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Production of human growth hormone antagonist (hGHG120R) in Chinese hamster ovary cellsHaldankar, Raj January 1997 (has links)
No description available.
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Studies on Genomic Sequences For the Heat Shock Proteins hsp60 and hsp10 From Chinese Hamster Ovary CellsZurawinski, Joni 12 1900 (has links)
Although the eDNA sequences for the 10 k:Da (hsp 10, hsp 1 0) and the 60 k:Da (hsp60,
cpn60) heat shock proteins have been obtained for a number of mammalian species, until very
recently information was not available on the functional genes encoding these proteins. The
primary objective of this work was to clone and sequence the functional genes for these
proteins from CHO, Chinese hamster ovary cells. Screening of a lambda EMBL3 CHO
genomic library with the CHO hsp 10 eDNA identified a clone containing the putative hsp 10
functional gene. A -5.5 kb fragment was isolated from one of these clones by enzymatic
digestion and -3.3 kb was sequenced. The clone was found to contain consensus regulatory
sequences upstream of the putative transcription initiation site, + 1, including two Sp 1 binding
sites, a CAAT box, and a single heat shock element, HSE, but lacked a TATA box. The
coding region consists of four exons, identical to the hsp10 CHO eDNA sequence, separated
by three introns, of 200 bp, 600 bp and 1600 bp in size, containing conserved splice sites.
Screening of the same EMBL3 CHO genomic library with the CHO hsp 10 eDNA also
resulted in isolation of a full length processed pseudogene with -90 % identity to the eDNA.
This pseudogene lacked introns, contained a poly(A) tract, as well as various single bp
changes, additions and deletions. The upstream region of this pseudo gene was found to
contain similarity to the human LINE sequence, a DNA repetitive element. PCR amplification
ofCHO-WT genomic DNA resulted in isolation offive additional processed pseudogenes,
corresponding to the central -270 bp of the CHO hsplO eDNA. All the pseudogenes
displayed a high degree of similarity to the CHO hsp 10 eDNA sequence despite the presence
of numerous mutations. Prior to this report, pseudogenes had not been found associated with
hsp 10. The identification of these pseudogenes suggests the presence of a multi gene family
for this heat shock protein in the CHO genome.
Previously, a semi-processed pseudogene, Gel, was identified for hsp60 from CHO
cells which contained a single -87 bp intron near its 3' end (Venner eta/., 1990). From this
pseudo gene, a fragment containing the -87 bp intron was isolated for use as a probe to screen
a lambda EMBL3 CHO genomic library. This resulted in isolation of several positive clones,
two of which were purified, a -1.0 kb fragment amplified by PCR and then sequenced
revealing two additional semi-processed pseudogenes, designated .A4 and .AS. These
pseudo genes were found to be homologous to the GC 1 clone, containing many similar
mutations as well as the -87 bp intron. Utilizing CHO-WT genomic DNA, a separate PCR
amplification resulted in isolation of a -2.5 kb fragment which was partially sequenced and
found to correspond to the putative hsp60 functional gene. The fragment contained one
exon, which was identical to the CHO hsp60 eDNA in the region sequenced, and two introns
of800 bp and 1500 bp. This fragment can now provide an ideal probe for isolation ofthe
CHO hsp60 functional gene. / Thesis / Master of Science (MSc)
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Photoperiodic and diurnal regulation of WNT signalling in the arcuate nucleus of the 1 female Djungarian hamster, Phodopus sungorusBoucsein, A., Benzler, J., Hempp, C., Stöhr, S., Helfer, Gisela, Tups, A. 08 December 2015 (has links)
Yes / The WNT pathway was shown to play an important role in the adult central nervous system. We previously identified the WNT pathway as a novel integration site of the adipokine leptin in mediating its neuroendocrine control of metabolism in obese mice. Here we investigated the implication of WNT signaling in seasonal body weight regulation exhibited by the Djungarian hamster (Phodopus sungorus), a seasonal mammal that exhibits profound annual changes in leptin sensitivity. We furthermore investigated whether crucial components of the WNT pathway are regulated in a diurnal manner. Gene expression of key components of the WNT pathway in the hypothalamus of hamsters acclimated to either long day (LD) or short day (SD) photoperiod was analyzed by in situ hybridization. We detected elevated expression of the genes WNT-4, Axin-2, Cyclin-D1, and SFRP-2, in the hypothalamic arcuate nucleus, a key energy balance integration site, during LD compared with SD as well as a diurnal regulation of Axin-2, Cyclin-D1, and DKK-3. Investigating the effect of photoperiod as well as leptin on the activation (phosphorylation) of the WNT coreceptor LRP-6-(Ser1490) by immunohistochemistry, we found elevated activity in the arcuate nucleus during LD relative to SD as well as after leptin treatment (2 mg/kg body weight). These findings indicate that differential WNT signaling may be associated with seasonal body weight regulation and is partially regulated in a diurnal manner in the adult brain. Furthermore, they suggest that this pathway plays a key role in the neuroendocrine regulation of body weight and integration of the leptin signal.
