mutations are a rare cause of normosmic isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH). Recently, a unique GPR54 activating mutation was implicated in the pathogenesis of gonadotropin dependent precocious puberty (GDPP). Based on these observations, we hypothesized that mutations in the KISS1 gene might be associated with central pubertal disorders. The aim of this study was to investigate KISS1 mutations in idiopathic GDPP and normosmic IHH. Sixty-seven Brazilian children (63 girls and 4 boys) with idiopathic GDPP and 61 patients with normosmic IHH (40 men and 21 women) were selected. Familial and sporadic cases were included in both groups. The control population consisted of 200 individuals who had normal timing of puberty. The promoter region and the 3 exons of the KISS1 gene were amplified and automatically sequenced. Two novel KISS1 missense mutations, p.P74S and p.H90D, were identified in two unrelated children with idiopathic GDPP. Both mutations were absent in 400 control alleles and are located in the amino-terminal region of kisspeptin-54. The p.P74S mutation was identified in the heterozygous state in a boy who developed puberty at 1 yr of age. His mother and maternal grandmother, who had normal pubertal development, were also heterozygous for the p.P74S mutation, suggesting incomplete penetrance and/or sex-dependent inheritance. The p.H90D mutation was identified in the homozygous state in a girl with GDPP, who developed puberty at 6 yr of age. Her mother, who had menarche at 10 yr of age, carried the p.H90D mutation in the heterozygous state. CHO cells stably transfected with GPR54 were stimulated with different concentrations of synthetic human wild type or mutant kisspeptin-54 (KP54) and inositol phosphate (IP) accumulation was measured. In vitro studies revealed that the capacity of the p.P74S mutant KP54 to stimulate IP production was similar to the wild type. The p.H90D kisspeptin-54 showed a significantly more potent activation of GPR54 signaling in comparison to the wild type in vitro, suggesting a gain-of-function mutation. In the IHH group, a heterozygous variant in the 3 UTR of the KISS1 gene (c.588-589insT) was identified. The role of this variant in the IHH phenotype remains to be determined. In conclusion, two KiSS1 mutations were described for the first time in association with GDPP.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06041.pdf: 4212913 bytes, checksum: fd1c8026a141fe44d8a936d7cfcd904d (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

A inversão do sexo em peixes hermafroditas sequenciais (protândricos ou protogínicos) ocorre em decorrência de diversos fatores, dentre eles, fisiológicos, genéticos, podendo ser ainda decorrência do comportamento social. Nos peixes hermafroditas marinhos as alterações sexuais são acompanhadas por alterações anátomo-funcionais das gônadas, coloração e comportamento dos animais. A espécie Epinephelus marginatus (garoupa verdadeira), serranídeo da fauna nativa e amplamente difundida no litoral brasileiro, é um hermafrodita protogínico que apresenta dificuldade na manutenção de indivíduos do sexo masculino em seus cardumes e, além disso, encontra-se na lista de espécies sobreexplotadas. Utilizando-se técnicas de inversão sexual induzida, em cativeiro, para a obtenção de machos, este trabalho teve como objetivo estudar as alterações de alguns tecidos endócrinos durante o processo de inversão sexual, utilizando tratamentos com inibidores de aromatase (AI) e metiltestosterona (MT) em animais jovens. Ao longo de 90 dias de experimento a utilização do AI e do MT promoveu uma aparente desorganização da arquitetura gonadal padrão, massiva degeneração das células germinativas femininas, surgimento de centros melanomacrofágicos, proliferação de estruturas associadas ao sexo masculino (tecido intersticial e células germinativas masculinas) e a maturação das células germinativas masculinas. A utilização do andrógeno sintético MT (sozinho ou combinado com AI) possibilitou a obtenção de gônadas em fases mais avançadas de espermatogênese, inclusive a fase de espermiogênese inicial, com redução significativa dos valores do índice gonadossomático (IGS). Já com a utilização do AI foram encontradas gônadas em processos de intersexo mais clássicos após 90 dias experimentais. As análises de imunomarcação das células gonadotrópicas hipofisárias foram viáveis utilizando-se anticorpos de salmão e os resultados