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Inadequate metabolic conditions in solid tumors lead to the formation of quiescent cancer cells that are suspended in a transient cell cycle arrest. When conditions change, quiescent cancer cells can re-enter the cell cycle and cause recurrence. Drug screening efforts have revealed mitochondrial oxidative phosphorylation as a unique metabolic dependency in quiescent cancer cells. The anthelmintic drug nitazoxanide is an inhibitor of oxidative phosphorylation and preferentially active against quiescent cancer cells in multicellular tumor spheroids.  In this thesis, we employed current and developed new models of quiescent cancer cells and applied live cell imaging for improved preclinical evaluation of cancer drugs in hepatocellular and colorectal carcinoma cell lines. As part of this work, a new assay to measure mitochondrial membrane potential in three-dimensional cell models was developed, an application of the JC-1 assay, and we demonstrated that the preferential activity against quiescent cancer cells of nitazoxanide is shared by two kinase inhibitors: sorafenib and regorafenib. The sensitivity of quiescent cancer cells to nitazoxanide, sorafenib, and regorafenib correlated with the disruption of the mitochondrial membrane potential. Nitazoxanide and sorafenib, in combination, caused an additive decrease in viability, mitochondrial membrane potential, and colony regrowth capacity.  Furthermore, we developed a quiescent hollow fiber assay and implemented an improved analysis using live cell imaging and adenosine triphosphate analysis. Hypoxia and cancer cell quiescence were enriched in hollow fiber macrocapsules over time, and the culture conditions affected nitazoxanide sensitivity. Additionally, we used basement membrane extract gel to support cell growth in hollow fiber macrocapsules and implanted macrocapsules in mice. We observed that the in vivo environment was favorable to cell growth. Through this characterization of the quiescent hollow fiber assay, we were able to outline important paths for future research.

RNA-bindande proteiner (RBP:er) har framträtt som kritiska regulatorer i post-transkriptionell genreglering, och deras dysreglering bidrar till cancerpatogenes. CAPRIN1, ett cytoplasmiskt protein, har identifierats som ett onkofetalt RBP med potentiell betydelse i hepatocellulärt karcinom (HCC), en mycket malign form av levercancer med dålig prognos. Detta examensarbete syftade till att använda gensredigeringsteknologier som CRISPR-interferens (CRISPRi) och RNA-interferens (RNAi) för att störa CAPRIN1-uttryck i HCC-cellinjer och analysera dess effekter på cellproliferation och mängden av CAPRIN1:s främsta RNA-mål. CRISPRi-konstruktioner som riktade sig mot transkriptionsstartstället (TSS) av CAPRIN1 designades och validerades, men trots lyckad kloning och uttryck av guideRNA:er (gRNA:er) resulterade CRISPRi-medierad gensläckning (KD) inte i någon signifikant minskning av CAPRIN1-uttryck. Ineffektiviteten hos CRISPRi tillskrevs låg transfektionseffektivitet, vilket bekräftades av fluorescensmikroskopi med EGFP-expressande plasmider i HepG2- och Huh7-celler. Detta kräver ytterligare optimering av elektroporationsparametrar eller utforskning av alternativa leveransmetoder. I kontrast uppnådde RNAi-medierad KD en betydande minskning av CAPRIN1-uttryck, vilket visade hög KD-effektivitet (90%) enligt RT-qPCR. Denna nivå av gensläckning