The H9N2 low pathogenic avian influenza virus (LPAIV) is considered a prime candidate for evolving into a highly pathogenic AIV (HPAIV) following circulation in domestic poultry, due to its widespread endemism in Eurasia and the donation of internal genes to H5 and H7 HPAIV. In this study, we investigated if a LP H9N2 virus could acquire increased pathogenicity following nineteen serial passages in week-old chickens. We show that the H9N2 virus remained low pathogenic in chickens after nineteen serial passages, evidenced by a lack of mortality in chickens despite efficient viral replication in chicken organs. An overregulation of cytokine response to infection, typical of highly pathogenic viruses, was not observed in tissue organs analyzed by quantitative PCR. The serial passaging of the H9N2 virus led to reduced virulence in chicken embryos and reduction in Hemagglutinin heat stability after passaging. The positive selection of Leucine at amino acid position 226 (L226) after 19 passages suggests the H9N2 can gain mammalian adaptation markers following circulation in domestic poultry. In addition, we carried out four experiments to determine the effectiveness of aerosol exposure of H6N1, H10N7, H10N8 and H13N6 LPAIV’s in causing infection, immune dysregulation and mortality in chickens compared to intranasal and oral inoculation routes. From our study, we observed mortality of chickens exposed to H6N1 and H10N8 viruses via aerosols. Aerosol exposure also resulted in more efficient replication in the respiratory tracts of chickens than intranasal or oral inoculated chickens. In addition, overexpression of pro-inflammatory (IL-6, IL-1ß) and antiviral (INF- γ) cytokines was observed in chickens exposed to aerosols compared to intranasal and oral inoculation. Our results show that the aerosol route of exposure is efficient at causing infection in chickens and should be factored into control and prevention strategies against AIV.

Rokshana Parvin Molecular epidemiology and biological properties of avian influenza viruses of subtype H5N1 and H9N2 Institute of Virology Submitted in November 2014 Pages 106, Figures 7, Table 1, References 339, Publications 4 Keywords: Avian Influenza Virus, H5N1, H9N2, Reassortment, Mutation, Replication and Growth kinetics Introduction Avian influenza viruses (AIVs) are the major cause of significant disease outbreaks with high morbidity and mortality worldwide in domestic birds resulting in great economic losses. Especially the subtypes of highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) H5N1 and low pathogenic avian influenza viruses (LPAIV) H9N2 became the most prevalent AIVs in poultry causing regular disease outbreaks in many countries of Asia, the Middle East and Europe and are still ongoing events. Therefore, continues monitoring, surveillance and characterization of the circulating viruses are of high priority. Objectives The current study was designed for three main objectives; i) Molecular epidemiology of the HPAIV H5N1 in migratory birds in Bangladesh, ii) Molecular characterization of the AIV subtype H9N2 and iii) Biological properties of the AIV subtype H9N2. Materials and methods In first the part of the investigations, two HPAIV H5N1 strains were confirmed from 205 pools of fecal surveillance samples in Bangladesh. The two isolated H5N1 viruses were characterized by genome amplification and sequence analysis of the all eight genome segments. In the second part of the investigations, a confirmed AIV H9N2 from a retrospective analysis derived from a poultry farm in Bangladesh was characterized. Furthermore, three AI-H9N2 viruses were isolated and characterized from a commercial broiler and broiler breeder flock with clinical respiratory manifestations in Egypt. Full length genome amplification, cloning, sequencing and comprehensive phylogenetic analyses were performed for all eight genome segments. In the final part of the study, four selected Eurasian lineage H9N2 viruses - three G1 sub-lineages H9N2 and one European wild bird H9N2 virus - were propagated in embryonated chicken eggs (ECE) and Madin-Darby canine kidney epithelial cell culture systems. The ECE-grown and cell culture-grown viruses were monitored for replication kinetics based on tissue culture infectious dose (TCID50), hemagglutination assay (HA) and quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR). The cellular morphology after infections was analyzed by immunofluorescence assay and cellular ELISA was performed to screen the sensitivity of the viruses to amantadine. Results The two newly isolated HPAIV H5N1 strains from migratory birds belonged to clade 2.3.2.1 and clustered together with other recently isolated viruses in Bangladesh derived from ducks, chickens, quails and crow. The amino acid sequences were also genetically similar although, some unique amino acid substitutions were observed. These substitutions were not related to the known conserved region of the molecular determinants of the virus. The phylogenetic analyses of the isolated AIV H9N2 from Bangladesh and Egypt revealed their close relationship with their respective contemporary isolates and maintained ancestor relation with A/Quail/HK/G1/1997 confirming that all studied H9N2 belonged to G1 sub-lineage. All six internal gene segments of the Bangladeshi AIV H9N2 showed high sequence homology with the HPAIV subtype H7N3 from Pakistan. In addition, also the PB1 internal gene showed high nucleotide homologies with a recently circulating HPAI-H5N1 virus from Bangladesh. Thus, the Bangladeshi AIV H9N2 is genetically a unique strain which shares internal gene segments with different HPAI viruses and takes part in reassortment events. On the other hand, the internal gene segments of the Egyptian H9N2 viruses were similar to the other members of the G1 sub-lineage with no evidence of reassortment events. In this virus rather point mutations within their respective gene segments are observed. With regard to the biological characterization, the three G1-H9N2 viruses produced comparatively higher titer than the Eurasian wild type-AIV H9N2. Overall, the ECE-grown viruses yielded higher titers than cell culture-grown viruses. Following a single passage in cell culture, individual nucleotide substitutions were noticed in HA, NA and NS gene sequences but none of them are related to the conserved region that can alter virus pathogenesis or virulence. All of the studied H9N2 viruses were sensitive to amantadine. Conclusion The present study demonstrated for the first time the presence of HPAI H5N1 in the wild migratory bird population in Bangladesh and determine as one of the major cause to introduce the new clade of HPAIV H5N1 into the Bangladeshi poultry flocks. The Bangladeshi AIV H9N2 strain has exhibited two independent reassortment events with HPAIV of subtype H7N3 and H5N1.The Egyptian AIV H9N2 strains were limited to regular point mutations which is very common for AIVs. The G1-H9N2 viruses showed a higher replication profile when compared to European wild bird-AIV H9N2. Both the ECE and MDCK cell system allowed efficient replication but the ECE system is considered as the better cultivation system for H9N2 viruses in order to get maximum amounts of virus within a short time period. In this study new strains of AIV H9N2 and H5N1 with significant genetic constitutions were described. Thus, continuous monitoring of the field samples, rapid reporting soon after outbreaks, molecular characterization to confirm the emergence of new reassortant strains and the biological properties to know its impact on the virulence are recommended. / Rokshana Parvin Molekulare Epidemiologie und biologische Charakterisierung von aviären Influenzaviren der Subtypen H5N1 und H9N2 Institut für Virologie Eingereicht im November 2014 Seiten 106, Abbildungen 7, Tabelle 1, Literaturangaben 339 , Publikationen 4 Schlüsselwörter: Aviäres Influenza Virus, H5N1, H9N2, Reassortment, Mutation, Replikation und Wachstumskinetik Einleitung Weltweit kommt es in der Geflügelproduktion durch Infektionen mit aviären Influenzaviren (AIV) zu hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten und damit verbunden zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Zu den bedeutenden AIV in der Geflügelwirtschaft werden die hoch pathogenen aviären Influenzaviren (HPAIV) des Subtyps H5N1 sowie AIV des Subtyps H9N2 gezählt. Letztere besitzen die Charakteristika von niedrigpathogenen aviären Influenzaviren. Durch diese Subtypen kommt es regelmäßig in vielen Ländern in Asien, im Nahen Osten und Europa zu wiederholten Krankheitsgeschehen. Dies bedingt die dringende Notwendigkeit von andauerndem Monitoring, Überwachung und Charakterisierung der zirkulierenden Viren. Ziele der Untersuchungen Die vorliegende Studie soll folgende drei Hauptfragestellungen beantworten: i) Molekulare Epidemiologie des HPAIV H5N1 bei Zugvögeln in Bangladesch, ii) Molekulare Charakterisierung von AIV des Subtyps H9N2 und iii) Biologische Eigenschaften von AIV des Subtyps H9N2. Materialien und Methoden Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit zwei HPAIV Stämmen des Subtyps H5N1, welche im Monitoring Programm in Bangladesch von insgesamt 205 gepolten Kotproben, isoliert wurden. Die Charakterisierung der beiden Isolate erfolgte durch Vervielfältigung der acht Genomsegmente und nachfolgende phylogenetische Analysen. Der zweite Teil der Arbeit beschreibt die retrospektive Analyse eines AIV des Subtyps H9N2, welches von einer Geflügelproduktionsanlage in Bangladesch eingesandt wurde. Weiterhin wurden aus einer Geflügelmast- und Legehennenhaltung mit respiratorischer Symptomatik drei AIV des Subtyps H9N2 isoliert und charakterisiert. Auch hier wurde das gesamte Genom amplifiziert, kloniert und nachfolgend phylogenetisch analysiert. Im letzten Teil der Studie wurden vier europäische AIV H9N2 Isolate, von welchen 3 Isolate zur H9N2 Sublinie G1 gehören und ein Isolat von einem Wildvogel selektiert und in embryonierten Hühnereiern (EHE) und auf Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen passagiert. Mittels 50% tissue culture infectious dose (TCID50), Hämagglutinationstest (HA) und RT-real-time-PCR (qRT-PCR) wurden von diesen so passagierten Viren die Vermehrungskinetik bestimmt. Die Morphologie der infizierten Zellen nach Infektion wurde mittels Immunfluoreszenztest analysiert. Eine Bestimmung der Amantadin Empfindlichkeit dieser Viren erfolgte mit einem ELISA. Ergebnisse Die beiden neuen HPAIV des Subtyps H5N1 von Zugvögeln können in die Clade 2.3.2.1 eingeordnet werden und clustern mit kürzlich aus Enten, Hühnern, Wachteln und Krähen isolierten AIV aus Bangladesch. Eine Verwandtschaft der Viren konnte auch auf Ebene der Aminosäure Sequenz gezeigt werden, obwohl einige einzigartige Aminosäure Austausche nachgewiesen wurden. Diese Austausche zeigen keine Verbindung mit bekannten konservierten Regionen der molekularen Determinanten der Viren. Die phylogenetische Analyse der AIV aus Bangladesch und Ägypten zeigt eine deutliche Verbindung mit den derzeit zirkulierenden AIV auf diesem geographischen Gebiet sowie die Verwandtschaft zu dem Isolat A/Quail/HK/G1/1997. Dies bestätigt, dass die in dieser Studie analysierten AIV zu der Subline G1 gehören. Alle sechs internen Gensegmente des AIV H9N2 aus Bangladesch zeigen eine hohe Sequenz Homologie mit einem HPAIV des Subtyps H7N3 aus Pakistan. Zusätzlich zeigt das interne Gene PB1 eine hohe Homologie auf Nukleinsäureebene zu einem derzeit in Bangladesch zirkulierenden HPAIV des Subtyps H5N1. Somit ist das AIV H9N2 aus Bangladesch als ein einzigartiges Isolat anzusehen, welches durch Reassortierung interne Gensegmente mit hochpathogenen AIV teilt. Im Gegensatz dazu, sind die internen Gene des AIV H9N2 aus Ägypten sehr ähnlich zu anderen Mitgliedern der Sublinie G1, welche keine Hinweise auf Reassorierung zeigen. Nur einzelne Punktmutationen konnten in den entsprechenden Gensegmenten nachgewiesen werden. In Hinblick auf die biologische Charakterisierung, konnte in den drei AIV H9N2 der Sublinie G1 vergleichsweise höhere Titer nachgewiesen werden als in einem europäischen AIV H9N2 Wildtypisolat. Insgesamt zeigten die in EHE passagierten Viren höhere Titer als die MDCK-Zell passagierten Viren. Schon nach einer Passage auf Zellkultur