Das hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) bildet mit 2-3 % aller kolorektalen Karzinomen die häufigste Form der erblichen Darmkrebserkrankungen. Sie wird meist durch Mutationen in den Genen MLH1 und MSH2 verursacht. Beide Gene codieren zusammen mit anderen Genen (MSH6, MLH3, PMS1 und PMS) für Proteine des DNA-Mismatch-Repair-Systems, welches wichtig für die Stabilität des Genoms ist. Um Träger dieser Mutationen zu identifizieren und frühzeitig Vorsorgeprogrammen zuzuführen, ist ein zuverlässiges Auswahlverfahren notwendig. Aus diesem Grund wird in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Methode der denaturierenden Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) geeignet ist, um nach Mutationen in den Genen MLH1 und MSH2 zu suchen. Bei 26 weiblichen Patienten und 2 männlichen Probanden im Alter von 23 bis 69 Jahren, die an einem Mammakarzinom (26), einer Dysplasie der Portio (1) sowie an einem Ovarialkarzinom (1) erkrankt waren, und bei deren Familienmitglieder gehäuft Tumoren auftraten, wurden die Gene MLH1 und MSH2 mittels DHPLC gescreent. Dabei wurden alle Exons von MLH1 außer 3, 5-7, 9-10, 14-15 und 18 sowie alle Exons von MSH2 außer Exon 1-2, 4, 9 und 14 einschließlich der flankierenden Exon-/Intron-Grenzen untersucht. Bei insgesamt 41 einzelnen Patientenkurven wich das Muster des DHPLC-Chromatogramms als Hinweis auf eine Genveränderung durch mehrfache oder verbreiterte Peaks vom normalen Kurvenverlauf ab. Die sich daran anschließende DNA-Sequenzanalyse ergab bei 35 der auffälligen Kurven polymorphe Sequenz-Varianten. Keine der gefundenen Sequenzveränderungen stellte eine krankheitsauslösende Mutation für HNPCC dar. Die in dieser Arbeit erreichte Sensitivität des DHPLC-Verfahrens liegt damit bei 85,4 %. Das DHPLC-Verfahren konnte als zuverlässige und vergleichsweise kostengünstige Voruntersuchung etabliert werden.

Hereditary endometrial cancer (EC) is a Lynch syndrome (LS) related cancer variant and 2-10% of all EC are hereditary. The aim of this study was to develop a method for analysis of microsatellite instability (MSI) as such analysis would assist in identifying potential LS patients with EC at an early state of their disease, before a possible second cancer is developed in another organ. Twenty-six patients with adenocarcinoma in the endometrium, diagnosed at Uppsala University Hospital in Sweden between 1993 and 2012, were included in the study. Seven of these patients were also diagnosed with LS and the rest were sporadic EC. DNA was extracted from the patients’ formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. The extracted DNA was subjected to a multiplex PCR with fluorescently labelled primers and then analysed by using capillary electrophoresis. Of the sporadic EC, 26% was MSI-High, which correlates well with published data. Of the LS patients, 83% was MSI-High. The outcome of this project resulted in that MSI analysis is now a validated and established method used in the process of identifying potential LS among patients with EC.

DNA mismatch repair (MMR) is a critical genome-maintenance system. It ensures genome stability by correcting mismatches generated during DNA replication, suppressing homologous recombination, and inducing apoptosis in response to severe DNA damage. As a result, defects in MMR lead to genome-wide mutations and susceptibility to both hereditary and sporadic cancer syndromes. The hallmark of cancer cells defective in MMR is their ability to display frequent instability in simple repetitive DNA sequences, a phenomenon called microsatellite instability (MSI). However, only ~70% of the MSI-positive tumors have identifiable MMR gene mutations, indicating that additional factor(s) are responsible for the MSI phenotype in the remaining 30% MSI-tumors. We demonstrate here that phosphorylation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), an MMR component required for the initiation and resynthesis steps of the repair reactions, blocks in vitro MMR. We found that nuclear extracts derived from colorectal cell lines containing high levels of phosphorylated PCNA are not only defective in MMR, but also inhibitory to MMR activity in HeLa extracts. To determine if PCNA phosphorylation inhibits MMR, several PCNA isoforms that mimic phosphorylated or non-phosphorylated PCNA were examined for their effects on MMR activity. We show that all phosphorylated PCNA mimics block MMR at the initiation step but MMR was not affected by the non-phosphorylated mimetic PCNA. In vitro gap-filling experiments reveal that the phosphorylated PCNA induces a mutational frequency several fold higher than non-phosphorylated PCNA. Since PCNA has been shown to interact with MMR initiation factors MutSα and MutLα, we examined the interactions of phosphorylated PCNA with these two initiation factors. Interestingly, PCNA phosphorylation reduces the PCNA-MutSα interaction, but not the PCNA-MutLα interaction. Since PCNA is proposed to transfer MutSα to the mismatch site, the simplest explanation of the result is that PCNA phosphorylation inhibits MMR by blocking MutSα-mismatch binding activity. Taken together, our results reveal that PCNA phosphorylation induces genetic instability by inhibiting MMR at the initiation step and by promoting DNA polymerase-catalyzed mis-incorporations. This study provides a novel mechanism by which posttranslational modifications inhibit MMR, leading to genome instability and tumorigenesis. A second part of the study is to determine MMR function of several MutLα mutants associated with relapse leukemia patients. One of the mutants contains a phenylalanine99 to leucine substitution in the MLH1 subunit of MutLα. We show that this mutation inhibits MMR by blocking both the ATPase activity and the endonuclease activity associated with MutLα, supporting the importance of the MutLα ATPase and the endonuclease activities in MMR.

Ursache des klinisch durch die Amsterdam-Kriterien definierten HNPCC sind hochpenetrante Keimbahnmutationen in den DNAMismatchrepair( MMR)-Genen MLH1, MSH2, seltener in MSH6 und PMS2. Mutationsträger in diesen MMR-Genen haben ein hohes kumulatives Risiko (52–92%) für die Entwicklung kolorektaler – einschließlich syn- und metachroner – Karzinome, die sich meist in früheren Lebensjahren als bei sporadischen Fällen entwickeln. Darüber hinaus findet sich bei diesen Mutationsträgern ein deutlich erhöhtes Risiko für extrakolonische Karzinome, insbesondere des Endometriums, seltener der Ovarien, des Magens, der ableitenden Harnwege und des Dünndarms. Aus dieser Risikokonstellation erwächst die Frage nach einem spezifischen, individualisierten Therapiekonzept bei HNPCC-Patienten bzw. Mutationsträgern. Prinzipiell könnten drei Möglichkeiten des chirurgischen Vorgehens bezüglich des Kolorektums in Frage kommen: 1. prophylaktische Resektion bei gesunden Mutationsträgern 2. onkologische Resektion bei Karzinommanifestation 3. erweiterte Resektion mit zusätzlich prophylaktischer Intention bei Manifestation des ersten Kolon- oder Rektumkarzinoms. Die erste Möglichkeit kann nach kritischer Evaluation verschiedener Argumente als Option der Prävention nicht empfohlen werden. Zur Zeit kann sicherlich auch keine endgültige Empfehlung abgegeben werden, ob die zweite oder dritte Option des operativen Vorgehens favorisiert werden sollte. Die Indikation zur prophylaktischen Hysterektomie und Oophorektomie sollte nach ausführlicher genetischer, chirurgischer und gynäkologischer Beratung bei postmenopausalen Patientinnen, die die Amsterdam-Kriterien erfüllen oder Trägerinnen einer pathogenen Keimbahnmutation in einem MMR-Gen sind und bei denen dieser Eingriff mit einer anderweitig indizierten Operation kombiniert werden kann, erwogen werden. Eine exakte Prädiktion des individuellen Risikos und Erkrankungsalters auf Grundlage der Analyse von Interaktionen zwischen endogenen und exogenen, modifizierenden Faktoren ist Voraussetzung für individuelle Empfehlungen für «maßgeschneiderte»Vorsorgeprogramme oder prophylaktische chirurgische Maßnahmen. / Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC), clinically defined by the Amsterdam criteria, is caused by highly penetrant germ line mutations in DNA mismatch repair (MMR) genes, mostly in MLH1 and MSH2, infrequently in MSH6 und PMS2. Mutation carriers are at high cumulative risk (52-92%) for developing colorectal cancer (CRC), including syn- and metachronous colorectal carcinomas, with a younger age of onset compared with sporadic CRC. In addition, there is a remarkably increased risk in these mutation carriers for extracolonic carcinomas, especially for endometrial and ovarian carcinomas but also for gastric, ureter and renal pelvis and small bowel cancer. Therefore, the question arises if an individually tailored conception of treatment should be applied to HNPCC patients and mutation carriers. On principle, there are three options of surgical approach conceivable concerning the colorectum: i) prophylactic resection in healthy mutation carriers ii) oncological resection in the case of CRC iii) extended resection with an additional prophylactic intent in the case of first CRC. After critical evaluation of various arguments, the first option cannot be recommended for CRC prevention. However, a final recommendation neither for the second nor the third option of surgical approach can be given at the moment. The indication for a prophylactic hysterectomy and oophorectomy should be weighted in the following postmenopausal patients after intensive genetic, surgical and gynecologic counselling: patients fulfilling the Amsterdam II criteria or who have been identified as mutation carriers of a disease causing germ line mutation in one of the MMR genes and who have to be operated on due to another cause. A precise prediction of the individual risk and age of onset on the basis of the analysis of interactions between endogenous and exogenous modifying factors is the precondition for recommendations concerning individually tailored surveillance or prophylactic surgery. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Das hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) bildet mit 2-3 % aller kolorektalen Karzinomen die häufigste Form der erblichen Darmkrebserkrankungen. Sie wird meist durch Mutationen in den Genen MLH1 und MSH2 verursacht. Beide Gene codieren zusammen mit anderen Genen (MSH6, MLH3, PMS1 und PMS) für Proteine des DNA-Mismatch-Repair-Systems, welches wichtig für die Stabilität des Genoms ist. Um Träger dieser Mutationen zu identifizieren und frühzeitig Vorsorgeprogrammen zuzuführen, ist ein zuverlässiges Auswahlverfahren notwendig. Aus diesem Grund wird in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Methode der denaturierenden Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) geeignet ist, um nach Mutationen in den Genen MLH1 und MSH2 zu suchen. Bei 26 weiblichen Patienten und 2 männlichen Probanden im Alter von 23 bis 69 Jahren, die an einem Mammakarzinom (26), einer Dysplasie der Portio (1) sowie an einem Ovarialkarzinom (1) erkrankt waren, und bei deren Familienmitglieder gehäuft Tumoren auftraten, wurden die Gene MLH1 und MSH2 mittels DHPLC gescreent. Dabei wurden alle Exons von MLH1 außer 3, 5-7, 9-10, 14-15 und 18 sowie alle Exons von MSH2 außer Exon 1-2, 4, 9 und 14 einschließlich der flankierenden Exon-/Intron-Grenzen untersucht. Bei insgesamt 41 einzelnen Patientenkurven wich das Muster des DHPLC-Chromatogramms als Hinweis auf eine Genveränderung durch mehrfache oder verbreiterte Peaks vom normalen Kurvenverlauf ab. Die sich daran anschließende DNA-Sequenzanalyse ergab bei 35 der auffälligen Kurven polymorphe Sequenz-Varianten. Keine der gefundenen Sequenzveränderungen stellte eine krankheitsauslösende Mutation für HNPCC dar. Die in dieser Arbeit erreichte Sensitivität des DHPLC-Verfahrens liegt damit bei 85,4 %. Das DHPLC-Verfahren konnte als zuverlässige und vergleichsweise kostengünstige Voruntersuchung etabliert werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 8 1.1 Das hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (hereditary non-polyposis colorectal Cancer; HNPCC) 8 1.1.1 Definition, Epidemiologie und Krankheitsbild 8 1.1.2 Klinische Diagnostik 9 1.1.3 Genetische Diagnostik 11 1.1.4 Bedeutung der Diagnosestellung bei HNPCC-Patienten für die Behandlung 11 1.1.5 Molekulargenetische Grundlagen des HNPCC 13 1.2 Die hMLH1- und hMSH2-Gene 15 1.2.1 Lokalisation, Struktur und Funktion der hMHL-Gene 16 1.3 Detektion von Struktur- und Sequenzveränderungen bei HNPCC 17 1.3.1 Die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCP) 18 1.3.2 Die denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) 18 1.3.3 Die denaturierende Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) 19 2 Ziele dieser Arbeit 23 3 Patienten, Material und Methoden 24 3.1 Patienten 24 3.2 Materialien und Geräte 27 3.2.1 Materialien 27 3.2.2 Technische Geräte 28 3.2.3 Reagenzien 29 3.2.4 Lösungen und Puffer 30 3.2.5 Standards und Farbstoffe 31 3.2.6 Molekulardiagnostische Kits 31 3.2.7 Enzyme 32 3.3 Primer 32 3.4 Softwareprogramme, Datenbanken und Sequenzquellen 34 3.4.1 Software zur Schmelzpunktbestimmung 34 3.4.2 ABI PRISMTM Software zur Sequenzanalyse 34 3.4.3 Mutationsdatenbanken (Online) 34 3.4.4 DNA-Sequenzen 34 3.5 Methoden 35 3.5.1 DNA-Isolierung aus Vollblut 35 3.5.2 DNA-Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 36 3.5.3 Denaturierende Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) 38 3.5.4 DNA-Sequenzierung 41 4 Ergebnisse 46 4.1 Quantität und Qualität der isolierten DNA 46 4.1.1 DNA-Schmelzpunkt- und Fließgradienten-Bestimmung mittels WAVE®Maker-Software 47 4.1.2 Fragmentanalyse mittels DHPLC 49 4.2 DNA-Sequenzierung 54 4.2.1 Polymorphismen 55 5 Diskussion 61 5.1 Genotyp- und Phänotyp-Beziehung 61 5.1.1 Erstmanifestationsalter und Tumorspektrum 61 5.1.2 Fehlender Mutationsnachweis 62 5.2 DHPLC-Methode als Screening-Verfahren 65 5.2.1 Zeitersparnis 65 5.2.2 Kostenersparnis 67 5.2.3 Nachweisgenauigkeit 67 5.2.4 Nachweis von Sequenzvarianten 68 5.2.5 Chromatogramm-Interpretation 70 5.2.6 Anfälligkeiten für Störfaktoren 71 6 Zusammenfassung der Arbeit 73 7 Literaturverzeichnis 75 7.1 Web-Adressen 86 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 89 9 Lebenslauf 90 10 Danksagung 92

Ursache des klinisch durch die Amsterdam-Kriterien definierten HNPCC sind hochpenetrante Keimbahnmutationen in den DNAMismatchrepair( MMR)-Genen MLH1, MSH2, seltener in MSH6 und PMS2. Mutationsträger in diesen MMR-Genen haben ein hohes kumulatives Risiko (52–92%) für die Entwicklung kolorektaler – einschließlich syn- und metachroner – Karzinome, die sich meist in früheren Lebensjahren als bei sporadischen Fällen entwickeln. Darüber hinaus findet sich bei diesen Mutationsträgern ein deutlich erhöhtes Risiko für extrakolonische Karzinome, insbesondere des Endometriums, seltener der Ovarien, des Magens, der ableitenden Harnwege und des Dünndarms. Aus dieser Risikokonstellation erwächst die Frage nach einem spezifischen, individualisierten Therapiekonzept bei HNPCC-Patienten bzw. Mutationsträgern. Prinzipiell könnten drei Möglichkeiten des chirurgischen Vorgehens bezüglich des Kolorektums in Frage kommen: 1. prophylaktische Resektion bei gesunden Mutationsträgern 2. onkologische Resektion bei Karzinommanifestation 3. erweiterte Resektion mit zusätzlich prophylaktischer Intention bei Manifestation des ersten Kolon- oder Rektumkarzinoms. Die erste Möglichkeit kann nach kritischer Evaluation verschiedener Argumente als Option der Prävention nicht empfohlen werden. Zur Zeit kann sicherlich auch keine endgültige Empfehlung abgegeben werden, ob die zweite oder dritte Option des operativen Vorgehens favorisiert werden sollte. Die Indikation zur prophylaktischen Hysterektomie und Oophorektomie sollte nach ausführlicher genetischer, chirurgischer und gynäkologischer Beratung bei postmenopausalen Patientinnen, die die Amsterdam-Kriterien erfüllen oder Trägerinnen einer pathogenen Keimbahnmutation in einem MMR-Gen sind und bei denen dieser Eingriff mit einer anderweitig indizierten Operation kombiniert werden kann, erwogen werden. Eine exakte Prädiktion des individuellen Risikos und Erkrankungsalters auf Grundlage der Analyse von Interaktionen zwischen endogenen und exogenen, modifizierenden Faktoren ist Voraussetzung für individuelle Empfehlungen für «maßgeschneiderte»Vorsorgeprogramme oder prophylaktische chirurgische Maßnahmen. / Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC), clinically defined by the Amsterdam criteria, is caused by highly penetrant germ line mutations in DNA mismatch repair (MMR) genes, mostly in MLH1 and MSH2, infrequently in MSH6 und PMS2. Mutation carriers are at high cumulative risk (52-92%) for developing colorectal cancer (CRC), including syn- and metachronous colorectal carcinomas, with a younger age of onset compared with sporadic CRC. In addition, there is a remarkably increased risk in these mutation carriers for extracolonic carcinomas, especially for endometrial and ovarian carcinomas but also for gastric, ureter and renal pelvis and small bowel cancer. Therefore, the question arises if an individually tailored conception of treatment should be applied to HNPCC patients and mutation carriers. On principle, there are three options of surgical approach conceivable concerning the colorectum: i) prophylactic resection in healthy mutation carriers ii) oncological resection in the case of CRC iii) extended resection with an additional prophylactic intent in the case of first CRC. After critical evaluation of various arguments, the first option cannot be recommended for CRC prevention. However, a final recommendation neither for the second nor the third option of surgical approach can be given at the moment. The indication for a prophylactic hysterectomy and oophorectomy should be weighted in the following postmenopausal patients after intensive genetic, surgical and gynecologic counselling: patients fulfilling the Amsterdam II criteria or who have been identified as mutation carriers of a disease causing germ line mutation in one of the MMR genes and who have to be operated on due to another cause. A precise prediction of the individual risk and age of onset on the basis of the analysis of interactions between endogenous and exogenous modifying factors is the precondition for recommendations concerning individually tailored surveillance or prophylactic surgery. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Background: The hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) is the most frequent hereditary colorectal cancer syndrome. It has been associated with different types of cancers besides the early onset of the disease. To define HNPCC the Amsterdam or Bethesda criteria have to be met. Causative for the Lynch syndrome is a germline mutation of one of the four mismatch repair genes MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2. The detection of pathogenic alterations is of vital importance for the patient as well as for their relatives. The analyses for the PMS2 gene have been severely complicated by the presence of multiple pseudogenes with high homologies to the gene especially in its 5 ́-region. The PMS2CL pseudogene has a high homology to the 3 ́-region of PMS2, in particular the exons 9 and 11- 15, which result in recombination events between the paralogues. Objectives: In this study, we established the newly developed technique of long-range-PCR for mutation detection within the PMS2 gene. Using this method we could clearly discriminate gene from pseudogene which makes it a significant advancement in the detection of pathogenic mutations in PMS2 compared to previously used methods. Until recently mutation detections had been performed with a method, which is now obsolete. It has been the aim of this study to implement the new method of long-range-PCR in the daily diagnostic routine. However, within the study we examined only exons 11-15 of PMS2 equal to the long-range-PCR product 3, because this region contains the highly homologous region to the PMS2CL pseudogene and is known to undergo recombination. Furthermore, it was the aim of this study to make a statement about occuring recombination events and their nature, frequency and consequences. The sequence of the pseudogene has been amplified as well. Methods: Patients were selected based on an isolated loss for PMS2 in the immunohisto- chemistry of their tumor. The long-range-PCR was performed on DNA from blood leukocytes. The amplicons of both the gene and pseudogene were confirmed on gel electrophoresis and used as template for ensuing exon-specific nested-PCR prior to sequencing. Multiplex ligation-depend amplification (MLPA) was performed to screen for deleterious alterations. Results: The study comprised 23 patients. We identified pathogenic mutations in 14 patients (61 %). Four of these mutations are located in the 5 ́-region (upstream exon 8), ten mutations were found in the 3 ́-region (downstream exon 9). Those mutations were nearly evenly distrib- uted over the exons 11-14, whereas two mutations in exon 14 were large deletions. There was no mutation found in exon 15. Moreover we identified one putative pathogenic mutation in exon 12. The second part of this study aimed at the analysis of recombination events between PMS2 and PMS2CL. We identified 27 paralogous sequence variants, which were classified by un- derlying recombination patterns. We found patients without any recombination as well as re- combination events encompassing the exons 13-15. In 14 of 23 patients (61 %) a recombination event could be confirmed occurring primarily in the exons 13-15. The overall number of recombination events are benign and consequences for cancer development are not clear, except one patient who presented with a malignant tumor and carried a sequence recombina- tion in exon 11, which had not been found in former studies. Conclusion: From now on the long-range-PCR should be gold standard for detection of path- ogene alterations in the PMS2 gene. The mechanism and the verification of recombination events encompassing the whole gene PMS2 should be point of interest in further studies.

DNA mismatch repair (MMR) is a highly conserved pathway that maintains genomic stability primarily by correcting mismatches generated during DNA replication. MMR deficiency leads to microsatellite instability (MSI), which is a hallmark of HNPCC (Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer). Human mismatch repair is initiated by MutSα, a heterodimer of MSH2 and MSH6 subunits. Mismatch binding by MutSα triggers a series of downstream MMR events including interacting and communicating with other MMR proteins. The ATPase domain of MutSα is situated in the C-termini of its both subunits, and ATP binding is required for dissociation of MutSα from a mismatch. In eukaryotic cells, a strand break, which resides either 3’ or 5’ to the mismatch up to several hundred base pair away, determines the strand specificity of MMR. However, in spite of extensive studies, the mechanism by which MutSα locates and senses a nick from the mismatch, and coordinates the subsequent steps of MMR remains poorly understood. Two controversial models have been proposed to explain how the mismatch and the strand break communicate each other. Sliding model proposes that MutSα slides along the DNA helix from the mismatch to the strand break in an ATP binding-dependent but not ATP hydrolysis-dependent manner. Stationary model postulates that MutSα remains bound at the mismatch, and a protein-mediated DNA loop forms, physically bringing the mismatch and the nick in contact. Here, we tested these models in vitro, using a circular plasmid DNA substrate with a single GT mismatch and two Lac repressor (Lac I) binding sites as conditional physical 'roadblocks', one on either side of the mismatch, which when present, prevent MutSα from sliding bi-directionally along the DNA. The results showed that DNA excision initiates under conditions that block MutSα sliding, suggesting that initiation of excision is independent of whether MutSα slides from the mismatch to the nick. This result implies that the communication between the mismatch and the nick is likely through interactions between the mismatch-bound MutSα and other MMR components at the strand break, supporting the stationary model. Therefore, these studies provide significant insight into the mechanisms of mismatch correction in human cells.

Hereditary non-polyposis colon cancer syndrome (HNPCC) is associated with an increased risk of developing several types of cancer and is the most common cause of hereditary ovarian cancer after BRCA1 and BRCA2 mutations. HNPCC results from a germline mutation in one of the DNA mismatch repair (MMR) genes: MLH1, MSH2, PMS1, PMS2, MSH6, MSH3 and MLH3. While there has been extensive investigation of MMR deficiency in colorectal cancer, MMR in ovarian cancer is relatively under-investigated. The goal of this project was to study MMR deficiency in ovarian cancer at both the clinical and molecular level. The first aim was to examine the frequency of MMR loss in a large patient cohort and investigate the clinical consequences of MMR deficiency. The second aim was to describe the molecular characteristics of MMR deficiency in ovarian cancer cell lines and establish an in vitro cell line model of MMR deficiency in ovarian cancer. The third aim was to identify synthetic lethal strategies for the treatment of ovarian cancer to maximise cytotoxicity in a MMR-deficient background. In order to characterise the clinical consequences of MMR deficiency, a large patient cohort was studied with regard to MMR status. Three tissue microarrays consisting of 581 ovarian tumours were constructed, and expression of the four most frequently lost MMR proteins: MLH1, MSH2, PMS2 and MSH6 were detected by immunohistochemistry. Afterwards, MMR status and histology subtypes were analysed in combination with the associated clinical data. The overall incidence of MMR deficiency (loss of any MMR protein) was 15.7%, with PMS2 being the most frequently lost protein (9.7%). In addition, MMR deficiency tended to appear in a grouped fashion: MLH1 with PMS2; MSH2 with MSH6. Patients with non-serous subtypes of ovarian cancer, clear cell or mucinous especially, had higher incidence of MMR deficiency compared to patients with serous ovarian cancer. Overall MMR deficient patients were more likely to be diagnosed at early stages compared with MMR proficient patients, and this is probably due to the association between MMR deficiency and non-serous histology. However, platinum-based treatment for patients with MMR deficiency gives no advantage over those without MMR deficiency. Therefore better treatments for this subgroup of patients may be needed. The features of MMR deficiency in ovarian cancer were also characterized at the molecular level. After quantifying mRNA and protein expression of MMR genes in 19 ovarian cell lines, three cell lines (SKOV3, TOV21G and IGROV1) were found to have a defect in MLH1 expression at both the mRNA and protein level. Interestingly, the three cell lines also carried a defect in PMS2 expression at the protein level but not at the mRNA level, which is consistent with our clinical data demonstrating that MLH1 protein and PMS2 protein are paired in loss. In addition, across the 19 cell lines, MLH1 and PMS2 showed positive correlation at both the mRNA level (R=0.53, p=0.02) and protein level (R=0.72, p=0.0006). In order to study co-expression of MLH1 and PMS2, a plasmid encoding the cDNA for MLH1 was transfected into the three MLH1 deficient cell lines; and conversely siRNA targeting MLH1 was transfected into the MMR proficient cell line A2780 and expression of MLH1 protein and PMS2 protein was quantified. The results showed that re-introduction of MLH1 into MLH1 deficient cells resulted in increased expression of PMS2 protein, while knocking down MLH1 in MMR proficient cells leads to decreased PMS2 protein expression. This indicates that MLH1 may play a crucial role in regulating PMS2 protein expression. As the three MLH1 and PMS2 protein deficient cell lines all express PMS2 mRNA, the regulation of PMS2 expression by MLH1 is likely to be at the translational or post-translational level. However, the expression of PMS2 protein was not increased in the absence of MLH1, even when the proteasomal and lysosomal protein degradation pathways were blocked (as seen with SKOV3 cells), suggesting decreased PMS2 protein expression is not due to rapid degradation in the absence of MLH1. Therefore MLH1 may play a role in regulating the synthesis of PMS2 protein at the translational level, rather than preventing the degradation of PMS2. Thus, to investigate the mechanism by which PMS2 protein levels are regulated by MLH1, future work should focus on translational regulation of PMS2. In order to identify synthetic lethal strategies to target MMR deficiency in ovarian cancer, an isogenic cell line model of MMR deficiency was established by stable transfection of a plasmid for MLH1 and its corresponding empty vector into SKOV3 cells. The MLH1+ cell line SAC-1 and MLH1- cell line SN-5 were selected for drug screening based on their phenotype and growth rate. The AlamarBlue assay, with z’ above 0.5, was chosen for drug screening and a kinase inhibitor library containing 362 drugs of known target was screened. Two drugs with similar structures that targeted PLK1 showed greater growth inhibition of SN-5 compared with SAC-1. When the two cell lines were treated with another PLK1 inhibitor, BI2536, with different structure, a 2-fold difference in growth inhibition between SAC-1 and SN-5 was also observed, suggesting PLK1 is a potential synthetic lethal target for MLH1 deficiency in ovarian cancer. Together these data demonstrate that clinically, MMR deficiency is associated with non-serous subtypes of ovarian cancer and specific MMR proteins are paired in loss. While current standard therapy offers no selective benefit to ovarian cancer patients with MMR deficiency, inhibiting PLK1 activity may confer selective benefit.

Kurzreferat Unter mismatch repair-Defizienz (MMR-D) akkumulieren Mutationen durch die Fehlfunktion eines betroffenen MMR-Gens in Abhängigkeit von der Zeit und können zum Auftreten von kolorektalen Karzinomen (CRC) führen. Diese Mutationen sind beispielsweise unter MSH2-Defizienz als Mikrosatelliteninstabilität (MSI) in nicht codierenden Genomabschnitten im intestinalen Gewebe detektierbar. Die Analyse der Entwicklung der MSI im intestinalen Gewebe unter MMR-D ist im Menschen schwierig und ethisch nicht vertretbar. Eine Option der Analyse stellen Organoidkulturen, als Miniaturausgabe des intestinalen Gewebes ex vivo, dar. Ziel der Arbeit ist es, die Häufigkeit von Mutationen in Mikrosatelliten von Organoiden unter Msh2-Defizienz aus normalem Darm, Tumorvorläuferzellen und Tumoren in Abhängigkeit vom Alter der Maus, der Dauer und den Bedingungen der Organoidkultur zu quantifizieren. Dazu wurde der Mikrosatellitenstatus einzelner Organoide mit dem dazugehörigen Wachstumsmuster korreliert.   Folgende Fragen sollten beantwortet werden: Ab welchem Mausalter tritt MSI auf? Ist sie altersabhängig? Korreliert sie mit dem dazugehörigen Wachstumsmuster? Sind Tumorvorläuferzellen (Adenome) in makroskopisch normalem Gewebe vorhanden? Haben Kultivierungsdauer und -faktoren Einfluss auf die MSI und das Wachstumsmuster der Organoide? Material und Methodik Altersidentische Msh2+/+-, Msh2+/--, und Msh2-/-- Mäuse und daraus generierte Organoide wurde als Triplets generell parallel analysiert. Die Organoidkultivierung erfolgte durch Isolierung von Darmkrypten aus makroskopischem Normal- und Tumorgewebe. Das Wachstum wurde mittels life imaging aller 8 h über 144 h für jedes Organoid aufgezeichnet. Wachstumskurven wurden errechnet und das Wachstumsmuster eines Organoids wurde zu jedem Zeitpunkt klassifiziert. Die Organoide wurden nach dem life imaging gepickt und mithilfe der Mikrosatellitenmarker A27, A33, GA29 in einer Multiplex-PCR auf Alterationen analysiert. Hieraus konnte ein MSI Score, ein ∆bp Score und dazugehörige heatmaps, die die qualitativen Änderungen der Marker visuell widerspiegeln, ermittelt werden. Ergebnisse MSI ist in ISC-Organoiden von Msh2-/--Mäusen vor dem Auftreten solider Tumoren in einem Alter von 12 Monaten nachweisbar und steigt über die Lebenszeit an. Bereits in einem Alter von 5 Monaten ist der maximale MSI Score, der lediglich die Anzahl veränderter Mikrosatelliten aufzeigt, erreicht. Der ∆bp Score zeigt, dass die Längenveränderungen im Bereich der Mikrosatelliten weiter kontinuierlich zunimmt und ein mit fortschreitendem Alter progressiver Nukleotidverlust auftritt. Die Wachstumsraten und -muster der Organoide von Msh2-/--Mäusen werden mit zunehmendem Alter heterogen. Bis zu einem Mausalter von 8 Monaten zeigen die Organoide aus dem Normalgewebe der Mäuse ein homogenes, verzweigtes Wachstum. Im Alter von 12 Monaten wachsen jedoch etwa 10 % der Organoide initial zystisch, ähnlich Organoiden aus Tumorgewebe. Dieses inhomogene Wachstumsmuster ist unabhängig vom ermittelten MSI Score. Tumorvorläuferzellen akkumulieren in normalem Epithel von Msh2-/--Mäusen weit vor dem Auftreten solider Tumoren. Organoide, die ohne den Zusatz von Noggin und R-Spondin aus enzymatisch verdauten Normalgewebe anwachsen, stammen von Tumorvorläuferzellen ab. Sie können aus 8 und 12 Monate alten Msh2-/--, jedoch nicht Msh2+/-- und Msh2+/+-Mäusen isoliert werden, und weisen ein zystisches, tumorähnliches Wachstum auf. Die Wachstumsrate sowie der ∆bp Score der Organoide ist im Vergleich zu Organoiden aus Normalgewebe erhöht. Alterationen in ISC nehmen unter Langzeitkultivierung zu und akkumulieren in vitro schneller als in vivo. Organoide 8 Monate alter Mäuse wurden für weitere 18 Wochen in vitro kultiviert. Es konnte gezeigt werden, dass nach dieser Zeit im Vergleich zu 12 Monate alten Organoiden vermehrt zystisch-ähnliches Wachstum auftritt. Der ∆bp Score steigt in vítro schneller als in vivo. Acetylsalicylsäure (ASS) vermindert das Auftreten und die Länge von zystisch-ähnlichem Wachstum, verändert jedoch nicht den ∆bp Score. Nach Langzeitkultur mit ASS über 18 weitere Wochen wachsen Organoide 8 Monate alter Mäuse aller drei Genotypen seltener zystisch-ähnlich. ASS vermindert die Anwachsrate von Msh2-/--Organoiden. Der ∆bp Score ändert sich unter Substitution von ASS nicht. Fazit Organoidkulturen MMR-defizienter Mäuse geben Einblick in die gewebsspezifische Akkumulation von Mutationen in Abhängigkeit vom Alter der Tiere und den Kultivierungsbedingungen der Organoide. Sie lösen dabei ethische und gesetzliche Probleme im Umgang mit fetalen Stammzellen und stehen durch die Darstellung physiologischer und pathologischer Mechanismen, beispielsweise bei zystischer Fibrose, oralen Plattenepithelkarzinomen oder CRC im Mittelpunkt von Betrachtungen verschiedener medizinischer Fachrichtungen. Durch diese Arbeit wurden Methoden zur Quantifizierung genetischer Alterationen in ISC-Organoiden unter Msh2-Defizienz etabliert sowie Kultivierungsbedingungen zur Beeinflussung einer in vitro-Langzeitkultivierung von ISC-Organoiden charakterisiert, die als Grundlagen zur weiteren Forschung im Hinblick auf die Behandlung von HNPCC-Patienten als auch anderen Erkrankungen dienen können.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einführung 1.1. Häufigkeit und Einteilung von kolorektalen Karzinomen 1.1.1. Genetik des HNPCC 1.1.2. Diagnosestellung und Klinik des HNPCC 1.1.3. Acetylsalicylsäure als mögliches Präventivum bei HNPCC 1.2. Mausmodelle zur Darstellung der in vivo-Situation 1.3. Organoidkultur aus intestinalen Stammzellen 2. Aufgabenstellung 3. Materialien und Methodik 3.1. Generierung der Zielmäuse 3.2. Organoidkultivierung 3.3. Analyse der Mikrosatelliteninstabilität 3.4. Analyse des Wachstumsverhaltens der Organoide 4. Ergebnisse 4.1. Korrelation der MSI von Organoiden aus Normalgewebe mit dem Alter und dem Genotyp der Mäuse 4.2. Korrelation des Wachstumsmusters der Organoide aus Normalgewebe mit dem bp Score 4.3. Korrelation der Wachstumsgeschwindigkeit der Organoide aus Normalgewebe mit dem bp Score 4.4. Nachweis von Tumorvorläuferzellen in makroskopischem Normalgewebe 4.5. Vergleich der MSI zwischen in vitro- und in vivo-gealterten Organoiden aus Normalgewebe 4.6. Auswirkung von ASS als zusätzlicher Kultivierungsfaktor auf die MSI von in vitro-gealterten Organoiden 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Publikation - Different in vivo and in vitro transformation of intestinal stem cells in mismatch repair deficiency Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Selbstständigkeitserklärung Lebenslauf Publikationen/Vortragsthemen Danksagung