O desenvolvimento industrial e urbano tem causado aumento mundial das emissões de poluentes atmosféricos. Nas áreas metropolitanas o problema da deterioração da qualidade do ar tem se constituído numa das mais graves ameaças à qualidade de vida dos seus habitantes e os veículos automotores contribuem diretamente com o aumento do material particulado (MP). Neste trabalho foram descritas as etapas metodológicas para validar a Tibouchina granulosa como biomonitor ambiental. Assim, foram abordados a caracterização das folhas, categorização do MP, protocolo de remoção de MP e determinação dos EGPs (Pd, Pt e Rh) na deposição seca das folhas. Para tanto foram realizadas quatro coletas anuais (2011-2014) de folhas, entre os meses de agosto e setembro, em pontos específicos. Os resultados da caracterização mostraram que as folhas permanecem residentes nos ramos por até 6 meses e ocorre o desenvolvimento duas novas folhas por nó a cada mês, indicando que o biomonitoramento pode ser realizado com distribuição temporal e espacial. Os caracteres anatômicos foliares mais relevantes são os tricomas, sendo caracterizados quatro tipos (glandular, adpresso-escabro, base ramificada e estrigoso) que adsorvem o MP. No protocolo de remoção da deposição seca, o número de MP variou de acordo com os diferentes reagentes analíticos utilizados, sendo os mais significativos o ALCONOX&reg e a água régia, que apresentaram valores de remoção na faixa de 99-98% e de 94-99%. As estimativas das incertezas analíticas dos EGPs apresentam valores de uCPt=5% (Pt), uCPd=12% (Pd) e uCRh=5% (Rh) e as incertezas de amostragem, os valores de 57% para o Pd, 24% para a Pt e 27% para o Rh. Portanto, a incerteza expandida foi da Pt U=48%, Pd U=86% e Rh U=9%, a incerteza do Rh apresentou valor mais baixo por ser o elemento minoritário. A elevada sensibilidade do método para determinação dos EGPs apresentou limite de detecção de 0,1 pg g-1 para o Pd, 1,3 pg g-1 para Pt e 0,3 pg g-1 para o Rh e acompanhada boa reprodutibilidade. As concentrações dos EGPs encontradas na deposição seca nos vários pontos de coletas indicaram a clara diferença de acúmulo destes elementos entre o ponto de referência e os locais impactados, sugerindo que a liberação dos EGPS pelos catalisadores veiculares pode ser considerada alta. A evidência da presença dos EGPs na deposição seca foi confirmada por meio da análise da distribuição, que mostrou claramente a similaridade com o material de referência certificado Used Auto Catalystc-2557. As distribuições espaciais dos EGPs foram semelhantes para a Coleta 2, indicando os hot points da RMSP. As concentrações do EGPs foram ordenadas em Pt>Pd>Rh e foram mais baixas no ponto de coleta para controle das amostragens em comparação com os outros locais amostrados. Pode ser concluído que as folhas de T. granulosa foram validadas como biomonitor passivo dos EGPs constituintes de catalisadores veiculares. / Industrial and urban development has caused worldwide increase in emissions air pollutants. In metropolitan areas, the problem of deterioration air quality has been one the most serious threats to quality life its inhabitants, motor vehicles contribute directly increase pollutants. This work describes the methodological steps to validate Tibouchina granulosa as environmental biomonitor, which involved the characterization the leaves, PM categorization, PM removal protocol and determination PGEs in dry deposition, for which four annual collections (2011-2014) were performed between August and September of each year. The of results leaf characters showed that leaves in the branches remain for up to 6 months and the development two new leaf occurs every month. The most relevant foliar characters anatomical are trichomes, being characterized five types. The highest particle concentrations adsorbed to stray trichomes and star-based trichomes. In dry deposition removal protocol, MP number varied according to different analytical reagents used, the most significant being ALCONOX&reg and aqua regia, which presented range removal values of 99-98% and 94-99%, respectively. The estimates analytical uncertainties PGEs show de uCPt=5% (Pt), uCPd=12% (Pd) e uCRh=5% (Rh) and sampling uncertainties values were 57% (Pd), 24% (Pt) and 27% (Rh). Therefore, the expanded uncertainty was Pt u=48%, Pd u=86% e Rh u=9%, in case Rh the uncertainties should be reevaluated by presenting minority values. The high sensitivity of the method for determination of PGEs showed a detection limit of 0.1 pg g-1 for Pd, 1.3 pg g-1 for Pt and 0.3 pg g-1 for Rh and good reproducibility of the results. The concentrations PGEs found in dry deposition in various collection points indicated the clear difference accumulation these elements between reference point and impacted sites, suggesting that release PGEs by the vehicle catalysts can be considered high. Confirming this evidence, through the ternary graphs, which clearly showed similar distributions in the environmental samples and equality with MRC (Used Auto Catalysts). The spatial distributions of Pt, Pd and Rh are similar for Collection 2. Concentrations of the PGEs were ordered in Pt>Pd>Rh and were lower at the collection points for control samplings compared to other sites sampled. In view of the above, it can be concluded that the leaves of T. granulosa can be used as environmental biomonitor of vehicular emissions of PGEs constituent of vehicular catalysts.