konnten einzelne Nukleotidaustausche in den HA, NA und NS kodierenden Gensegmenten nachgewiesen werden, wobei keine dieser Veränderungen einen Einfluss auf konservierte Regionen haben, die die Pathogenese oder Virulenz der Viren beeinflussen. Alle untersuchten H9N2 Viren sind sensitiv gegenüber Amantadin. Schlussfolgerungen Die vorliegende Studie zeigt erstmalig das Vorkommen von HPAIV H5N1 bei Zugvögeln in Bangladesch, welches als Haupteintragsquelle der neuen HPAIV H5N1 in der dortigen Geflügelhaltung angesehen wird. Das AIV H9N2 aus Bangladesch zeigt zwei unabhängige Reassortierungen mit HPAIV des Subtyps H7N3 und H5N1. Hingegen zeigt das ägyptische AIV H9N2 Punktmutationen, welche sehr typisch für diese Viren sind. Die hier untersuchten AIV H9N2 der Sublinie G1 zeigen im Vergleich zu einem europäischen AIV H9N2 eine höhere Replikationsrate. Eine Replikation der Viren konnte in EHE und MDCK-Zellen gezeigt werden, jedoch wird das EHE als das geeignetere System für die Kultivierung von H9N2 Viren betrachtet, da hier in einer kürzeren Zeitspanne mehr Virus produziert werden kann. Des Weiteren konnten in dieser Studie neue Isolate von AIV des Subtyps H9N2 und H5N1mit einem bedeutenden genetischen Aufbau beschrieben werden. Daher wird ein kontinuierliches Monitoring von Feldproben, unverzügliche Meldung von Ausbruchsgeschehen, die molekulare Charakterisierung zur Dokumentation eventuell auftretender neuer Reassortanten sowie Untersuchungen der biologischer Eigenschaften zur Virulenzbestimmung empfohlen.

Rokshana Parvin Molecular epidemiology and biological properties of avian influenza viruses of subtype H5N1 and H9N2 Institute of Virology Submitted in November 2014 Pages 106, Figures 7, Table 1, References 339, Publications 4 Keywords: Avian Influenza Virus, H5N1, H9N2, Reassortment, Mutation, Replication and Growth kinetics Introduction Avian influenza viruses (AIVs) are the major cause of significant disease outbreaks with high morbidity and mortality worldwide in domestic birds resulting in great economic losses. Especially the subtypes of highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) H5N1 and low pathogenic avian influenza viruses (LPAIV) H9N2 became the most prevalent AIVs in poultry causing regular disease outbreaks in many countries of Asia, the Middle East and Europe and are still ongoing events. Therefore, continues monitoring, surveillance and characterization of the circulating viruses are of high priority. Objectives The current study was designed for three main objectives; i) Molecular epidemiology of the HPAIV H5N1 in migratory birds in Bangladesh, ii) Molecular characterization of the AIV subtype H9N2 and iii) Biological properties of the AIV subtype H9N2. Materials and methods In first the part of the investigations, two HPAIV H5N1 strains were confirmed from 205 pools of fecal surveillance samples in Bangladesh. The two isolated H5N1 viruses were characterized by genome amplification and sequence analysis of the all eight genome segments. In the second part of the investigations, a confirmed AIV H9N2 from a retrospective analysis derived from a poultry farm in Bangladesh was characterized. Furthermore, three AI-H9N2 viruses were isolated and characterized from a commercial broiler and broiler breeder flock with clinical respiratory manifestations in Egypt. Full length genome amplification, cloning, sequencing and comprehensive phylogenetic analyses were performed for all eight genome segments. In the final part of the study, four selected Eurasian lineage H9N2 viruses - three G1 sub-lineages H9N2 and one European wild bird H9N2 virus - were propagated in embryonated chicken eggs (ECE) and Madin-Darby canine kidney epithelial cell culture systems. The ECE-grown and cell culture-grown viruses were monitored for replication kinetics based on tissue culture infectious dose (TCID50), hemagglutination assay (HA) and quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR). The cellular morphology after infections was analyzed by immunofluorescence assay and cellular ELISA was performed to screen the sensitivity