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Postnatale Entwicklung der striatalen GABAergen Interneurone im dtsz Hamster als Dystoniemodell: Untersuchungen des Homöodomänproteins Nkx 2.1, des Kalium-Chlorid-Kotransporters KCC2, der Carboanhydrase CAH7 und des Wachstumsfaktors BDNFBode, Christoph 30 May 2017 (has links) (PDF)
Einleitung:
Bei der Dystonie handelt es sich um eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Sie ist charakterisiert durch ungewollte, dauerhafte oder wiederkehrende Muskelkontraktionen, die zu abnormalen Bewegungsabläufen und Haltungen führen. Sie ist die dritthäufigste Bewe-gungsstörung beim Menschen. Bisherige Befunde beim Menschen und Untersuchungen an Tier-modellen weisen u.a. auf eine besondere Bedeutung der Basalganglien-Thalamus-Schleife hin, die an der Kontrolle von willkürlichen und unwillkürlichen Bewegungen beteiligt ist. So konnten bei unterschiedlichen Tiermodellen Veränderungen im Striatum (STR), der Eingangsstruktur der Basalganglien, nachgewiesen werden. Beim dtsz Hamster, einem gut etablierten Tiermodell für die paroxysmale Dystonie, konnte neben vielen striatalen Veränderungen eine Reduktion der GABAergen Interneurone (IN), wie Parvalbumin-positive (PV+) IN, zum Zeitpunkt der maximalen Ausprägung der Dystonie gezeigt werden.
Ziele der Untersuchung:
Die Gründe für den Mangel an striatalen GABAergen IN bei der dtsz Hamstermutante sollten weiter untersucht werden, indem der Frage nachzugehen war, ob beim dtsz Hamster eine Migrations- oder Ausreifungsstörung der IN vorliegt. Dazu wurde das Homöodomänprotein Nkx 2.1, als Marker für aus dem medialen Ganglienhügel eingewanderte IN, im STR der dtsz Hamstermutante untersucht. Die Expression des Brain-derived neurotrophic factors (BDNF), des Kalium-Chlorid-Kotransporters 2 (KCC2) und die zytosolische Carboanhydrase vom Isotyp 7 (CAH7) wurden als Indikatoren für die Ausreifung von GABAergen IN herangezogen.
Tiere, Material und Methoden:
Die Untersuchungen wurden vergleichend an dtsz Hamstern und Kontrollhamstern durchgeführt. Beim dtsz Hamster zeigt die Dystonie einen altersabhängigen Verlauf (Beginn: ca. 16. Lebenstag (LT); Maximum: 30.-42. LT; Remission: 70. LT). Deshalb wurden als Untersuchungszeitpunkte der 18. LT und der 33. LT gewählt. Um die Migration der striatalen IN zu untersuchen, wurde im STR bei 33 Tage alten Hamsterns die Dichte der immun-histochemisch markierten Nkx 2.1-positiven Zellen stereologisch ermittelt. Der mRNA-Gehalt wurde relativ mittels „quantitativer Echtzeit-PCR“ (qPCR) bestimmt. Zusätzlich wurde die mRNA-Expression von Nkx 2.1 bei 18 Tage alten Tieren untersucht. Von KCC2 und CAH7 wurde die mRNA mittels qPCR bei 18 und 33 Tage alten Hamstern im STR untersucht. Die Expression von BDNF wurde mittels ELISA-System im Kortex (Cx), STR und im restlichen Gehirngewebe („R“) bei 33 und 18 Tage alten Tieren bestimmt. Der BDNF-mRNA Gehalt wurde im Cx (18. und 33. LT) und im STR (33. LT) untersucht. Des Weiteren sollte BDNF bei 33 Tage alten Hamstern mittels immunhistochemischer Markierung im Cx und STR untersucht werden. Die Untersuchung von BDNF im Cx ist deshalb wichtig, weil BDNF vom Cx in das STR trans-portiert wird. Zusätzlich wurde Parvalbumin (PV) zusammen mit Nkx 2.1 immunhistochemisch markiert und die mRNA-Expression von PV bei 18 und 33 Tage alten Tieren bestimmt.
Ergebnisse:
Für Nkx 2.1 konnte kein Unterschied in der Zelldichte zwischen dtsz- und Kontroll-hamstern gefunden werden. Ebenfalls gab es weder bei 18 noch bei 33 Tage alten Tieren einen Unterschied in der Nkx 2.1-mRNA-Expression. Unterschiede in der mRNA-Expression von KCC2 und CAH7 im STR (18. und 33. LT) lagen auch nicht vor. Die Expression der PV-mRNA im STR bei 33 Tage alten Tieren war jedoch erwartungsgemäß vermindert. Auf mRNA-Ebene konnte im Cx für BDNF kein Unterschied zwischen dtsz- und Kontrolltiergruppe gefunden wer-den. Bei beiden Tiergruppen wurde mittels ELISA im STR mehr BDNF nachgewiesen als im Cx und im R (18. und 33. LT) nachweisbar. Entgegen der Hypothese war nach Analyse der Daten mittels Zwei-Wege ANOVA eine geringe Erhöhung der BDNF-Expression im Cx und STR bei 33 Tage alten dtsz Hamstern nachweisbar. Dies lag daran, dass die BDNF-Expression nur bei den Kontrolltieren am 33. LT im Vergleich zum 18. LT herunterreguliert war. Die Ergebnisse der BDNF-Immunhistologie waren in Hinblick auf die Spezifität zweifelhaft.