As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)

Introdução:Até 60% das mulheres com endometriose apresentam como sintoma a infertilidade. Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos, especialmente quando não há distorção da anatomia pélvica. A etiologia multifatorial e comprometimento poligênico nesta doença têm sido amplamente aceitos. A aromatase é uma molécula das mais estudadas e há evidências de aumento da expressão do seu gene no endométrio eutópico e ectópico na endometriose. Esta enzima, codificada pelo gene CYP19A1, converte andrógenos a estrógenos e está presente normalmente nas células da granulosa, onde é fundamental para a produção esteroidogênica intrafolicular. Estudos in vitropor cultivo de células da granulosa, mostraram redução da atividade da aromatase em mulheres com endometriose. Devido à escassez de estudos que analisem a expressão do seu gene (CYP19A1) nessas células foi o que estimulou a proposta deste estudo. Este trabalho tem porobjetivo medir a expressão do gene da aromatase por PCR em tempo real nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. Pacientes e Métodos: Estudo caso-controle, com 11 mulheres com endometriose e 11 com os fatores tubáreo ou masculino de infertilidade,submetidas à hiperestimulação ovariana controlada (HOC) para reprodução assistida, num total de 12 ciclos para o grupo com endometriose e 11 para o controle. Não houve diferença entre as características clínicas dos dois grupos quanto à idade e parâmetros do ciclo de HOC. As células da granulosa murais foram coletadas de folículos pré-ovulatórios maduros no dia da captação oocitária e isoladas. Posteriormente, procedeu-se à extração do RNA (clorofórmio/ isopropanol) e à transcrição reversa. A PCR em tempo real foi realizada para quantificar os níveis de RNA mensageiro produzidos para o gene da aromatase, normalizados aos produtos do gene endógeno, ß-actina (expressão relativa). Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Resultados: não houve diferença na expressão do gene CYP19A1 nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose quando comparadas ao grupo controle (p>0,05; Mann Whitney), mesmo na comparação combinada considerando-se separadamente os diferentes graus de endometriose (controle vs. endometriose mínima/leve vs. endometriose moderada/grave, p>0,05;Kruskall Wallis). Conclusão:Os resultados deste estudo sugerem que a aromatase apresenta um mecanismo complexo de controle para sua expressão gênica nas células da granulosa e, apesar de evidências prévias de sua reduzida atividade nessas células na endometriose, a expressão de seu gene parece não estar afetada pela doeça, de acordo com o presente estudo. / Background: Up to 60% of women with endometriosis have infertility symptoms. However, mechanisms remain unclear, mainly when there is no distortion of pelvic anatomy. The multifactorial etiology and polygenic involvement of this disease have been widely accepted. Aromatase is one of the most studied molecules and there are evidences of increased expression of its gene (CYP19A1) on eutopic and ectopic endometrium in endometriosis. This enzyme, codified by the CYP19A1 gene, converts androgens to estrogens and is normally present in granulosa cells, where it plays an essential role for the intrafollicle steroidogenic production. In vitrostudies by granulosa cells culture have demonstrated reduced aromatase activity in women with endometriosis. The scarcity of studies assessing expression of the aromatase gene (CYP19A1) on these target cells stimulated the proposal of this research. The aim of this study is to quantify aromatase gene expression, by real-time PCR, in mural lutein-granulose cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques. Patients and Methods: a case-control study was conducted on 11 women with endometriosis and 11 with male or tubal causes of infertility submitted to ovarian hyperstimulation (HOC), with a total of 12 cycles for endometriosis and 11 for the control group. There was no difference between the groups regarding age or HOC parameters. Mural lutein-granulosacells were harvested from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval and properly isolated. Later, RNA extraction (clorophorm/isopropanol) and reverse transcription were performed. Real-time PCR was run to quantify RNAm products of aromatase gene normalized to those from the control gene, beta-actin (relative expression). All experiments were carried out in duplicate. Results: there was no difference between the groups regarding the gene expression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different stages of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). Conclusion: These results suggest that aromatase may have a complex control of its gene expression on granulosa cells and, despite of previous evidences showing its reduced activity on these target cells in endometriosis, the gene expression seems not affected by the disease, according to this study.