mostraram que as células produtoras de FSH (hormônio folículo-estimulante) e LH (hormônio luteinizante) distribuem-se pela proximal pars distalis e pars intermedia da adenohipófise. Os resultados obtidos com as análises imunohistoquímicas da hipófise demonstraram uma marcação de pouca intensidade utilizando-se o anticorpo anti-&#946;FSH no grupo tratado com AI após 90 dias. A análise dos esteróides gonadais mostrou que nos animais tratados com AI, não houve diminuição na concentração do estradiol aos 90 dias, desta forma a alça de feedback negativo provavelmente foi acionada, e a produção de FSH diminuiu, causando o aumento da concentração plasmática de 11 cetotestosterona (11 KT) (via ação do LH). Já nos grupos onde o MT foi administrado, houve uma diminuição na concentração de estradiol após o tratamento, causando possivelmente uma menor intensidade na alça de feedback negativo na hipófise, sendo a ação do andrógeno sintético mais efetiva na espermiogênese nestes animais. As análises das gônadas e da hipófise sugerem a atuação do FSH no início da transição do sexo, sendo proposta a liberação desta glicoproteína como o gatilho para a inversão sexual em hermafroditas protogínicos. Estudos mais detalhados ao longo dos 90 dias de transição gonadal em E. marginatus precisam ser realizados para constatar o real envolvimento do FSH na inversão do sexo e verificar se a liberação do LH estaria envolvida com a produção de 11-ceto-testosterona, a espermiogênese completa e espermiação / The sex inversion in sequential hermaphrodite fish (protandrous or protogynous) occurs due to several factors, including physiological, genetics, and also can be associated with the social behavior. In marine hermaphrodite fish, the sex alterations are followed by anatomic and functional alterations in the gonads, color patterns and animal behavior. The species Epinephelus marginatus (dusky grouper), a native serranid and broadly distributed in the Brazilian coast, is a protogynous with problems in maintaining males in the shoal and, additionally, this species is part of the overexploited marine fish red list. Induction of sex change, in captivity, using aromatase inhibitors (AI) and 17&#945;-methyltestosterone (MT) has been conducted with the purpose to study the morphophysiological alteration in some endocrine tissues in juveniles. During 90 experimental days, the use of AI and MT promoted an apparent disorganization of the standard gonad architecture, a massive degeneration of the female germ cells, the appearance of melanomacrophagic centers, a proliferation of the structures associated with the male sex (interstitial tissue and male germ cells) and the maturation of male germ cells. The use of the synthetic androgen, MT (alone or combined with AI) allowed the obtaining of gonads in a more advanced spermatogenesis phase, including an initial spermiogenesis phase, with a significant reduction of gonadossomatic index (GSI). With the use of AI, the gonads were found in a more classic intersex process after 90 days of experiment. The immunostaining analysis of the gonadotropic cells were viable using salmon antibodies and the results showed that FSH and LH cells were distributed in proximal pars distalis and pars intermedia in adenohypophysis. The immunohistochemistry analysis of the pituitary showed a low intensity of staining with the anti-&#946;FSH in the AI group, after 90 experimental days. The analysis of the gonad steroids showed that in the animals from the AI group, there was no decrease in estradiol levels after 90 days, so the negative feedback loop probably was activated, the FSH secretion decreased, allowing the increase of plasma 11- ketotestosterone (11KT) (through LH action). In the MT groups there was a decrease in plasma estradiol, what probably decreased the intensity of the negative feedback loop in the pituitary, and in this case, the action of the synthetic androgen was predominant in spermiogenesis. The analysis of the gonads and pituitary suggest the action of FSH in the beginning of the sex transition, with the proposal that this glycoprotein acts triggering the sex inversion in protogynous hermaphrodites. We suggest that more detailed studies during the 90 days of gonad transition in E. marginatus must be done in order to find the real involvement of FSH in sex inversion and to elucidate the actual role of LH with 11KT production, the full spermiogenesis and spermiation