gav en robust modell för vidare analyser. Efterföljande RT-qPCR av sex topp-RNA-mål identifierade av RAPseq visade varierande svar, med oväntad uppreglering av MYC och Cyclin D2, vilket går emot litteratur som antyder att deras stabilitet beror på CAPRIN1. Denna diskrepans kan förklaras av betydande standardavvikelse i uttrycksnivåerna, vilket understryker behovet av att upprepa experimenten samt genomföra en transkriptomanalys med RNA-seq för att identifiera meningsfulla mål såsom långa icke-kodande RNA (lncRNA:er). Ytterligare, MTT-proliferationstester, visade ökad cellproliferation efter CAPRIN1-KD, även om experimentella inkonsekvenser såsom ojämna cellantal begränsade slutsatsernas pålitlighet. För att erhålla tillförlitliga resultat behöver dock MTT-testet upprepas för att säkerställa konsistens med den positiva kontrollen och samla in statistiskt signifikanta data.Sammanfattningsvis, trots att CRISPRi-försöket stötte på betydande utmaningar, kan gRNA-designen och klonade plasmider användas i framtida studier när elektroporationsprotokollet har optimerats. Dessutom visade den framgångsrika RNAi-medierade KD av CAPRIN1 en alternativ metod som kan antas för vidare studier med andra RBP-kandidater. Framtida studier bör syfta till att optimera elektroporationssystemet, validera KD på proteinnivå och använda RNA-seq för en omfattande analys av CAPRIN1:s inverkan på transkriptomet i HCC-cellinjer. Dessa ansträngningar kommer att förbättra förståelsen av CAPRIN1:s regulatoriska mekanismer och dess potential som terapeutiskt mål vid HCC. / RNA-binding proteins (RBPs) play a crucial role in post-transcriptional gene regulation, and their dysregulation is implicated in cancer pathogenesis. CAPRIN1, a cytoplasmic activation/proliferation-associated protein, identified as an oncofetal RBP with potential significance in hepatocellular carcinoma (HCC), is a worthy candidate to be studied. Objective: This project aimed to establish a protocol for silencing RBPs gene expression via CRISPR interference (CRISPRi) technology using CAPRIN1 as a case study, as the roles of CAPRIN1 in tumorigenesis remains unknown. Results: Despite successful cloning of the designed gRNAs, CRISPRi-mediated knockdown did not reduce CAPRIN1 expression, attributed to low transfection efficiency as indicated by fluorescence microscopy. RNAi-mediated knockdown, however, achieved substantial reduction in CAPRIN1 expression (90%). Subsequent analysis of CAPRIN1 top RNA interactors showed substantial standard deviations, highlighting the need for repeating the experiments. The MTT assay showed uneven initial seeding densities, necessitating further repetitions of the assay. Conclusions: The study highlights the challenges associated with CRISPi-mediated knockdown, especially in transfecting HepG2 cells with large plasmids using electroporation. However, the designed gRNAs and cloned plasmids have the potential to be used in future studies, provided that the transfection process is further optimized. RNAi proved to be an effective alternative for gene silencing, achieving high knockdown efficiency and enabling subsequent analysis of CAPRIN1 target RNAs. Prioritizing further optimization of CRISPRi transfection protocols in upcoming projects will facilitate the adoption of this workflow for investigating other RBP candidates. Additionally, performing a comprehensive RNA-seq analysis could provide a deeper understanding of CAPRIN1’s role in HCC.