Introdução:Até 60% das mulheres com endometriose apresentam como sintoma a infertilidade. Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos, especialmente quando não há distorção da anatomia pélvica. A etiologia multifatorial e comprometimento poligênico nesta doença têm sido amplamente aceitos. A aromatase é uma molécula das mais estudadas e há evidências de aumento da expressão do seu gene no endométrio eutópico e ectópico na endometriose. Esta enzima, codificada pelo gene CYP19A1, converte andrógenos a estrógenos e está presente normalmente nas células da granulosa, onde é fundamental para a produção esteroidogênica intrafolicular. Estudos in vitropor cultivo de células da granulosa, mostraram redução da atividade da aromatase em mulheres com endometriose. Devido à escassez de estudos que analisem a expressão do seu gene (CYP19A1) nessas células foi o que estimulou a proposta deste estudo. Este trabalho tem porobjetivo medir a expressão do gene da aromatase por PCR em tempo real nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. Pacientes e Métodos: Estudo caso-controle, com 11 mulheres com endometriose e 11 com os fatores tubáreo ou masculino de infertilidade,submetidas à hiperestimulação ovariana controlada (HOC) para reprodução assistida, num total de 12 ciclos para o grupo com endometriose e 11 para o controle. Não houve diferença entre as características clínicas dos dois grupos quanto à idade e parâmetros do ciclo de HOC. As células da granulosa murais foram coletadas de folículos pré-ovulatórios maduros no dia da captação oocitária e isoladas. Posteriormente, procedeu-se à extração do RNA (clorofórmio/ isopropanol) e à transcrição reversa. A PCR em tempo real foi realizada para quantificar os níveis de RNA mensageiro produzidos para o gene da aromatase, normalizados aos produtos do gene endógeno, ß-actina (expressão relativa). Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Resultados: não houve diferença na expressão do gene CYP19A1 nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose quando comparadas ao grupo controle (p>0,05; Mann Whitney), mesmo na comparação combinada considerando-se separadamente os diferentes graus de endometriose (controle vs. endometriose mínima/leve vs. endometriose moderada/grave, p>0,05;Kruskall Wallis). Conclusão:Os resultados deste estudo sugerem que a aromatase apresenta um mecanismo complexo de controle para sua expressão gênica nas células da granulosa e, apesar de evidências prévias de sua reduzida atividade nessas células na endometriose, a expressão de seu gene parece não estar afetada pela doeça, de acordo com o presente estudo. / Background: Up to 60% of women with endometriosis have infertility symptoms. However, mechanisms remain unclear, mainly when there is no distortion of pelvic anatomy. The multifactorial etiology and polygenic involvement of this disease have been widely accepted. Aromatase is one of the most studied molecules and there are evidences of increased expression of its gene (CYP19A1) on eutopic and ectopic endometrium in endometriosis. This enzyme, codified by the CYP19A1 gene, converts androgens to estrogens and is normally present in granulosa cells, where it plays an essential role for the intrafollicle steroidogenic production. In vitrostudies by granulosa cells culture have demonstrated reduced aromatase activity in women with endometriosis. The scarcity of studies assessing expression of the aromatase gene (CYP19A1) on these target cells stimulated the proposal of this research. The aim of this study is to quantify aromatase gene expression, by real-time PCR, in mural lutein-granulose cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques. Patients and Methods: a case-control study was conducted on 11 women with endometriosis and 11 with male or tubal causes of infertility submitted to ovarian hyperstimulation (HOC), with a total of 12 cycles for endometriosis and 11 for the control group. There was no difference between the groups regarding age or HOC parameters. Mural lutein-granulosacells were harvested from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval and properly isolated. Later, RNA extraction (clorophorm/isopropanol) and reverse transcription were performed. Real-time PCR was run to quantify RNAm products of aromatase gene normalized to those from the control gene, beta-actin (relative expression). All experiments were carried out in duplicate. Results: there was no difference between the groups regarding the gene expression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different stages of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). Conclusion: These results suggest that aromatase may have a complex control of its gene expression on granulosa cells and, despite of previous evidences showing its reduced activity on these target cells in endometriosis, the gene expression seems not affected by the disease, according to this study.