Schlussfolgerung:
Die Nkx 2.1 Daten lassen auf eine ungestörte Migration striataler IN bei der dtsz Mutante schließen. Wahrscheinlich ist eine Ausreifungsstörung für den Mangel an GABAer-gen IN verantwortlich. Die Ergebnisse von KCC2 und CAH7 zeigen, dass keine generelle Ausreifungsstörung von GABAergen Neuronen vorliegt, wobei dies für kleinere Subpopulationen nicht ausgeschlossen werden kann. Entgegen der Arbeitshypothese konnte keine Verringerung sondern eine leichte Erhöhung von BDNF zum 33. LT bei der dtsz Hamstermutante festgestellt werden. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass BDNF auf Grund der verzögert einsetzenden Entwicklung der IN nicht herunterreguliert wird. Die Gründe für diese Erhöhung wie auch weitere Marker für die neuronale Ausreifung werden durch weiterführende Studien untersucht.
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Regulation von Connexinen als Gap-Junction-Strukturprotein in der sequenziellen Karzinogenese des DMBA-induzierten Wangentaschenkarzinoms des Hamsters / Regulation of connexins as structure proteins of gap junctions in the sequential carcinogenesis of the DMBA-induced cheek pouch carcinoma of hamstersHillebrand, Rebekka Simone 07 August 2013 (has links)
Da vorliegende Studien unserer Arbeitsgruppe auf eine Beteiligung von Connexinen an der oralen Plattenepithelkarzinogenese hindeuten, war es Ziel dieser Arbeit in-vivo am Hamstermodell die Expression der Connexine 26, 43 und 45 im Verlauf der Karzinogenese zu untersuchen.
Die durch 9,10-Dimethyl-1,2-Benzanthrazen (DMBA) induzierten Karzinome wurden makroskopisch, histologisch, sowie auf ihren Inflammationsgrad hin untersucht, um die Effektivität des Tiermodells zu prüfen. Weiterhin erfolgte sie Genexpressionsanalyse mittels RNA-Isolation, PCR-Analyse und statistischer Auswertung.
Es konnte insgesamt gezeigt werden, dass die Applikation von DMBA in Abhängigkeit von Behandlungsdauer makroskopisch, histologisch und inflammatorisch einen deutlichen karzinogenen Effekt hatte und, dass das histopathologische Grading signifikant mit der Länge der Behandlungsdauer korrelierte. Im Rahmen der Genexpressionsanalyse konnte im Verlauf der DMBA-Behandlung für Connexin 26 und 45 eine signifikante Überexpression beschrieben werden. Connexin 43 zeigte sich als nicht differentiell exprimiert. Ein Zusammenhang zwischen histologischem Grading und Genexpression war nicht nachvollziehbar.
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Plasticité intermodale chez le hamster énucléé à la naissance : Études de la distribution des interneurones CaBPir dans les cortex visuel et auditif primaires.Desgent, Sébastien 01 1900 (has links)
La période postnatale et l’expérience sensorielle sont critiques pour le développement du système visuel. Les interneurones inhibiteurs exprimant l’acide γ-aminobutyrique (GABA) jouent un rôle important dans le contrôle de l’activité neuronale, le raffinement et le traitement de l’information sensorielle qui parvient au cortex cérébral. Durant le développement, lorsque le cortex cérébral est très susceptible aux influences extrinsèques, le GABA agit dans la formation des périodes critiques de sensibilité ainsi que dans la plasticité dépendante de l’expérience. Ainsi, ce système inhibiteur servirait à ajuster le fonctionnement des aires sensorielles primaires selon les conditions spécifiques d’activité en provenance du milieu, des afférences corticales (thalamiques et autres) et de l’expérience sensorielle. Certaines études montrent que des différences dans la densité et la distribution de ces neurones inhibiteurs corticaux reflètent les caractéristiques fonctionnelles distinctes entre les différentes aires corticales.
La Parvalbumine (PV), la Calretinine (CR) et la Calbindine (CB) sont des protéines chélatrices du calcium (calcium binding proteins ou CaBPs) localisées dans différentes sous-populations d’interneurones GABAergiques corticaux. Ces protéines tamponnent le calcium intracellulaire de sorte qu’elles peuvent moduler différemment plusieurs fonctions neuronales, notamment l’aspect temporel des potentiels d’action, la transmission synaptique et la potentialisation à long terme. Plusieurs études récentes montrent que les interneurones immunoréactifs (ir) aux CaBPs sont également très sensibles à l’expérience et à l’activité sensorielle durant le développement et chez l’adulte. Ainsi, ces neurones pourraient avoir un rôle crucial à jouer dans le phénomène de compensation ou de plasticité intermodale entre les cortex sensoriels primaires.
Chez le hamster (Mesocricetus auratus), l’énucléation à la naissance fait en sorte que le cortex visuel primaire peut être recruté par les autres modalités sensorielles, telles que le toucher et l’audition. Suite à cette privation oculaire, il y a établissement de projections ectopiques permanentes entre les collicules inférieurs (CI) et le corps genouillé latéral (CGL). Ceci a pour effet d’acheminer l’information auditive vers le cortex visuel primaire (V1) durant le développement postnatal. À l’aide de ce modèle, l’objectif général de ce projet de thèse est d’étudier l’influence et le rôle de l’activité sensorielle sur la distribution et l’organisation des interneurones corticaux immunoréactifs aux CaBPs dans les aires sensorielles visuelle et auditive primaires du hamster adulte. Les changements dans l’expression des CaBPs ont été déterminés d’une manière quantitative en évaluant les profils de distribution laminaire de ces neurones révélés par immunohistochimie.