Dissertation in der sich mit dem Thema der Selektiven Internen Radiotherapie auseinandergesetzt wurde. Der Titel der Doktorarbeit lautet: Langzeit-Follow-Up von Patienten mit malignen primären und sekundären Lebertumoren nach Selektiver Interner Radiotherapie, Ziel war es das Überleben der Patienten nach Selektiver Interner Radiotherapie zu untersuchen. Hierbei standen insbesondere Patienten mit hepatocellulärem Karzinom im Fokus. Interessant war, dass bei ca. 66% der Patienten mit hepatocellulärem Karzinom keine Vortherapien vor dem Verfahren durchgeführt wurden. Des Weiteren wurde auch das Ansprechen auf die Therapie näher betrachtet. Die Auswertung erfolgte mittels Vergleich von MRT Aufnahmen vor und nach der Selektiven Internen Radiotherapie.:Inhaltsverzeichnis Tabellenverzeichnis 6 Abbildungsverzeichnis 7 Abkürzungsverzeichnis 9 1 Einleitung 11 1.1 Die Selektive Interne Radiotherapie (SIRT) 11 1.1.1 Medizinhistorische Aspekte der SIRT 11 1.1.2 SIRT­Verfahren 12 1.1.2.1 Indikationen 14 1.1.2.2 Kontraindikationen 14 1.1.2.3 Erfordernisse und Vorgehen vor der Therapiedurchführung 14 1.1.2.4 Komplikationen 15 1.2 Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) 16 1.2.1 Epidemiologie in Deutschland 16 1.2.2 Risikofaktoren 16 1.2.3 Therapie 16 1.2.4 Prognose 18 1.3 Das cholangiozelluläre Karzinom (CCC) 18 1.3.1 Epidemiologie 18 1.3.2 Risikofaktoren 19 1.3.3 Therapie 19 1.3.4 Prognose 19 1.4 Das hepatisch metastasierte kolorektale Karzinom (hmCRC) 21 1.4.1 Epidemiologie 21 1.4.2 Therapie 21 1.4.3 Prognose 23 1.5 Zum Forschungsstand der SIRT beim HCC 23 1.6 REILD und Betrachtung von Leberparametern im zeitlichen Verlauf 23 1.7 Fragestellungen und Ziele der vorliegenden Studie 24 2 Material und Methoden 25 2.1 Art, Ort und Zeitraum der Studie 25 2.2 Probanden/ Stichprobe 25 2.3 Durchführung der SIRT 28 2.3.1 Berechnungsmodell für die Therapieaktivität 28 2.4 Analyseparameter 30 3 Ergebnisse 32 3.1 Deskriptive Charakterisierung der Stichprobe 32 3.1.1 Deskriptive Charakterisierung der Studienteilnehmer 32 3.1.2 Deskriptive Charakterisierung der Tumorentitäten 33 3.1.3 Deskriptive Charakterisierung von Studienteilnehmern ohne SIRT 34 3.2 Tumorgrößen und Therapieaktivitäten 35 3.3 Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung des Lebertumors und dem Therapiebeginn 37 3.4 Ansprechen auf SIRT 38 3.5 Überleben 43 3.5.1 Todesursachen 43 3.5.2 Überlebenszeit 45 3.5.3 Einflussfaktoren auf das Überleben (Korrelationen) 48 3.5.3.1 Zusammenhang von Tumorgröße und Überleben 48 3.5.3.2 Zusammenhang von Therapieaktivität und Überleben 52 3.5.3.3 Zusammenhang zwischen SIRT und Überleben bei Studienteilnehmern mit monolobärem und bilobärem Leberbefall 54 3.6 Auswertung der Leberwerte (Leberparameter) 57 4 Diskussion 63 4.1 Deskription der Studienteilnehmer 63 4.2 Diskussion und Interpretation der eigenen Ergebnisse 63 4.2.1 Tumorgrößen und Tumoraktivitäten 63 4.2.2 Zeitintervall zwischen Diagnosestellung des Lebertumors und dem Therapiebeginn 64 4.2.3 Ansprechen auf SIRT 65 4.2.4 Auswertung der Überlebenszeiten 66 4.2.4.1 Vergleich von Studienteilnehmern mit und ohne SIRT in Bezug auf die Überlebenszeit 66 4.2.4.2 Vergleich von Studienteilnehmern mit HCC und der Gruppe „anderer hepatisch metastasierter Tumor“ bezüglich der Ansprechrate nach SIRT und der Überlebenszeit 67 4.2.4.3 Vergleich von Überlebenszeiten bei den unterschiedlichen Tumorentitäten nach SIRT 67 4.2.4.4 Diskussion der Ergebnisse von Patienten mit HCC 69 4.2.4.5 Diskussion über den Einfluss des Tumorvolumens auf die Überlebenszeit 69 4.2.4.6 Zusammenhang zwischen Therapieaktivität und Überleben 69 4.2.4.7 Mono­ oder bilobäre Leberbeteiligung bei Studienteilnehmern mit HCC 70 4.2.4.8 Nähere Betrachtung der Studienteilnehmer mit geringerem Überleben und einem Tumorvolumen >0 bis 500 ml nach SIRT 70 4.2.4.9 Auswertung der Leberparameter 71 4.3 Vergleich der Daten mit anderen Studien 72 4.3.1 SARAH­Studie 72 4.3.2 SIRveNIB­Studie 73 4.3.3 LEGACY­ Studie 74 5 Zusammenfassung 76 6 Summary 79 7 Literaturverzeichnis 83 8 Anhang (Tabelle 2­5) 103 Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 115 Anlage 2: Erklärung über die Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 116