Les Wnts représentent une famille de glycoprotéines de signalisation qui sont connues pour les nombreux rôles qu'ils jouent durant le développement embryonnaire et dans la cancerogénèse. Plusieurs Wnts, leurs récepteurs (Fzd) et d'autres composants des voies de signalisation des Wnt sont exprimés dans l’ovaire postnatal, et il a été démontré que l’expression de certains de ces gènes est régulée pendant le développement et l'ovulation/luteinization folliculaires. Toutefois, leurs rôles physiologiques dans l’ovaire demeurent mal définis. Pour étudier le rôle de WNT4 dans le développement folliculaire, nous avons entrepris d’identifier ses cibles transcriptionnels dans les cellules de la granulosa. Pour ce faire, nous avons employé la souris Catnbflox(ex3)/flox(ex3), chez laquelle une activation constitutive de la voie de Wnt/β-catenin a lieu suite à l’action de la recombinare Cre. Des cellules de la granulosa de ces souris ont été mises en culture et infectées avec un adenovirus pour causer la surexpression de WNT4 ou l’expression de Cre. L’ARN a alors été extrait de ces cellules et analysé par micro-puce. Les résultats ont démontré qu’une forte proportion des gènes induits par WNT4 étaient des gènes impliqués dans la réponse cellulaire au stress. Presque tous gènes induits par WNT4 ont également été induits par Cre, indiquant que WNT4 signale via la voie Wnt/β-catenin dans ces cellules. Nos résultats suggèrent donc que WNT4 favorise la survie des follicules par l’induction de gènes de réponse au stress dans les cellules de la granulosa, augmentant ainsi la résistance cellulaire à l'apoptose. / The Wnts comprise a large family of local-acting, secreted glycoprotein signaling molecules that are known mostly for the numerous roles they play in embryonic development and cancer. Several Wnts, their cognate receptors of the Frizzled (Fzd) family and other components of the Wnt signaling pathways are expressed in the postnatal ovary, and several have been shown to exhibit specific patterns of regulation in response to gonadotropin stimulation. Nonetheless, their role(s) in ovarian physiology remain poorly defined. To study the role of WNT4 in follicle development, we endeavoured to identify its transcriptional targets in granulosa cells. To this end, we used the Catnbflox(ex3)/flox(ex3) mouse model, in which constitutive activation of the Wnt/β-catenin pathway is obtained following Cre-mediated genetic recombination. Cultured granulosa cells from these mice were infected with adenoviruses to either overexpress WNT4 or to express Cre. RNA from these cells was then extracted and subjected to microarray analysis. Results revealed that a large proportion of the genes induced by WNT4 were genes previously shown to mediate cellular stress responses. Nearly all genes that were up-regulated by WNT4 were also induced by the Cre, indicating that WNT4 signals via the Wnt/β-catenin pathway in these cells. Our findings suggest that WNT4 mediates ovarian follicle survival by inducing a stress response in granulosa cells, thereby increasing their resistance to apoptosis.

Comprendre les événements paracriniens qui régulent la fertilité chez la vache est nécessaire non seulement en raison de l'importance agricole de cette espèce, mais aussi pour son utilisation potentielle comme modèle chez l’humain. L'oxyde nitrique (NO), un gaz de radicaux libres, a été impliqué dans la croissance folliculaire et l'ovulation chez les rongeurs et d'autres espèces, mais chez la vache c’est une énigme fascinante : le NO est produit par les cellules de la granulosa bovine et est régulé par la FSH, mais la présence et le profil d'expression des enzymes responsables de la synthèse de NO (NOS) dans les cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire ne sont pas claires. Les objectifs de cette thèse sont: (1) élucider le mécanisme de contrôle des NOS et les conséquences de la production d'oxyde nitrique pour le fonctionnement des cellules de la granulosa au cours du développement folliculaire chez la vache et (2) déterminer la régulation des NOS pendant la cascade ovulatoire induite par LH chez les cellules de la granulosa bovine et si l'activité des NOS pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire chez cette espèce. Les résultats sont séparés en 2 articles. Dans le premier article, la régulation de NOS2 dans les cellules de la granulosa bovine a été explorée. L'abondance des ARNm codant pour NOS2 a été stimulée par la FSH et l’IGF1 en augmentant l’estradiol, et un blocage de l'action de l’estradiol a conséquemment réduit les niveaux d'ARNm codant pour NOS2. De plus, l'inhibition de l'activité des NOS a augmenté l'apoptose dans les cellules de la granulosa in vitro. Dans le second article, il a été démontré que le pic de LH induit une activation des NOS dans les cellules de la granulosa, et que l'activité de NOS induit la production de NO, ce qui est essentiel pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire induite par LH comme EREG/AREG/PTGS2. Ensemble, les résultats présentés dans ces 2 articles suggèrent que les niveaux physiologiques d'activité des NOS peuvent contribuer à la croissance et la survie des cellules de la granulosa et indiquent également que NO peut être essentiel pour l'ovulation chez les bovins. / Understanding the paracrine events that regulate fertility in the cow is necessary not only because of the agricultural importance of this species, but also its potential use as a model for humans. Nitric oxide (NO), a free-radical gas, has been implicated in follicular growth and ovulation in rodents and other species, but the cow is an intriguing enigma: NO is produced by bovine granulosa cells and is regulated by FSH, but the presence and the expression pattern in granulosa cells of the enzymes responsible for NO synthesis (NOS) throughout follicular growth are unclear. The objectives of the present thesis were (1) to elucidate the mechanism of control of NOS and the consequences of nitric oxide production for granulosa cell function during follicle development in cattle; and (2) to determine the regulation of NOS during the LH-induced ovulatory cascade in bovine granulosa cells and whether NOS activity is critical for the ovulatory cascade in this species. The results are separated in 2 articles. In the first article, the regulation of NOS2 in bovine granulosa cells was explored. Abundance of mRNA encoding NOS2 was stimulated by FSH and IGF1 through increased estradiol, and a blockade of estradiol action consequently lowered NOS2 mRNA levels. Further, inhibition of NOS activity increased apoptosis in granulosa cells in vitro. In the second article, it was demonstrated that the LH surge induces NOS activation in granulosa cells, and that NOS activity induces the production of NO, which is essential for EREG/AREG/PTGS2 expression, critical genes in the LH-induced ovulatory cascade. Together, the results presented in these 2 articles suggest that physiological levels of NOS activity may contribute to growth and survival of granulosa cells, and also indicate that NO may be essential for ovulation in cattle.

La régulation transcriptionnelle des gènes est un processus indispensable sans lequel la diversité phénotypique des cellules ainsi que l’adaptation à leur environnement serait inexistant. L’identification des éléments de régulation dans le génome est d’une importance capitale afin de comprendre les mécanismes gouvernant l’expression des gènes spécifiques à un type cellulaire donné. Ainsi, suite au pic de LH, le follicule ovarien entre dans un programme intensif de différentiation cellulaire, orchestré par des modifications majeures du profile transcriptionnel des cellules de granulosa, déclenchant ultimement l’ovulation et la lutéinisation, processus indispensables à la fertilité femelle. L’hypothèse supportée par cette étude stipule qu’une réorganisation de la structure chromatinienne survient aux régions régulatrices d’une panoplie de gènes dans les heures suivant le pic de LH et qu’en isolant et identifiant ces régions, il serait possible de retrouver des éléments essentiels aux processus d’ovulation et de lutéinisation. Ainsi, en utilisant un protocole standard de superovulation chez la souris, les éléments de régulation se modifiant 4h suivant l’administration de hCG ont été isolés et identifiés dans les cellules de granulosa en utilisant la méthode FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combinée à un séquençage haut débit. Cette étude a démontré que suite au stimulus ovulatoire, les cellules de granulosa subissent une reprogrammation majeure des éléments de régulation, qui est corrélée avec une modification drastique de leurs fonctions biologiques. De plus, cette étude a mis en évidence une association majoritaire des éléments de régulation à des régions intergéniques distales et à des introns, indiquant que ces régions ont une importance capitale dans la régulation transcriptionnelle dans les cellules de granulosa. Cette étude a également permis d’identifier une panoplie de régulateurs transcriptionnels reconnus pour être essentiels à la fonction ovarienne, ainsi que leur sites de liaison dans le génome, démontrant que la méthode FAIRE est une méthode assez puissante pour permettre la prédiction d’événements moléculaires précis ayant un sens physiologique réel. / Identification of regulatory elements in the genome is of paramount importance to understanding the mechanisms governing the expression of specific genes in a given cell type. Following the LH surge, the ovarian peri-ovulatory follicle enters an intensive program of cellular differentiation, orchestrated by major changes in the transcriptional profile of granulosa cells, ultimately triggering ovulation and luteinization, processes essentials for fertility in females. In the mouse, several genes essential to the success