Dans une première expérience, nous avons étudié la distribution laminaire des CaBPs dans les aires visuelle (V1) et auditive (A1) primaires chez le hamster normal adulte. Les neurones immunoréactifs à la PV et la CB, mais non à la CR, sont distribués différemment dans ces deux cortex primaires dédiés à une modalité sensorielle différente. Dans une deuxième étude, une comparaison a été effectuée entre des animaux contrôles et des hamsters énucléés à la naissance. Cette étude montre que le cortex visuel primaire de ces animaux adopte une chimioarchitecture en PV similaire à celle du cortex auditif.
Nos recherches montrent donc qu’une suppression de l’activité visuelle à la naissance peut influencer l’expression des CaBPs dans l’aire V1 du hamster adulte. Ceci suggère également que le type d’activité des afférences en provenance d’autres modalités sensorielles peut moduler, en partie, une circuiterie corticale en CaBPs qui lui est propre dans le cortex hôte ou recruté. Ainsi, nos travaux appuient l’hypothèse selon laquelle il serait possible que certaines de ces sous-populations d’interneurones GABAergiques jouent un rôle crucial dans le phénomène de la plasticité intermodale. / The postnatal period and sensory experience are critical for the development of the visual system. The inhibitory interneurons expressing the γ-aminobutyric acid (GABA) play an important role in the control of neural activity, refinement and treatment of sensory information which reaches the cerebral cortex. During development, when the cerebral cortex is very likely to be influenced by extrinsic factors, GABA acts in the formation of critical period of receptivity as well as in experience dependent plasticity. Thus, this inhibitory system adjusts the functioning of the primary sensory areas according to the specific conditions of activity from the environment, cortical afferents (e.g. of thalamic origin), and sensory experience. Several studies show that differences in the distribution and density of these inhibitory interneurons tend to reflect functional discrepancies between the different neocortical areas.
Parvalbumin (PV), Calretinin (CR) and Calbindin (CB) are calcium-binding proteins (CaBPs) found in different sub-populations of GABAergic cortical interneurons. These proteins buffer intracellular calcium levels, which can in turn modulate several neural functions, notably the temporal aspect of action potentials, synaptic transmission and long-term potentiation. Several recent studies are showing that CaBPs immunoreactive (ir) interneurons are also very sensitive to experience and sensory activity during development and adulthood. Therefore, these neurons may have a critical role in intermodal plasticity or compensatory processes between primary sensory cortices.
In the hamster (Mesocricetus auratus), after enucleation at birth, the primary visual cortex can be recruited by other sensory modalities such as touch and audition. After this type of visual deprivation, there is establishment of permanent ectopic projections between the inferior colliculus (IC) and the lateral geniculate nucleus (LGN). This phenomenon leads to the rerouting of auditory information to the primary visual cortex (V1) during postnatal development. By using this animal model, the general objective of this thesis is to study the influence and the role of sensory activity on the distribution and organization of cortical interneurons that display immunoreactivity for CaBPs in the primary visual and auditory sensory areas in adult hamsters. Changes in the expression of CaBPs were quantitatively determined by assessing the laminar distribution profiles of cell bodies revealed by immunohistochemistry.
In the first experiment, we studied laminar distribution of CaBPs in the primary visual (V1) and auditory (A1) cortices of normal hamsters. PVir and CBir, but not CRir neurons, are distributed in a dissimilar fashion between the two primary cortices devoted to each sensory modality. In the second study, a comparison was performed between control animals and hamsters which were enucleated at birth. The results of this study show that the primary visual cortex of these animals adopts a PVir chemoarchitecture similar to that of the auditory cortex.
Our research shows that the abolition of visual activity at birth can influence the expression of CaBPs in V1 of the adult hamster. The present results also suggest that the type of activity in afferents from other sensory modalities can at least in part modulate the cortical circuitry of CaBPs in the host or recruited cortex. Thus, our work supports the hypothesis that sub-populations of GABAergic interneurons may play a critical role in the intermodal cortical plasticity.
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Plasticité intermodale chez le hamster énucléé à la naissance : Études de la distribution des interneurones CaBPir dans les cortex visuel et auditif primairesDesgent, Sébastien 01 1900 (has links)
No description available.