of the viruses to amantadine. Results The two newly isolated HPAIV H5N1 strains from migratory birds belonged to clade 2.3.2.1 and clustered together with other recently isolated viruses in Bangladesh derived from ducks, chickens, quails and crow. The amino acid sequences were also genetically similar although, some unique amino acid substitutions were observed. These substitutions were not related to the known conserved region of the molecular determinants of the virus. The phylogenetic analyses of the isolated AIV H9N2 from Bangladesh and Egypt revealed their close relationship with their respective contemporary isolates and maintained ancestor relation with A/Quail/HK/G1/1997 confirming that all studied H9N2 belonged to G1 sub-lineage. All six internal gene segments of the Bangladeshi AIV H9N2 showed high sequence homology with the HPAIV subtype H7N3 from Pakistan. In addition, also the PB1 internal gene showed high nucleotide homologies with a recently circulating HPAI-H5N1 virus from Bangladesh. Thus, the Bangladeshi AIV H9N2 is genetically a unique strain which shares internal gene segments with different HPAI viruses and takes part in reassortment events. On the other hand, the internal gene segments of the Egyptian H9N2 viruses were similar to the other members of the G1 sub-lineage with no evidence of reassortment events. In this virus rather point mutations within their respective gene segments are observed. With regard to the biological characterization, the three G1-H9N2 viruses produced comparatively higher titer than the Eurasian wild type-AIV H9N2. Overall, the ECE-grown viruses yielded higher titers than cell culture-grown viruses. Following a single passage in cell culture, individual nucleotide substitutions were noticed in HA, NA and NS gene sequences but none of them are related to the conserved region that can alter virus pathogenesis or virulence. All of the studied H9N2 viruses were sensitive to amantadine. Conclusion The present study demonstrated for the first time the presence of HPAI H5N1 in the wild migratory bird population in Bangladesh and determine as one of the major cause to introduce the new clade of HPAIV H5N1 into the Bangladeshi poultry flocks. The Bangladeshi AIV H9N2 strain has exhibited two independent reassortment events with HPAIV of subtype H7N3 and H5N1.The Egyptian AIV H9N2 strains were limited to regular point mutations which is very common for AIVs. The G1-H9N2 viruses showed a higher replication profile when compared to European wild bird-AIV H9N2. Both the ECE and MDCK cell system allowed efficient replication but the ECE system is considered as the better cultivation system for H9N2 viruses in order to get maximum amounts of virus within a short time period. In this study new strains of AIV H9N2 and H5N1 with significant genetic constitutions were described. Thus, continuous monitoring of the field samples, rapid reporting soon after outbreaks, molecular characterization to confirm the emergence of new reassortant strains and the biological properties to know its impact on the virulence are recommended. / Rokshana Parvin Molekulare Epidemiologie und biologische Charakterisierung von aviären Influenzaviren der Subtypen H5N1 und H9N2 Institut für Virologie Eingereicht im November 2014 Seiten 106, Abbildungen 7, Tabelle 1, Literaturangaben 339 , Publikationen 4 Schlüsselwörter: Aviäres Influenza Virus, H5N1, H9N2, Reassortment, Mutation, Replikation und Wachstumskinetik Einleitung Weltweit kommt es in der Geflügelproduktion durch Infektionen mit aviären Influenzaviren (AIV) zu hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten und damit verbunden zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Zu den bedeutenden AIV in der Geflügelwirtschaft werden die hoch pathogenen aviären Influenzaviren (HPAIV) des Subtyps H5N1 sowie AIV des Subtyps H9N2 gezählt. Letztere besitzen die Charakteristika von niedrigpathogenen aviären Influenzaviren. Durch diese Subtypen kommt es regelmäßig in vielen Ländern in Asien, im Nahen Osten und Europa zu wiederholten Krankheitsgeschehen. Dies bedingt die dringende Notwendigkeit von andauerndem Monitoring, Überwachung und Charakterisierung der zirkulierenden Viren. Ziele der Untersuchungen Die vorliegende Studie soll folgende drei Hauptfragestellungen beantworten: i) Molekulare Epidemiologie des HPAIV H5N1 bei Zugvögeln in Bangladesch, ii) Molekulare Charakterisierung von AIV des Subtyps H9N2 und iii) Biologische Eigenschaften von AIV des Subtyps H9N2. Materialien und Methoden Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit zwei HPAIV Stämmen des Subtyps H5N1, welche im Monitoring Programm in Bangladesch von insgesamt 205 gepolten Kotproben, isoliert wurden. Die Charakterisierung der beiden Isolate erfolgte durch Vervielfältigung der acht Genomsegmente und nachfolgende phylogenetische Analysen. Der zweite Teil der Arbeit beschreibt die retrospektive Analyse eines AIV des Subtyps H9N2, welches von einer Geflügelproduktionsanlage in Bangladesch eingesandt wurde. Weiterhin wurden aus einer Geflügelmast- und Legehennenhaltung mit respiratorischer Symptomatik drei AIV des Subtyps H9N2 isoliert und charakterisiert. Auch hier wurde das gesamte Genom amplifiziert, kloniert und nachfolgend phylogenetisch analysiert. Im letzten Teil der Studie wurden vier europäische AIV H9N2 Isolate, von welchen 3 Isolate zur H9N2 Sublinie G1 gehören und ein Isolat von einem Wildvogel selektiert und in embryonierten Hühnereiern (EHE) und auf Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen passagiert. Mittels 50% tissue culture infectious dose (TCID50), Hämagglutinationstest (HA) und RT-real-time-PCR (qRT-PCR) wurden von diesen so passagierten Viren die Vermehrungskinetik bestimmt. Die Morphologie der infizierten Zellen nach Infektion wurde mittels Immunfluoreszenztest analysiert. Eine Bestimmung der Amantadin Empfindlichkeit dieser Viren erfolgte mit einem ELISA. Ergebnisse Die beiden neuen HPAIV des Subtyps H5N1 von Zugvögeln können in die Clade 2.3.2.1 eingeordnet werden und clustern mit kürzlich aus Enten, Hühnern, Wachteln und Krähen isolierten AIV aus Bangladesch. Eine Verwandtschaft der Viren konnte auch auf Ebene der Aminosäure Sequenz gezeigt werden, obwohl einige einzigartige Aminosäure Austausche nachgewiesen wurden. Diese Austausche zeigen keine Verbindung mit bekannten konservierten Regionen der molekularen Determinanten der Viren. Die phylogenetische Analyse der AIV aus Bangladesch und Ägypten zeigt eine deutliche Verbindung mit den derzeit zirkulierenden AIV auf diesem geographischen Gebiet sowie die Verwandtschaft zu dem Isolat A/Quail/HK/G1/1997. Dies bestätigt, dass die in dieser Studie analysierten AIV zu der Subline G1 gehören. Alle sechs internen Gensegmente des AIV H9N2 aus Bangladesch zeigen eine hohe Sequenz Homologie mit einem HPAIV des Subtyps H7N3 aus Pakistan. Zusätzlich zeigt das interne Gene PB1 eine hohe Homologie auf Nukleinsäureebene zu einem derzeit in Bangladesch zirkulierenden HPAIV des Subtyps H5N1. Somit ist das AIV H9N2 aus Bangladesch als ein einzigartiges Isolat anzusehen, welches durch Reassortierung interne Gensegmente mit hochpathogenen AIV teilt. Im Gegensatz dazu, sind die internen Gene des AIV H9N2 aus Ägypten sehr ähnlich zu anderen Mitgliedern der Sublinie G1, welche keine Hinweise auf Reassorierung zeigen. Nur einzelne Punktmutationen konnten in den entsprechenden Gensegmenten nachgewiesen werden. In Hinblick auf die biologische Charakterisierung, konnte in den drei AIV H9N2 der Sublinie G1 vergleichsweise höhere Titer nachgewiesen werden als in einem europäischen AIV H9N2 Wildtypisolat. Insgesamt zeigten die in EHE passagierten Viren höhere Titer als die MDCK-Zell passagierten Viren. Schon nach einer Passage auf Zellkultur konnten einzelne Nukleotidaustausche in den HA, NA und NS kodierenden Gensegmenten nachgewiesen werden, wobei keine dieser Veränderungen einen Einfluss auf konservierte Regionen haben, die die Pathogenese oder Virulenz der Viren beeinflussen. Alle untersuchten H9N2 Viren sind sensitiv gegenüber Amantadin. Schlussfolgerungen Die vorliegende Studie zeigt erstmalig das Vorkommen von HPAIV H5N1 bei Zugvögeln in Bangladesch, welches als Haupteintragsquelle der neuen HPAIV H5N1 in der dortigen Geflügelhaltung angesehen wird. Das AIV H9N2 aus Bangladesch zeigt zwei unabhängige Reassortierungen mit HPAIV des Subtyps H7N3 und H5N1. Hingegen zeigt das ägyptische AIV H9N2 Punktmutationen, welche sehr typisch für diese Viren sind. Die hier untersuchten AIV H9N2 der Sublinie G1 zeigen im Vergleich zu einem europäischen AIV H9N2 eine höhere Replikationsrate. Eine Replikation der Viren konnte in EHE und MDCK-Zellen gezeigt werden, jedoch wird das EHE als das geeignetere System für die Kultivierung von H9N2 Viren betrachtet, da hier in einer kürzeren Zeitspanne mehr Virus produziert werden kann. Des Weiteren konnten in dieser Studie neue Isolate von AIV des Subtyps H9N2 und H5N1mit einem bedeutenden genetischen Aufbau beschrieben werden. Daher wird ein kontinuierliches Monitoring von Feldproben, unverzügliche Meldung von Ausbruchsgeschehen, die molekulare Charakterisierung zur Dokumentation eventuell auftretender neuer Reassortanten sowie Untersuchungen der biologischer Eigenschaften zur Virulenzbestimmung empfohlen.

The H9N2 subtype of avian influenza A virus (aIAV) is circulating among birds worldwide, leading to severe economic losses. H9N2 cocirculation with other highly pathogenic aIAVs has the potential to contribute to the rise of new strains with pandemic potential. Therefore, rapid detection of H9 aIAVs infection is crucial to control virus spread. A qualitative reverse transcription recombinase polymerase amplification (RT-RPA) assay for the detection of aIAV subtype H9N2 was developed. All results were compared to the gold standard (real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)). The RT-RPA assay was designed to detect the hemagglutinin (HA) gene of H9N2 by testing three pairs of primers and a probe. A serial concentration between 106 and 100 EID50 (50% embryo infective dose)/mL was applied to calculate the analytical sensitivity. The H9 RT-RPA assay was highly sensitive as the lowest concentration point of a standard range at one EID50/mL was detected after 5 to 8 min. The H9N2 RT-RPA assay was highly specific as nucleic acid extracted from H9 negative samples and from other avian pathogens were not cross detected. The diagnostic sensitivity when testing clinical samples was 100% for RT-RPA and RT-PCR. In conclusion, H9N2 RT-RPA is a rapid sensitive and specific assay that easily operable in a portable device for field diagnosis of aIAV H9N2.

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The H9N2 avian influenza virus (AIV) has emerged, spread and established itself in poultry globally, in just under 30 years. During this time, multiple reassortants of H9N2 with increased zoonotic potential have been isolated in poultry and humans, causing a major threat to the economy and global health. Curiously, H9N2 appears to be compatible with multiple Hemagglutinin (HA) and Neuraminidase subtypes, in nature. Here, the aim was to investigate the HA reassortment dynamics of the poultry adapted H9N2 AIV, in a laboratory setting. Firstly, HA subtypes from wild bird isolates were cloned, before being co-transfected with the backbone of a chicken H9N2 AIV. The rescued H9N2 reassortants were titred on cells before the replication kinetics of a subset of the HA reassortants was assessed. The cDNA sequence of seven HA subtypes induced extensive recombination in E. coli, but ultimately ten out of eleven available HA subtypes were successfully cloned. Further, the chicken H9N2 AIV was compatible with all ten HA subtypes, producing infectious viral particles after co-transfection. However, all HA reassortants displayed decreased replicative fitness in MDCK-2 cells, compared to the wild-type virus. Interestingly, HA subtypes with similar genotypes cluster into distinct HA clades and groups, but these HA clades did not correlate with the replicative fitness of the reassortants. This study suggests that poultry adapted H9N2 AIV is compatible with many HA subtypes, highlighting the importance of reducing its spread in poultry, to reduce reassortment opportunities.