of this program are induced 2 to 6 hours after the ovulatory stimulus. Using a standard protocol for superovulation in mice, the regulatory elements were isolated and identified in granulosa cells 4h after administration of hCG using the method FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combined with next generation sequencing. The results of this analysis demonstrate that after the ovulatory stimulus, granulosa cells undergo a major reprogramming of regulatory elements, which is correlated with the extensive changes in their biological functions. In addition, this study showed that most regulatory elements were associated with distal intergenic regions and introns, indicating that these regions are important in transcriptional regulation in granulosa cells. A variety of transcriptional regulators known to be essential for ovarian function, and their binding sites were also identified in this analysis, demonstrating that the FAIRE method has the power to predict molecular events that have correlates in the known physiology of ovarian processes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / It is well established that locally produced factors exert pivotal roles during dominant follicle selection, oocyte maturation, ovulation and luteolysis. However, the identification of these factors and pathways involved in these processes are not yet established. In the present study, we focused on the in vivo bovine models to study reproductive physiology, which were used to identify receptors and intracellular signaling pathways involved in follicle selection and luteolysis. In the first study, it was reviewed the in vivo models used in our lab, describing and discussing the different bovine models and techniques currently used to study ovarian physiology in this mono-ovulatory specie. In a second study, it was evaluated the expression of estrogen receptors (ESRs) before (day 2 of follicular wave), during (day 3) and after (day 4) follicular deviation in cattle. ESR1 and ESR2 transcripts levels were higher in dominant (F1) than subordinate (F2) follicle after follicular deviation. FSH treatment maintained mRNA levels of both ESR1 and ESR2 in F2 follicles at similar levels observed in F1 follicles. Intrafollicular injection of 100 μM fulvestrant (an antagonist of ESRs) inhibited follicular growth and decreased CYP19A1 mRNA levels. Transcript levels of both ESR1 and ESR2 were not affected by fulvestrant injection. In the third study, our objective was to demonstrate the role of the transcription factor signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and the nuclear receptor 5A2 (NR5A2) in luteolysis. Luteal and blood samples were collected from separate groups of cows on Day 10 of the estrous cycle 0, 2, 12, 24, and 48 hours after prostaglandin F2 alpha (PGF) treatment. Serum progesterone concentrations decreased (P < 0.05) within 2h and the histological examination of the corpus luteum at 24 and 48h after PGF treatment confirmed functional and morphological luteolysis, respectively. The abundance of STAR mRNA and protein decreased at 12h after PGF treatment. The abundance of NR5A2 mRNA and protein decreased (P < 0.05) at 12 and 24h post-PGF, respectively. Levels of STAT3 mRNA remained constant (P > 0.05) throughout the time-points evaluated. However, the abundance of phosphorylated isoform of STAT3, normalized to total STAT3, increased reaching a peak at 12h and remaining high until 48h after PGF treatment. In conclusion, bovine in vivo models provide a valuable system to study reproductive events under physiological endocrine environment while keeping intact the communication between follicular cells through autocrine and paracrine signaling, without the need to perform ovariectomy or euthanaze the animals. Our results suggest that both ESR1 and ESR2 are regulated during follicular deviation and dominance and in response to FSH treatment in cattle, ESRs are required for normal gene expression and development of the dominant follicle. PGF treatment results in decreased expression of the nuclear receptor NR5A2 and activation of STAT3 by phosphorylation in bovine luteal cells. / É bem estabelecido que fatores produzidos localmente exercem papel essencial durante a seleção do folículo dominante, maturação oocitária, ovulação e luteólise. No entanto, os fatores e vias envolvidas nestes processos não estão totalmente estabelecidos. No presente estudo, enfatizou-se o uso de modelos bovinos in vivo para o estudo da fisiologia reprodutiva, sendo aqui utilizados para identificar receptores e vias de sinalização intracelular envolvidas na seleção do folículo e luteólise. No primeiro estudo, revisaram-se os modelos in vivo utilizados em nosso laboratório, descreveram-se e discutiram-se os diferentes modelos em bovinos e técnicas atualmente utilizadas para estudar fisiologia ovariana nesta espécie monovulatória. Em um segundo estudo, avaliou-se a