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Studies On Molecular Analysis Of Capacitation Associated Protein Tyrosine Phosphorylation In Hamster SpermatozoaDasari, Santosh Kumar 07 1900 (has links) (PDF)
In mammals, freshly ejaculated spermatozoa do not possess the ability to fertilize a mature oocyte. They acquire fertilization competence upon residing for a period of time in the female reproductive tract. The physiological changes that bring about these time-dependent changes in motility pattern and acquisition of fertilizing ability of spermatozoa are collectively referred to as capacitation, culminating in sperm hyperactivation. Capacitation-associated increase in sperm protein tyrosine phosphorylation (PYP), exhibited by mammalian sperm, is one of the major downstream events, regulating hyperactivated motility. However, it is still unclear which are the tyrosine kinases and phosphatases involved in modulating the capacitation-associated increase in global PYP. In order to determine this, our laboratory earlier showed the role of PYP in hamster sperm capacitation using a specific EGFR protein tyrosine kinase (PTK) inhibitor, tyrphostin A47 (TP-47). Interestingly, inhibition of capacitation by 0.5 mM TP-47 was associated with induction of a slow circular motility pattern, accompanied by inhibition of PYP of certain proteins (Mr. 45,000-52,000), localized to the principle piece of the sperm flagellum. Two such proteins, hypo-tyrosine phosphorylated, were found to be tektin-2 and ODF-2, using 2D-PAGE followed by MS/MS analysis. Interestingly, a global phosphoproteome analysis of human spermatozoa showed that PYP changes are associated with capacitation and asthenospermic condition in infertile men is attributed to the failure of capacitation-associated increase in PYP. Such individuals exhibited impaired sperm motility. There is a need to understand the exact mechanism of phosphorylation of sperm flagellar proteins, which is necessary to assess sperm’s ability to fertilize the mature oocyte. Therefore, the focus of the present work was to elucidate the role of receptor tyrosine kinases (RTKs) and the non-receptor tyrosine kinases (NRTKs) in mammalian (hamster) sperm capacitation. Recent studies have shown that apart from EGFR other RTKs like IGF1R, FGFR, VEGFR, MuSK, TrkA are expressed in mammalian spermatozoa and actively involved in sperm capacitation. However, there is very little information available in the context of sperm capacitation and associated PYP. Therefore, attempts were made to understand the role of various RTKs (IGF1R, FGFR and VEGFR) in hamster sperm capacitation and associated PYP. Initially, the role of IGF1R tyrosine kinase during sperm capacitation was studied. Immunolocalization of IGF1R in spermatozoa showed a strong signal in the sperm acrosome and the principal piece of the sperm flagellum. Inhibition of IGF1R kinase with an IGF1R-specific inhibitor TP-1-O-Me-AG538 (TP-538) showed inhibitory effect on sperm capacitation and the associated hyperactivation. But, inhibitors of FGFR and VEGFR tyrosine kinases did not show such an effect. Interestingly, inhibition of IGF1R by TP538 was associated with inhibition of PYP of certain proteins (Mr. 45,000-120,000), localized to head, mid piece and principle piece regions of the sperm flagellum. Phosphoproteomic analysis using 2D-PAGE-western blot with anti-phosphotyrosine antibodies identified 17 differentially phosphorylated protein spots. Out of the 17 spots, 12 were identified by MALDI-MS/MS analysis. The proteins identified to be differentially phosphorylated, upon inhibition of IGF1R, were PDHE1, ODF-2, Tubulin β 2C chain, PDHE2 and ATP synthase β subunit.
The RTKs being present in the membrane level may not be directly involved in the phopshorylation of downstream target proteins associated with the mitochondrial membrane, sperm axonemal structures and outer dense fibers. Therefore, the RTKs may interact directly or indirectly with the downstream NRTKs, which may be involved in the phosphorylation of target sperm proteins. Till date, six different families of NRTKs are shown to be expressed in mammalian spermatozoa. The major family of NRTKs involved in sperm function is the Src family of kinases. However, there is very little information available in the context of sperm capacitation and the associated PYP. Therefore, studies were carried out to understand the role of Src family of NRTKs in sperm capacitation and associated PYP. Presence of active Src signaling was observed by the immunolocalization of activated Src (pY416) in the acrosome, mid piece and the principal piece regions of the sperm flagellum. Inhibition of Src family of kinase with a specific Src family kinase inhibitor PP2, showed inhibition of sperm capacitation and the associated hyperactivation. Inhibition of Src family of kinases with PP2 was associated with decrease in PYP of several proteins (Mr. 45,000-120,000), localized mainly to the mid piece region, followed by the principle piece region of the sperm flagellum. Phosphoproteomic analysis using 2D-PAGE-western blot with anti-phosphotyrosine antibodies identified 38 differentially phosphorylated protein spots. Out of the 38 spots, 16 were identified by MALDIMS/MS analysis and these corresponded to seven proteins which included PDHE1, ODF-2, Tubulin β 2C chain, Tektin-2, GAPDS, PDHE2 and ATP synthase β subunit.
Additionally, the biochemical and molecular characteristics of the identified proteins were also studied. Bioinformatic analysis predicted the presence of phosphorylation motifs for several kinases and interestingly, all the proteins identified had a Src kinase motif. Comparing the current observations and the previous work in the laboratory, two proteins ODF-2 and Tektin-2 were found to be regulated by EGFR, IGF1R and Src family of kinases. Therefore, characterization of the capacitation-associated tyrosine phoposphorylated proteins ODF-2 and Tektin-2 was performed. By employing PCR and Northern blotting techniques, the presence of the transcripts of both the proteins was shown. Additionally, the ontogeny of expression of ODF2 and Tektin-2 in hamster testis development was studied and the results indicated that the expression of both the proteins started from week 3 onwards till week 8. To confirm the meiotic stage-associated expression of ODF-2 and Tektin-2, germ cells were sorted based on their DNA content. ODF-2 and Tektin-2 transcripts were first expressed in the meiotic germ cells (pachytene spermatocytes) and their expression was upregulated in the post-meiotic germ cells (round spermatids). Sequential extraction of sperm proteins showed that, Tektin-2 was majorly extracted out in the Triton X-100 and DTT fraction, whereas, ODF-2 was maximally extracted in the presence of urea and DTT.
In conclusion, these observations indicate that IGF1R and Src family of tyrosine kinases are critical for mammalian sperm capacitation and associated global PYP. Inhibition of sperm capacitation was associated with hypo-tyrosine-phospohorylation of certain proteins associated with mitochondrial membrane, axonemal structures and outer dense fibers of the sperm flagellum. Future work can be directed towards understanding the role of other RTKs and NRTKs involved in sperm capacitation and the molecular characterization of hypophosphorylated proteins critical for sperm function and its fertilization competence.
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Postnatale Entwicklung der striatalen GABAergen Interneurone im dtsz Hamster als Dystoniemodell: Untersuchungen des Homöodomänproteins Nkx 2.1, des Kalium-Chlorid-Kotransporters KCC2, der Carboanhydrase CAH7 und des Wachstumsfaktors BDNFBode, Christoph 09 May 2017 (has links)
Einleitung:
Bei der Dystonie handelt es sich um eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Sie ist charakterisiert durch ungewollte, dauerhafte oder wiederkehrende Muskelkontraktionen, die zu abnormalen Bewegungsabläufen und Haltungen führen. Sie ist die dritthäufigste Bewe-gungsstörung beim Menschen. Bisherige Befunde beim Menschen und Untersuchungen an Tier-modellen weisen u.a. auf eine besondere Bedeutung der Basalganglien-Thalamus-Schleife hin, die an der Kontrolle von willkürlichen und unwillkürlichen Bewegungen beteiligt ist. So konnten bei unterschiedlichen Tiermodellen Veränderungen im Striatum (STR), der Eingangsstruktur der Basalganglien, nachgewiesen werden. Beim dtsz Hamster, einem gut etablierten Tiermodell für die paroxysmale Dystonie, konnte neben vielen striatalen Veränderungen eine Reduktion der GABAergen Interneurone (IN), wie Parvalbumin-positive (PV+) IN, zum Zeitpunkt der maximalen Ausprägung der Dystonie gezeigt werden.
Ziele der Untersuchung:
Die Gründe für den Mangel an striatalen GABAergen IN bei der dtsz Hamstermutante sollten weiter untersucht werden, indem der Frage nachzugehen war, ob beim dtsz Hamster eine Migrations- oder Ausreifungsstörung der IN vorliegt. Dazu wurde das Homöodomänprotein Nkx 2.1, als Marker für aus dem medialen Ganglienhügel eingewanderte IN, im STR der dtsz Hamstermutante untersucht. Die Expression des Brain-derived neurotrophic factors (BDNF), des Kalium-Chlorid-Kotransporters 2 (KCC2) und die zytosolische Carboanhydrase vom Isotyp 7 (CAH7) wurden als Indikatoren für die Ausreifung von GABAergen IN herangezogen.
Tiere, Material und Methoden:
Die Untersuchungen wurden vergleichend an dtsz Hamstern und Kontrollhamstern durchgeführt. Beim dtsz Hamster zeigt die Dystonie einen altersabhängigen Verlauf (Beginn: ca. 16. Lebenstag (LT); Maximum: 30.-42. LT; Remission: 70. LT). Deshalb wurden als Untersuchungszeitpunkte der 18. LT und der 33. LT gewählt. Um die Migration der striatalen IN zu untersuchen, wurde im STR bei 33 Tage alten Hamsterns die Dichte der immun-histochemisch markierten Nkx 2.1-positiven Zellen stereologisch ermittelt. Der mRNA-Gehalt wurde relativ mittels „quantitativer Echtzeit-PCR“ (qPCR) bestimmt. Zusätzlich wurde die mRNA-Expression von Nkx 2.1 bei 18 Tage alten Tieren untersucht. Von KCC2 und CAH7 wurde die mRNA mittels qPCR bei 18 und 33 Tage alten Hamstern im STR untersucht. Die Expression von BDNF wurde mittels ELISA-System im Kortex (Cx), STR und im restlichen Gehirngewebe („R“) bei 33 und 18 Tage alten Tieren bestimmt. Der BDNF-mRNA Gehalt wurde im Cx (18. und 33. LT) und im STR (33. LT) untersucht. Des Weiteren sollte BDNF bei 33 Tage alten Hamstern mittels immunhistochemischer Markierung im Cx und STR untersucht werden. Die Untersuchung von BDNF im Cx ist deshalb wichtig, weil BDNF vom Cx in das STR trans-portiert wird. Zusätzlich wurde Parvalbumin (PV) zusammen mit Nkx 2.1 immunhistochemisch markiert und die mRNA-Expression von PV bei 18 und 33 Tage alten Tieren bestimmt.
Ergebnisse:
Für Nkx 2.1 konnte kein Unterschied in der Zelldichte zwischen dtsz- und Kontroll-hamstern gefunden werden. Ebenfalls gab es weder bei 18 noch bei 33 Tage alten Tieren einen Unterschied in der Nkx 2.1-mRNA-Expression. Unterschiede in der mRNA-Expression von KCC2 und CAH7 im STR (18. und 33. LT) lagen auch nicht vor. Die Expression der PV-mRNA im STR bei 33 Tage alten Tieren war jedoch erwartungsgemäß vermindert. Auf mRNA-Ebene konnte im Cx für BDNF kein Unterschied zwischen dtsz- und Kontrolltiergruppe gefunden wer-den. Bei beiden Tiergruppen wurde mittels ELISA im STR mehr BDNF nachgewiesen als im Cx und im R (18. und 33. LT) nachweisbar. Entgegen der Hypothese war nach Analyse der Daten mittels Zwei-Wege ANOVA eine geringe Erhöhung der BDNF-Expression im Cx und STR bei 33 Tage alten dtsz Hamstern nachweisbar. Dies lag daran, dass die BDNF-Expression nur bei den Kontrolltieren am 33. LT im Vergleich zum 18. LT herunterreguliert war. Die Ergebnisse der BDNF-Immunhistologie waren in Hinblick auf die Spezifität zweifelhaft.
Schlussfolgerung:
Die Nkx 2.1 Daten lassen auf eine ungestörte Migration striataler IN bei der dtsz Mutante schließen. Wahrscheinlich ist eine Ausreifungsstörung für den Mangel an GABAer-gen IN verantwortlich. Die Ergebnisse von KCC2 und CAH7 zeigen, dass keine generelle Ausreifungsstörung von GABAergen Neuronen vorliegt, wobei dies für kleinere Subpopulationen nicht ausgeschlossen werden kann. Entgegen der Arbeitshypothese konnte keine Verringerung sondern eine leichte Erhöhung von BDNF zum 33. LT bei der dtsz Hamstermutante festgestellt werden. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass BDNF auf Grund der verzögert einsetzenden Entwicklung der IN nicht herunterreguliert wird. Die Gründe für diese Erhöhung wie auch weitere Marker für die neuronale Ausreifung werden durch weiterführende Studien untersucht.
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Production and glycosylation of a recombinant protein from Chinese hamster ovary (CHO) cellsDe Villiers, Ann-Marie 12 1900 (has links)
Thesis (MScEng)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: Recombinant glycoproteins are important biopharmaceuticals, providing solutions for numerous previously untreatable illnesses, in everything from cancer to infertility. Most recombinant biopharmaceuticals are produced in mammalian cells due to their ability to provide the correct post-translational processing for use in humans. The post-translation processing influences many of the protein’s properties including pharmacokinetics, bioactivity, secretion, half-life, solubility, recognition and antigenicity. The aim of this thesis is to further study the upstream production of a glycosylated recombinant protein produced by Chinese hamster ovary (CHO) cells on production scale within the confines of an existing process.
The process in question uses adherent CHO cells to produce a glycosylated recombinant hormone. As with most recombinant protein production processes, this process has two sections to the upstream production: a seed train to grow enough cells to inoculate production, and a production section, which focuses on the production of a recombinant protein. The seed train is predominantly conducted in roller bottles, while the production section takes place in perfusion bioreactors, where the cells are attached to microcarriers, with spin-filters for cell retention. The whole process uses medium with serum.
There are two process challenges regarding an existing recombinant-protein production process:
1. The gradual increase, over the past several campaigns, of the final population doubling level of the cells (which must remain within certain specified limits) at the end of the seed train.
2. The low glycosylation levels of the product seen in certain campaigns, which meant that a certain number of final product batches were below the specified acceptable glycosylation limits.
Following a literature survey several controlled process variables were chosen for investigation and hypotheses made on their effect on the seed train or glycosylation.
To investigate their effect on the PDL and cell growth in the seed train:
- Medium volume: decreasing the medium volume will yield a lower PDL due to slower cell growth caused by lower glucose availability.
- Seeding density: if cells obtain confluence by the time they are harvested, decreasing the seeding density will yield a higher PDL.
- Cultivation temperature: decreasing the temperature ought to decrease the growth rate.
- Medium feed temperature: there will be no significant difference to the cell culture when pre-heated or cold medium is used. Aeration: using vent caps will increase the oxygen content of the medium in the roller bottles and the cell growth, yielding a higher PDL.
To investigate their effect on glycosylation during production:
- pH: better glycosylation will be seen at pH 6.9, than at pH 6.7.
- Perfusion rate: a higher perfusion rate will lead to better glycosylation due to increased glucose and glutamine concentrations.
In the seed train, the only factor that significantly influenced the final PDL was the seeding density. Cell growth was inhibited once cells reached confluence, so lowering the seeding density lead to a higher PDL. It is recommended to use a high seeding density to ensure a lower PDL.
Historic data indicated that the seeding density was not the cause of the apparent increase of the final PDL, as all previous campaigns had been seeded with a high seeding density. What then became apparent was that the final PDL remained relatively constant during a campaign and that the increase in final PDL occurred between campaigns. It appears that the apparent increase in the final PDL is due to differences in cell counting between operators as each new campaign was managed by different operators. It is recommended that a mechanical cell counter be used to verify cells counts and to maintain a standard between campaigns.
In the bioreactors, varying the pH proved to have no significant effect on the glycosylation levels. However, both the initial perfusion rate and the specific perfusion rate proved to be important from both historical data and the data generated during these experiments.
Lower levels of the initial perfusion rate lead to better glycosylation and it is recommended that an initial perfusion rate of 1.0 volumes/day be used. The relationship between the specific perfusion rate and the glycosylation appears to be non-linear and requires further study, for now it is recommended that the specific perfusion rate be kept below 0.3 volumes/day/109 cells.
Probable reasons for the unsatisfactory glycosylation seen in certain runs could also be proposed from these two factors:
• RP33-133 : Very high specific perfusion rate
• RP32-135 : High initial perfusion rate and very high specific perfusion rate
• RP32-138 : High initial perfusion rate
• RP33-139 : High initial perfusion rate
Further research is recommended into the effect of the specific perfusion rate as well as the specific glucose consumption rate and the specific glutamine concentration on the glycosylation. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Rekombinante glikoproteïene is baie belangrike biofarmaseutiese produkte wat oplossings bied vir talle voorheen ongeneeslike siektes in alles van kanker tot onvrugbaarheid. Meeste rekombinante farmaseutiese produkte word gemaak deur diere-selle as gevolg van hulle bevoegtheid om die korrekte na-translasie stappe te volg sodat die produkte in mense gebruik kan word. Die na-translasie stappe beïnvloed baie van die proteïene se karaktertreke insluitende die farmakokinetika, bioaktiwiteit, uitskeiding, half-leeftyd, oplosbaarheid, herkenbaarheid and antigeniciteit. Die doel van hierdie tesis is om die stroomop produksie van ‘n rekombinante glikoproteïene vervaardig deur Chinese hamster ovariale (CHO) selle verder te bestudeer binne die grense van ‘n bestaande proses op grootskaalse vlak.
Die huidige proses gebruik CHO selle om ‘n rekombinante glikohormoon te produseer. Soos meeste prosesse wat rekombinante proteïene produseer bestaan die stroomop gedeelte van die proses uit twee dele: ‘n saad trein wat genoeg selle maak vir produksie en ‘n produksie gedeelte wat fokus op die vervaardiging van die glikoproteïen. Die saad trein bestaan hoofsaaklik uit roller bottels terwyl produksie plaasvind in perfusie bioreaktors waar die selle op “microcarriers” groei, met spin-filters om die selle binne die bioreaktors te hou; die hele proses gebruik medium met serum.
Daar is twee probleme in die stroomop gedeelte van die bestaande proses:
1. Die geleidelike toename oor die afgelope paar jaar van die finale verdubbelingsvlak van die selle aan die einde van die saad trein
2. Die lae glukosilering van die eindproduk wat veroorsaak dat sekere lotnommers buite spesifikasie is
Na ‘n literatuur studie, was seker beheerde proses parameters gekies om verder te bestudeer en hipotesisse gemaak oor hulle effek op die saad trein of die vlak van glukosilering.
Die volgende faktore is bestudeer vir hulle effek op die finale verdubbelingsvlak van die selle in die saad trein:
- Medium volume: ‘n laer medium volume sal lei tot a laer verdubbelingsvlak van die selle as gevolg van stadige groei
- Konsentrasie van selle vir inokulasie: as die selle konfluent is teen die tyd wat hulle versamel word sal ‘n laer konsentrasie selle lei tot ’n hoër verdubellingsvlak.
- Temperatuur: laer temperatuur behoort te lei tot ‘n stadiger groei koers van die selle
- Medium voer-temperatuur: die voer-temperatuur van die medium sal geen beduidende verskil maak
- Belugting: die gebruik van “vent-caps” sal die suurstof inhoud van die roller bottels verhoog
Die volgende faktore is bestudeer vir hulle effek op die glukosilering tydens produksie:
- pH: beter glukosilering word verwag by by pH 6.9 dan by pH 6.7
- Perfusie koers: ‘n hoër perfusie koers sal lei tot beter glukosilering as gevolg van hoër glukose en glutamien konsentrasies
Die konsentrasie van die selle wat gebruik word vir inokulasie blyk die enigste faktor te wees wat die finale verdubbelingsvlak van die selle en die groei van die selle in die saad trein beïnvloed het. Die groei van die selle was beprek wanneer die selle konfluent geraak het en dus het ‘n laër sel konsentrasie by inokulasie gelei tot ‘n hoër sel verdubbelingsvlak. Dit word aanbeveel dat ‘n hoë sel konsentrasie by inokulasie gebruik word.
Die geleidelike toename van die finale verdubbelingsvlak van die selle in die saad trein is waarskynlik as gevolg van die variasie in sel tellings tussen verskillende operateurs eerder as as gevolg van die beheerde proses parameters. Dit word aanbeveel dat ‘n meganiese sel-teller gebruik word om die verskil in sel tellings tussen operateurs te kontroleer en om ‘n standaard te handhaaf tussen produksie lotte.
In die bioreaktors, het die pH geen beduidende invloed gehad op die glukosilering maar uit historiese data en die huidige data van hierdie eksperimente blyk albei die begin perfusie koers en die spesifieke perfusie koers ‘n belangrike invloed te hê op die glukosilering.
Laër vlakke van die begin perfusie koers lei tot beter glikosilsie en dit word aanbeveel dat elke produksielot ‘n begin perfusie koers het van 1.0 volume/dag. Die verhouding tussen die glukosilering en die spesifieke perfusie koers blyk om nie-liniêr te wees nie. Nog navorsing hieroor word aanbeveel, maar vir nou word dit aanbeveel dat die spesifieke perfusie koers onder 0.3 volumes/dag/109 selle gehou word. Hierde twee faktore blyk die oorsaak te wees vir die lae glukosilering wat in sekere produksielopies gevind was:
• RP33-133 : baie hoë spesifieke perfusie koers
• RP32-135 : hoë begin perfusie koers en baie hoe spesifieke perfusie koers
• RP32-138 : hoë begin perfusie koers
• RP33-139 : hoë begin perfusie koers
Dit word aanbeveel dat verdere navorsing gedoen word op die effek van die spesifieke perfusie koers asook die spesifieke koers van glukose verbruik en die spesifieke glutamien konsentrasie op die glukosilering van die produk.
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