No / Human aging involves a gradual decrease in cellular integrity that contributes to multiple complex disorders such as neurodegenerative disorders, cancer, diabetes, and cardiovascular diseases. Genome-wide association studies (GWAS) play a key role in discovering genetic variations that may contribute towards disease vulnerability. However, mostly disease-associated SNPs lie within non-coding part of the genome; majority of the variants are also present in linkage disequilibrium (LD) with the genome-wide significant SNPs (GWAS lead SNPs). Overall 600 SNPs were analyzed, out of which 291 returned RegulomeDB scores of 1-6. It was observed that just 4 out of those 291 SNPs show strong evidence of regulatory effects (RegulomeDB score < 3), while none of them includes any GWAS lead SNP. Nevertheless, this study demonstrates that by combining ENCODE project data along with GWAS reported information will provide important insights on the impact of a genetic variant-moving from GWAS towards understanding disease pathways. It is noteworthy that both genome-wide significant SNPs as well as the SNPs in LD must be considered for future studies; this may prove to be crucial in deciphering the potential regulatory elements involved in complex disorders and aging in particular.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est aujourd’hui une préoccupation majeure en hépatologie. Chez les patients atteints de cirrhose, le CHC est une complication néfaste associée à un risque de morbidité et de mortalité. La surveillance inadéquate des patients, entraînant des diagnostics à un stade élevé, combinée à des options thérapeutiques précaires pour le CHC avancé, ainsi qu'à la décompensation de la fonction hépatique, contribuent à ce qu'il soit l'un des cancers les plus mortels. D’ailleurs, les approches cliniques limitées du CHC sont le résultat de connaissances insuffisantes de sa pathogenèse et de sa pathobiologie. Récemment, un effort mondial a été déployé dans la recherche en oncologie pour définir les caractéristiques des cancers dans le but d'élaborer des biomarqueurs robustes et des nouvelles thérapies anticancéreuses. Cependant, l’application de telles caractéristiques dans le CHC reste rudimentaire et doit être instaurée si l’on espère améliorer sa prise en charge clinique. La reprogrammation métabolique est l’une de ces caractéristiques permettant la plasticité phénotypique et la croissance tumorale. Comme le CHC apparaît dans le foie, un organe métaboliquement dynamique, la reprogrammation métabolique est vouée à contribuer à l’initiation et à la progression du cancer. Par sa versatilité métabolique, la glutamine, l’acide aminé le plus abondant dans l’organisme, se classe parmi les nutriments éminents des cancers. Ce projet visait à identifier la pertinence de la reprogrammation métabolique dans le CHC, et plus concrètement, l'implication de la glutamine dans le phénotype du CHC. Nous avons d'abord effectué une analyse métabolomique comparative des tissus du CHC et des tissus hépatiques non-tumoraux adjacents, laquelle a révélé que le paysage métabolique du CHC est entièrement distinct de celui du foie non-tumoral. Les métabolites en aval du métabolisme de la glutamine étaient modifiés dans les tumeurs CHC, dont le glutathion et les intermédiaires du cycle de Krebs, suggérant que la reprogrammation métabolique du CHC implique plusieurs voies cellulaires centrales. Sous l’optique de l’addiction à la glutamine exogène que les cellules cancéreuses peuvent manifester, nous avons étudié les transporteurs membranaires de la glutamine. Cette étude a révélé que les cellules de CHC se caractérisent par une consommation accélérée de glutamine exogène par rapport aux hépatocytes normaux, pouvant s'expliquer par la surexpression de transporteurs tels que SLC1A5, SLC38A1 et SLC38A2. Ces résultats nous ont amenés à mieux comprendre le métabolisme de la glutamine dans les cellules de CHC par rapport aux hépatocytes non-cancéreux, en lien avec les glutaminases (GLS) et la glutamine synthétase (GS). Les tumeurs de CHC manifestaient une remaniement de l’expression de la GLS hépatique à la GLS rénale, ainsi qu’une surexpression de la GS, montrant une importante capacité discriminatoire pour les tumeurs de CHC par rapport à la cirrhose et au foie sain. Cette altération caractéristique des GLS avait également une valeur pronostique significative associée au risque de décès, de récidive et de progression du CHC. Tout compte fait, nous avons identifié la glutamine au premier plan de la reprogrammation métabolique ayant lieu dans le CHC, suggérant son potentiel pour affiner la prise en charge clinique de cette tumeur maligne imprévisible. / Hepatocellular carcinoma (HCC) has become a major cause for concern in the field of hepatology. In patients living with cirrhosis, resulting from chronic liver disease, HCC is a nefarious complication associated with risk of morbidity and mortality. The limited clinical approaches to HCC surveillance, diagnosis, and treatment are the result of insufficient knowledge regarding its pathogenesis and pathobiology. In recent years, there has been a global effort in cancer research to define characteristics, or hallmarks, of cancers in the aim of identifying robust disease biomarkers and elaborating novel, highly specific anti-neoplastic therapies. However, application of such characteristics in HCC remains rudimentary, and must be urgently engaged should we hope to improve its clinical management. Among these characteristics has emerged metabolic reprogramming, a phenomenon occurring in cancer cells allowing them to optimize their metabolism for sustained survival and growth. Given that HCC arises within the liver, a highly metabolically active and dynamic organ, metabolic reprogramming is bound to contribute to cancer initiation and progression, which may implicate a wide variety of intracellular pathways. Through its versatile role within cell metabolism, glutamine, the most abundant amino acid in the body, is among the distinguished nutrients for cancers. Hence, this project aimed to identify the pertinence of metabolic reprogramming in HCC, and more concretely, the implication of the glutamine-related metabolic network in the phenotype of HCC. We first performed a comparative metabolomics analysis of HCC tissues and adjacent non-tumoural liver tissues, which revealed that the metabolic landscape of HCC tissues is entirely distinct from that of non-tumoural liver. Metabolites downstream of glutamine metabolism were altered in HCC tumours, including glutathione, amino acids, Krebs cycle intermediates, and energy metabolites, further suggesting that metabolic reprogramming in HCC involves an array of central cellular pathways. In the perspective of the addiction to exogenous glutamine by cancer cells, we studied the expression profiles of membrane transporters supporting the influx of glutamine into HCC compared to normal liver. This study revealed that HCC cells are characterized by accelerated consumption of exogenous glutamine compared to normal hepatocytes, which could be explained by the overexpression of high-affinity transporters such as SLC1A5, SLC38A1, and SLC38A2. These findings prompted us to further understand what occurs to glutamine once it has entered HCC cells compared to non-cancerous hepatocytes, namely with regards to the activities of glutaminolysis, ensured by glutaminase (GLS), and glutaminogenesis, ensured by glutamine synthetase (GS). Interestingly, HCC tumours showed a specific reprogramming of GLS expression from the liver isoform to the kidney isoform, as well as a global overexpression of GS, phenomena showing high discriminative ability for HCC tumours compared to cirrhosis and healthy liver. This characterized switch of GLS from the liver to the kidney isoform also had significant prognostic value as it associated with risk of death, relapse, and progression. Altogether, we have shown that the non-essential amino acid glutamine is at the forefront of metabolic reprogramming occurring specifically in HCC, suggesting it may become a useful characteristic for the refinement of the clinical management of this unpredictable malignancy.

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