expressão de receptores de estradiol (ESRS) antes (dia 2 da onda folicular), durante (dia 3) e após (dia 4) a divergência folicular em bovinos. Os níveis dos transcritos ESR1 e ESR2 foram maiores no folículo dominante (F1) que no subordinado (F2) após a divergência folicular. O tratamento com FSH manteve os níveis de RNAm de ambos ESR1 e ESR2 nos folículos F2 em níveis semelhantes aos observados em folículos F1. A injeção intrafolicular de 100 uM de fulvestrant (um antagonista de ESRs) inibiu o crescimento folicular e causou uma diminuição dos níveis de RNAm de CYP19A1. Os níveis de transcritos, tanto para ESR1 e ESR2, não foram afetados pela injeção de fulvestrant. Num terceiro estudo, o nosso objetivo foi demonstrar o papel do Transdutor de sinais e ativador de transcrição 3 (STAT3) e do receptor nuclear 5A2 (NR5A2) na luteólise. Amostras de corpo lúteo (CL) e sangue foram coletadas dos grupos de vacas 0, 2, 12, 24 e 48 horas após o tratamento com prostaglandina F2 alpha (PGF) no dia 10 do ciclo estral. A concentração de progesterona sérica diminuiu (P < 0.05) em 2 horas e o exame histológico do CL às 24h e 48h após o tratamento com PGF confirmou a ocorrência de luteólise funcional e morfológica, respectivamente. A abundância de RNAm e proteína de STAR diminuiu às 12h após o tratamento com PGF. A abundância de RNAm e proteína de NR5A2 diminuiu (P < 0.05) às 12 e 24 horas pós-PGF, respectivamente. Os níveis de RNAm de STAT3 permaneceram constantes (P> 0.05) ao longo do tempo avaliado. No entanto, a abundância da isoforma fosforilada de STAT3, normalizados para STAT3 total, aumentou, atingindo um pico às 12h e permaneceu elevada até 48h após o tratamento com PGF. Em conclusão, os modelos bovinos in vivo fornecem um sistema valioso para estudar os eventos reprodutivos sob ambiente fisiológico, mantendo intacta a comunicação entre as células foliculares através de sinalização autócrina e parácrina, reduzindo a necessidade de realizar ovariectomia ou realizar a eutanásia dos animais. Nossos resultados sugerem que tanto ESR1 como ESR2 são regulados durante a divergência e dominância folicular em bovinos e em resposta ao tratamento com FSH, e ESRs são necessários para a expressão gênica e para o desenvolvimento do folículo dominante. O tratamento com PGF resulta em diminuição da expressão do receptor nuclear NR5A2 e ativação de STAT3 por fosforilação em células luteais bovinas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Ovulation is controlled by a complex and dynamic interaction of factors, including endocrine and vasoactive mechanisms, cellular messengers and activating enzymes. It is well established that locally produced factors exert pivotal roles during ovulation. Some peptides such as angiotensin II (Ang II) and Natriuretic Peptides (NPs) have been prominent in local regulation of reproductive functions of mammals, beyond its systemic activities. Unlike angiotensin II (AngII), the role of angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] has not been characterized in the ovary of mono-ovulatory species. In the first study, was evaluated the effect of Ang-(1-7) and its receptor (MAS) in the regulation of the ovulatory cascade. For this we used an in vitro model of supplementation with Ang- (1-7) or blocking its receptor on EREG mRNA expression in granulosa cells. Using an in vivo model, the intrafollicular injection of Ang-(1-7) antagonist (A-779 - MAS receptor inhibitor) was performed to evaluate the ovulation rate. Results showed that the Ang- (1-7) and A-779 inhibitor when in vitro culture, were not able to regulate to EREG mRNA expression. Likewise, the intrafollicular injection of A-779 did not block ovulation before the expected time of LH peak, suggesting that Ang-(1-7) has no role in the early ovulatory cascade in cattle. In the second experiment, the aim was to evaluate the pattern of mRNA expression in bovine granulosa cells for the Natriuretic Peptides Precursors (NPPs), receptors (NPRs) and key enzymes of this system after GnRH-induced ovulation in vivo. Using in vivo model main results have been shown the presence of several components of NPs system during ovulation in cattle, as well as increased mRNA expression for NPPC (natriuretic peptide precursor C) in granulosa cells after induction of ovulation with GnRH / LH. These results provide the first evidence that the C-type natriuretic peptide (NPC) is upregulated by LH and may be involved in ovulation and bovine luteinizing. Third study was conducted to answer like LH controls the mRNA expression for NPPC if this is up-regulated through EGF receptor (EGF-R). Moreover, we evaluated if the NPC regulates genes in ovulatory cascade and blockade EGF-R is capable of altering ovulation rate. For this we used an in vitro model of granulosa cell culture from large follicles (> 12 mm) and in vivo models to study ovulation, combined with intrafollicular injection and follicular dynamics and / or ovariectomy at strategic times. Our main results were: NPC does not regulate mRNA expression for amphiregulin (AREG) and EREG in vitro; NPPC mRNA coding is regulated by EGF-R but block EGF-R was not able to change the ovulation rate in bovines. These results suggest that the regulation and function of NPs during ovulation may differ between monovular and polyovular species. / A ovulação é controlada por uma complexa e dinâmica interação de fatores, incluindo mecanismos endócrinos e vasoativos, mensageiros celulares e enzimas ativadoras. Fatores produzidos localmente exercem papel essencial durante o período ovulatório. Alguns peptídeos como Angiotensina II (AngII) e os Peptídeos Natriuréticos (NPs) têm se destacado na regulação local das funções reprodutivas, além de suas atividades sistêmicas. Ao contrário da AngII, a função da Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] ainda não está caracterizada no ovário de espécies monovulatórias, como o bovino. No primeiro estudo foi avaliado o efeito da Ang-(1-7) e de seu receptor (MAS) na regulação da ovulação. Para isso foi realizada a suplementação com Ang-(1-7) ou bloqueio de seu receptor, em células da granulosa cultivadas in vitro, sobre a expressão de RNAm para epirregulina (EREG marcador inicial do processo de ovulação). Utilizando um modelo in vivo, foi realizada a injeção intrafolicular do inibidor do receptor MAS (A-779) para avaliar a taxa de ovulação. Os resultados demonstraram que a Ang-(1-7) e o inibidor A-779 quando em cultivo in vitro, não foram capazes de regular a expressão de RNAm para EREG. Da mesma forma que injeção intrafolicular de A-779 não inibiu o processo ovulatório, indicando que a Ang-(1-7) não possui papel relevante no início da cascata ovulatória em bovinos. No segundo estudo o objetivo foi caracterizar a expressão dos NPs, seus receptores e enzimas convertases durante a ovulação induzida a partir de GnRH/LH em bovinos. Utilizando modelo in vivo foram demonstrados como principais resultados a presença de vários componentes do sistema NPs durante a ovulação em bovinos, bem como um aumento na expressão de RNAm para NPPC (precursor do peptídeo natriurético tipo C) após indução da ovulação GnRH / LH em células da granulosa. Esses resultados fornecem a primeira evidência que o peptídeo natriurético tipo C (NPC) é regulado positivamente pelo LH e pode estar envolvido na ovulação e luteinização de bovinos. O terceiro estudo foi realizado para responder como ocorre a regulação do RNAm para NPPC pelo LH, se essa regulação é via receptor de EGF (EGF-R). Além disso, avaliamos se o NPC regula genes da cascata ovulatória e se o bloqueio EGF-R é capaz de alterar a taxa de ovulação. Para isso foram utilizados modelos in vitro de cultivo de células da granulosa de folículos grandes (> 12 mm) e modelos in vivo para estudo da ovulação aliados à injeção intrafolicular com ovariectomia em momentos estratégicos e/ou dinâmica folicular. Nossos principais resultados foram: NPC não regula a expressão de RNAm para anfirregulina (AREG) e EREG in vitro; RNAm para NPPC é regulado via EGF-R porém o bloqueio de EGF-R não foi capaz de alterar a taxa de ovulação em bovinos. Estes resultados sugerem que a regulação e função dos NPs durante a ovulação pode diferir entre espécies mono e multiovulatórias.

Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Resumo: O hormônio Anti-Mülleriano (AMH) tem sido proposto como marcador fidedigno da reserva ovariana, estimando a expectativa de vida reprodutiva remanescente da fêmea. Atualmente, em reprodução assistida humana, tem sido utilizado para determinar o tratamento a ser seguido e conduzir a expectativa da paciente. Em equinos, pouco se sabe sobre a produção de AMH e sua importância clínica. Sendo assim, o objetivo principal deste estudo foi descrever a concentração de AMH ao longo da vida das éguas e avaliar sua concentração após ovariectomia, em busca de relacionar AMH com reserva folicular ovariana. Foram realizados 2 experimentos. Experimento 1: Foi realizada a colheita de sangue de 1058 éguas Quarto de Milha, de 1 dia a 33 anos de idade, com o objetivo de relacionar AMH com a idade da égua. Experimento 2: 13 éguas (6 jovens e 7 idosas) foram submetidas a duas cirurgias de ovariectomia com intervalo médio de 111 dias. Amostras de sangue para dosagem de AMH foram retiradas imediatamente antes da primeira cirurgia e diariamente durante 15 dias. Na segunda cirurgia, amostras de sangue foram coletadas imediatamente antes da cirurgia e 15 dias após a mesma. AMH foi dosado por técnica de ELISA (Equine AMH ELISA; Ansh Labs, Webster, TX, USA). Testes não paramétricos foram utilizados para confrontar as medianas dos níveis de AMH entre diferentes categorias de idade e médias dos períodos pré e pós operatórios. A idade foi responsável por somente 5% da variabilidade dos níveis de AMH. A conc... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor