Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:52:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_RodrigoMiguel_D.pdf: 1749179 bytes, checksum: 025af214a1c78761be008c2a30ea5596 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A adenosina quinase tem um papel crítico no controle da disponibilidade tecidual de adenosina. Sua inibição provoca aumento da concentração local de adenosina, que, por sua vez, exerce efeitos em múltiplos aspectos da função celular. O desenvolvimento de bloqueadores farmacológicos da atividade da adenosina quinase tem, portanto, amplo potencial de aplicação terapêutica. O presente estudo foi planejado para caracterizar os efeitos inibitórios de derivados de 4-anilinoquinazolinas, DMA - cloridrato de 6,7-dimetóxi-4-N-(N,N¿-3¿-dimetilfenil)aminoquinazolina e PD153035 - Cloridrato de 6,7-dimetóxi-4-N-(3¿-bromofenil) aminoquinazolina na atividade da adenosina quinase, bem como sua ação sistêmica sobre a concentração de adenosina em órgãos e tecidos. Para avaliar a hipótese de inibição da adenosina quinase pelos compostos 4-anilinoquinazolínicos foram feitos ensaios in vitro com adenosina quinase recombinante (~42 kDa) clonada de fígado de camundongos. O ensaio para avaliar a atividade e a cinética da adenosina quinase recombinante constou de determinação do consumo de adenosina, obtido através de medidas da concentração de adenosina no meio com técnica de HPLC. Os estudos iniciais de cinética enzimática foram realizados sob condições saturantes, em realação ao substrato ATP, adicionado-se concentrações variadas de adenosina ao meio de reação Nestas condições a reação foi ajustada ao modelo de Michaelis-Menten e os parâmetros Km (Constante de dissociação que caracteriza a especificidade do substrato pela enzima) e Vmax (Velocidade máxima da reação enzimática sob concentrações saturantes de substrato) utilizados para análise da cinética. Considerando-se o consumo de adenosina, os valores de Km e Vmax da adenosina quinase foram de 2,5 ± 0,28 µM e 38 ± 1,26 nmols /min/µg de proteína, respectivamente. Experimentos realizados com o inibidor clássico de adenosina quinase, 5-Iodotubercidina, produziram inibição com IC50 de 100nM. Em seguida foram feitos experimentos in vitro para verificar os efeitos inibitórios dos compostos 4-anilinoquinazolínicos DMA e PD153035 na atividade da adenosina quinase. A avaliação da cinética enzimática na presença de várias concentrações de DMA e PD153035 permitiu confirmar a atividade inibitória desses compostos na adenosina quinase recombinante. Os valores de IC50 (a concentração do inibidor que exibe a metade do efeito inibitório máximo) foram de 0,8 nM e 1,2 pM para o PD153035 e DMA, respectivamente. Os valores de Ki (Constante de inibição) calculados com base nos valores de IC50 através da equação de Cheng-Prusoff foram estimados em 0,24 pM e 160 pM, para o DMA e o PD153035, respectivamente. Confirmada a hipótese de que os compostos 4-anilinoquinazolínicos inibem a atividade da adenosina quinase in vitro, realizamos experimentos in vivo para avaliar se o DMA aumenta a disponibilidade de adenosina em coração, fígado e cérebro de ratos, bem como em corações isolados de ratos, em preparações de Langendorff. As dosagens de adenosina tecidual foram obtidas através de método baseado em HPLC. A análise revelou um aumento médio de 47% e 30% nos níveis de adenosina no coração e fígado, respectivamente, de ratos tratados por gavagem com DMA em relação aos controles. Nos experimentos de corações isolados, a análise das amostras mostrou um aumento médio de 64% da concentração de adenosina nos corações perfundidos com o composto em relação aos controles. Conclusões: Com base nos achados do presente estudo podemos concluir que 1) a adenosina quinase recombinante apresenta atividade enzimática in vitro; 2) os compostos derivados de 4-anilinoquinazolinas DMA e PD153035 inibem a atividade da adenosina quinase recombinante em baixas concentrações, sugerindo um efeito específico e 3) a administração sistêmica de DMA provocou aumento da disponibilidade de adenosina em tecidos e em órgão isolado de ratos, possivelmente em decorrência de inibição da atividade de adenosina quinase tecidual. Tendo em vista a importância dos efeitos da adenosina sobre o sistema biológico e a confirmação da potência e seletividade de compostos 4-anilinoquinazolínicos como inibidores de adenosina quinase, pode-se sugerir o potencial uso terapêutico desses compostos em doenças, cuja origem esteja relacionada com alterações da concentração de adenosina celular / Abstract: Adenosine kinase has a critical role in the control of bioavailability of tissue adenosine. Its inhibition increases the local concentration of adenosine that affects several aspects of cellular functions. The development of pharmacological agents with adenosine kinase inhibitory properties has attracted interest as a promising strategy for therapeutic application. The aim of the present work was to characterize the inhibition effects of 4-anilinoquinazolines derivatives, DMA ¿ -N-(N,N-3'-dimethylphenylamino) -6,7-dimethoxyquinazoline hydrochloride and PD153035 - -N-(3'-bromophenylamino) -6,7- dimethoxyquinazoline hydrochloride on adenosine kinase activity as well as its systemic actions on adenosine levels in tissues. To evaluate the hypothesis of adenosine kinase inhibition by 4-anilinoquinazoline compounds, we performed in vitro assays with recombinant adenosine kinase cloned from mouse liver (~42 KDa). The activity and enzymatic kinetic assay of recombinant adenosine kinase involved monitoring adenosine levels in the reaction mixture by HPLC. Adenosine kinase activity was assayed using saturated concentration of ATP and different concentrations of adenosine. Under these conditions, the reaction was adjusted for the Michaellis-Menten model and kinetics parameters (Km and Vmax) were determined. Considering the adenosine contents, the Km and Vmax values were 2.5 ± 0.28 µM and 38.0 ± 1.26 nmols /min/µg of protein, respectively. Different concentrations of the standard inhibitor 5-iodotubercidin were used and the IC50 value obtained was 100 nM. In vitro enzymatic reactions were carried out to confirm DMA and PD153035 inhibitory effects on adenosine kinase activity. The kinetic reaction evaluation in presence of different DMA and PD153035 concentrations confirmed the inhibitory activity of these compounds on adenosine kinase. The IC50 values determined by the non-linear curve fitting program PRISM were 0.8 nM and 1.2 pM for PD153035 and DMA, respectively. The Cheng-Prusoff equation was used to calculate the Ki values from IC50 values, and they were estimated at 160.0 pM and 0.24 pM for PD153035 and DMA, respectively. We confirmed the hypothesis that the 4-anilinoquinazoline compounds have in vitro inhibitory effects on adenosine kinase activity. Then, we performed in vivo experiments to evaluate if DMA increases the adenosine levels in rat tissues such as heart, brain and liver as well as in the Langendorff preparations of isolated rat heart. An HPLC-based method was used to detect and quantify purine nucleoside adenosine and nucleosides derivatives in rat tissue samples. Adenosine levels in the heart and liver of rats treated with DMA increased average of 47% and 30%, respectively, relative to controls. In experiments using isolated hearts, the sample analysis showed an average 64% increase of adenosine concentrations in the rat hearts perfused with DMA relative to control. Conclusions: We conclude that 1) recombinant adenosine quinase presents enzymatic activity in vitro, 2) 4-anilinoquinazoline derivatives PD153035 and DMA inhibit the activity of recombinant adenosine quinase at low concentrations, suggesting a specific effect and 3) the systemic administration of DMA increases adenosine levels in tissues and isolated rat hearts, possibly due to inhibition of adenosine quinase activity. Considering the importance of adenosine effects on biological systems and adenosine kinase inhibition by 4-anilinoquinazoline compounds, a potential therapeutic use of these compounds in diseases related to cellular alterations of the adenosine levels is suggested. / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Susanne Rath / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T08:45:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peruchi_LiviaManiero_M.pdf: 2606610 bytes, checksum: 4b1e6756287ec6b3404f0fe6512fb307 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Este trabalho teve como objetivo desenvolver e validar um método por cromatografia líquida de alta eficiência para a determinação de oito compostos ativos amplamente utilizados em protetores solares: benzofenona-3, octocrileno, metil benzilideno canfora, octil dimetil PABA, metoxicinamato de etilexila, butil metoxidibenzoilmetano, homosalato (usado nas suas duas formas isoméricas) e salicilato de etilexila. A separação dos compostos foi realizada em uma coluna cromatográfica ACE C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 mm), na temperatura de 20 °C e fase movel composta por metanol:agua 88:12 v/v com eluição isocrática. A vazão foi de 1 mL min e a quantificação foi feita por padronização externa no comprimento de onda máximo de cada composto. O tempo da corrida cromatográfica foi de 18 minutos. O preparo de amostra consistiu basicamente de diluição e filtração anterior quantificação. Os parâmetros considerados na validação do método foram: faixa linear, linearidade, sensibilidade, precisão intra e inter-ensaio e exatidão. O método foi aplicado em treze amostras de diferentes fabricantes disponíveis comercialmente. O número de compostos ativos variaram entre 1 e 5 em uma mesma amostra. As concentrações dos compostos estão na faixa de 0,9-10% (m/m) e estão de acordo com o limite máximo permitido pela ANVISA. Este trabalho teve tambem como objetivo avaliar a potencialidade do uso de fluorescência de raios-X para determinar o FPS (fator de proteção solar) de protetores solares utilizando métodos quimiométricos. Para isso foram selecionadas varias amostras de um mesmo fabricante com diferentes FPS. Os espectros de raios-X obtidos foram tratados com a ferramenta quimiométrica PCA (Principal Component Analysis) para a análise exploratória dos dados e então construiu-se um modelo de calibração por PLS (Partial Least Squares). / Abstract: This work describes the development and validation of a HPLC-DAD method for determination of eight sunscreen agents: benzophenone-3, octocrylene, octyl methoxycinnamate, octyl salicylate, homosalate (used in two isomeric forms), butyl metoxydibenzoylmethane, 4-metylbenzylidene camphor and octyl dimetyl PABA in sunscreen formulations. The separation of the eight compounds were achieved using a ACE C18 column (250 mm x 4.6 mm, 5 mm), column temperature 20 °C, and a mobile phase of 88:12 (v/v) methanol-water with isocratic elution. The flow rate was 1 mL/min and quantitation was performed by external calibration at the maximum wavelength of each compound. Total run time was 18 minutes. The sample preparation was simple and consisted basically of dilution and filtration before quantitation. The critical points of the method are the column temperature, composition of the C18 stationary phase and the composition of the mobile phase. The validation parameters comprised: linear range, linearity, selectivity, intra-day and inter-day precision, and accuracy, and were in accordance with the aim of the method. Thirteen samples of sunscreen emulsions (SPF 30) of different manufacturer were analyzed. The number of the sunscreen agents varied between one and five in a same sample. The concentrations of all compounds were in the range of 0.9 to 10% (m/m) and were in accordance with the current Brazilian legislation. This work has also evaluated the potential of use of X-ray fluorescence to determine the SPF (sun protection factor) of sunscreens using chemometric methods. For this purpose, several samples from the same manufacturer (same components) with different FPS were selected. The X-ray spectra obtained were treated with a chemiometric tool PCA (Principal Component Analysis) for exploratory data analysis and then built a calibration model by PLS (Partial Least Squares). / Mestrado / Mestre em Química

No / A sensitive and rapid high performance liquid chromatography method has been developed and used for the simultaneous determination of formoterol and budesonide in Symbicort Turbuhaler when assessing the aerodynamic characteristics of the emitted dose using Pharmacopoeial methods. This capability results in both time and cost saving. The mobile phase composition was acetonitrile-5 mM sodium dihydrogen orthophosphate, pH 3 (60: 40% v/v), and was passed at 1.5 ml min-1 through a C18 column with a UV detection (wavelength 214 nm). The method was shown to give good analytical performance in terms of linearity, precision (using phenylpropanolamine as an internal standard), sensitivity and solution stability. The intra-day precision for both formoterol and budesonide were 0.75% and 1.11%, respectively (n = 10). The limit of quantitation for formoterol was 10 ¿g L-1 and for budesonide was 120 ¿g L-1, and the limit of detection were 3 and 30 ¿g L-1, for both formoterol and budesonide, respectively. The method has been applied to determine the content of the emitted dose and the fine particle dose of Symbicort Turbuhaler.

Orientador: Marcelo Alexandre Prado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:01:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcelos_PollyanedaSilvaPortsMarcalde_M.pdf: 1193609 bytes, checksum: 9c2f1882563272a3577edc3852350f77 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Nos últimos anos, o consumo de chás aumentou significativamente em função da divulgação dos benefícios à saúde, provenientes da sua ingestão, sendo considerado importante na dieta devido ao elevado potencial antioxidante. No entanto, os estudos sobre o teor de compostos com propriedades antioxidantes encontrados em chás brasileiros são escassos. Devido a estudos que comprovam a presença de fitoquímicos bioativos em chás, este trabalho teve como objetivo avaliar o conteúdo de compostos fenólicos totais (CFT), flavonóides totais (FT) e a capacidade antioxidante (DPPH¿ e ß-Caroteno/ linoleato) das infusões de 9 ervas provenientes da Região Amazônica: Agirú (Chrysobalanus icaco), Açoita-cavalo (Luehea speciosa), Capim-santo (Cymbopogon citratus), Erva-cidreira (Lippia alba), Graviola (Annona muricata), Jucá (Caesalpinia ferrea), Pata-de-vaca (Bauhinia forticata), Parirí (Arrabidaea chica) e Sacaca comum (Croton spp). Além disso, os compostos fenólicos presentes nos extratos metanólicos das folhas de três espécies foram separados e quantificados pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplado ao detector de arranjo de diodos (DAD). A metodologia analítica consistiu de uma extração aquosa (infusão) para análise de compostos fenólicos e flavonóides totais, bem como para as análises de atividade antioxidante. Para análise por CLAE, os compostos fenólicos foram extraídos com metanol, seguida de hidrólise ácida, com o objetivo de liberar as formas agliconas. Com base nos resultados obtidos, em relação aos compostos fenólicos totais, das nove infusões analisadas, três apresentaram os maiores teores: C. férrea (721,08 mg EAG/g), L. speciosa (540,90 mg EAG/g) e C. icaco (497,79 mg EAG/g). Por outro lado, para flavonóides totais, a erva L. speciosa e a L. alba foram as que apresentaram os maiores teores (12,80 e 15,42 mg EC/g, respectivamente). Para as análise de antioxidantes pelos método citados, o Jucá (C. férrea), foi o que obteve o maior resultado. As amostras que apresentaram o maior teor de compostos fenólicos totais, foram posteriormente analisadas por CLAE; Para efeito comparativo, o chá verde comercial (Camellia sinensis) também foi analisado por CLAE. Os resultados obtidos da identificação e quantificação foram, em mg.g-1 para cada uma das amostras: Agirú (ácido gálico 0,45, miricetina 0,78 e quercetina 0,14); Açoita-cavalo ((+)- catequina 1,20 e quercetina 0,14); Jucá (ácido gálico 0,59 e quercetina 0,13); Chá-verde (ácido gálico 0,24, (-)- epicatequina 2,44, (+)- catequina 0,68 e quercetina 0,66). Para as ervas estudadas o Jucá foi o que se destacou, apresentando o maior teor para análise de compostos fenólicos totais e potencial antioxidante para as metodologias aplicadas, o que indica seu possível benefício à saúde o que pode estimular novos estudos sobre a caracterização mais aprofundada sobre seus constituintes / Abstract: In recent years, consumption of tea has increased significantly as a result of the health benefits derived from those ingestion. Moreover, tea has been considered important in the diet because of the high antioxidant potential. However, there is a lack of studies on the content of compounds with antioxidant properties found in Brazilian teas. Due to some studies that have proved the presence of these bioactive phytochemicals in tea, this work aimed to evaluate the content of total phenolic compounds (TPC), total flavonoids (TF) and antioxidant capacity (DPPH ¿ and ß-carotene / linoleate) of 9 herbs infusions from the Amazon region: Agirú (Chrysobalanus icaco), Aloita-cavalo (Luehea speciosa), Capimsanto (Luehea speciosa), Herb (Lippia alba), Graviola (Annona muricata), Juca (Caesalpinia ferrea), Pata-de-vaca (Bauhinia forticata), Parirí (Arrabidaea chica) and common Sacaca (Croton spp.) Furthermore, the phenolic compounds present in methanol extracts of the leaves of three species were separated and quantified by liquid chromatography (HPLC) coupled with a diode array detector (DAD). The analytical methodology consisted in aqueous extraction (infusion) for the analysis of phenolics and flavonoids, as well as for the analysis of antioxidant activity. For HPLC analysis, the phenolic compounds were extracted with methanol, followed by acid hydrolysis in order to release the aglycone forms. Based on the results obtained for total phenolic compounds, from the nine infusions assayed, three showed the highest levels: C. férrea (669,94 mg GAE/g¿1), C. icaco (494,13 mg GAE/g¿1) and L. speciosa (459,23 mg GAE/g¿1). On the other hand, for total flavonoids, L. speciosa and L. alba herbs showed the highest content (12,85 and 15.42 mg CE/g¿1, respectively). For the capacity antioxidant analysis by the mentioned methods, Jucá (C. férrea) has showed higher values. The samples that exhibited higher levels for total phenolic compounds were analyzed by HPLC: Agirú (Chrysobalanus icaco), Açoita-cavalo (Luehea speciosa) and Jucá (Caesalpinia ferrea). For comparative purposes, commercial green tea (Camellia sinensis) was also analyzed by HPLC. The results for phenolic compounds identification and quantification were, in mg.g¿1 for each sample: Agirú (0.45 of gallic acid, 0,78 of quercetin and 0,14 of myricetin); Açoita-cavalo (1,20 of (+)-catechin and 0,14 of quercetin), Jucá (0,59 of gallic acid and 0,13 of quercetin), and green tea (0,24 of gallic acid, 2,44 of (-)-epicatechin, 0,68 of (+)¿catechin and 0,66 of quercetin). For the herbs studied, Jucá was the most remarkable one, presenting the highest levels for the total phenolic compounds content and for the antioxidant potential by the applied methodologies, which indicates their potential health benefits that can stimulate new studies on the further characterization of their constituents / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T15:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VilcaQuispe_Augusto_M.pdf: 840674 bytes, checksum: 0ee3f83d8486d73f628e60ca5c8a83fd (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Muitas das toxinas isoladas e estudadas em seus efeitos biológicos precisam ser reavaliadas à luz de metodologias otimizadas em HPLC e confirmadas por espectrometria de massas, devido à possível presença de algum componente não estudado. No caso da serpente Bothrops marajoensis, são valorizados os estudos sobre essa espécie devido aos poucos trabalhos realizados, provavelmente por se tratar de uma espécie restrita e rara encontrada na ilha de Marajó, no Pará, e posteriormente em alguns locais litorâneos do Maranhão, aparentemente endêmica. A reprodutibilidade da atividade biológica, através dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. No presente trabalho, foi purificada uma nova serinoprotease TLBm, com atividade trombina "like" em um único passo cromatográfico em um sistema de HPLC de fase reversa, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. A nova serinoprotease foi caracterizada fisico-quimicamente, revelando uma massa molecular de 33332,5 Da por Espectrometria de Massa (MALDI-Tof). Por outro lado, mostrou uma atividade proteolítica perante o substrato cromogênico DL-BA?NA, assim como foi capaz de evidenciar uma atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino e hidrolisar a cadeia alfa (a) e beta (ß), comportando-se como uma trombina "like" tipo A e B. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BA?NA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 2,3x10-1 nmoles p-NA/Lt/min e o KM = 0,52x10-1M. Os estudos do efeito da temperatura sobre a atividade catalítica revelaram que a serinoprotease TLBm apresenta uma ótima atividade em torno de 38ºC e um pH de 8,0. Para confirmar o caráter trombina "like" da TLBm, esta foi inibida pela ação do fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF) e outros inibidores, através dos quais a atividade foi reduzida em mais de 50% (69,89±1,5 %). A análise de composição de aminoácidos mostrou que a serinoprotease TLBm trata-se de uma proteína de caráter ácido ao apresentar um elevado número de aminoácidos ácidos, assim como uma boa quantidade de aminoácidos hidrofóbicos, o que garante a estabilidade conformacional da proteína. A presença de 12 cisteínas sugere a possível presença de 6 pontes dissulfeto. A seqüência N-terminal da serinoprotease com atividade trombina "like" TLBm mostrou um alto grau de homologia seqüencial (55,9 a 79,4 %). No entanto, existem algumas substituições nos aminoácidos (S)12?(H)12 e (V)15?(L)15, os quais poderiam estar relacionados à diferença na atividade biológica estudada aqui ou em outras atividades, o que faria da TLBm uma serinoprotease particular. Com relação ao estudo das atividades biológicas, a TLBm mostrou-se desprovida de atividade hemorrágica, o que é característico desta família de proteínas e reforça a afirmação de esta ser uma serinoprotease. A TLBm apresentou também baixa capacidade inflamatória (edematogênica) e uma alta concentração na letalidade (DL50) intracerebroventricular (i.c.v), evidenciando que a toxina não contribui significativamente com a letalidade do veneno total. A serinoprotease com atividade trombina "like" TLBm tem a propriedade de induzir a agregação plaquetária em plasma rico em plaquetas (PRP) e esse efeito é inibido na presença do PMSF. / Abstract: Many of the isolated and studied toxins in their biological effects need to be revalued, to the light of methodologies optimized in HPLC and confirmed by Mass Spectrometry, due to the possible presence of some component which has not been studied. In the case of the serpent Bothrops marajoensis, its results are valuable due to the fact that there are few works accomplished probably because the treating of a restricted and rare species found at the island of Marajó, in Pará, and later in some coastal places of Maranhão, which seem endemic. The reproduction of the biological activity, through the pharmacological effects, is only possible with the use of chemically homogeneous fractions so that they maintain the integrity of the biological function. In the present work a new serineprotease was purified with activity thrombin like TLBm in a Chromatography step in a system of HPLC of reverse phase, with a high degree of purity and molecular homogeneity, without loss of the biological activity. A new serineprotease was characterized physical-chemically revealing a molecular mass of 33332,5 Da by a Mass Spectrometry (MALDI-Tof), on the other hand, it did show an proteolitic activity before the substratum chromogenic DL-BA?NA, as well as it was capable to evidence an fibrinogenolitic activity in front of the bovine fibrinogen, and hydrolise the alpha (a) and beta (ß) chain which behaved as a thrombin like A and B types. The studies of the kinetic activity showed that the serineprotease with activity thrombin like, possesses a michaeliano behavior in front of the substratum DL-Ba?NA registering the kinetic constants of Vmax = 2,3x10-1 nmoles ?-NA/Lt/min and the KM = 0,52x10-1M respectively. The studies of the effect of the temperature under the catalytic activity, revealed that the serineprotease TLBm was capable to show a great activity around 38ºC and a pH of 8,0. To confirm the character thrombin like of TLBm, it was inhibited by the action of the fenilmetilsulfonil fluoride (PMSF) and other inhibitors, where the activity was reduced in more of the 50% (69,89 ± 1,5%). The analysis of composition of amino acids showed that the serineprotease TLBm is a character protein acid when presenting a high number of acid amino acids, as well as a good amount of amino acids hydrophobic that guarantees the conformational stability of the protein. The presence of 12 cisteinas suggests the possible presence of 6 dissulfeto bridges. The N-terminal sequence of the serineprotease with activity thrombin like TLBm, showed a high degree of sequential homology (55,9 to 79,4%). However there are some substitutions in the following amino acids: (S)12?(H)12 and (V)15?(L)15 which could be related with the difference in the biological activity studied here or with other activities, which would make TLBm a private serineprotease. The studies of biological activity such an as hemorrhage, reveal that the serineprotease is completely deprived which is known is already of this family of proteins. On the other hand the studies of the inflammatory effect (oedematogenic) reveal that the serineprotease possesses a low inflammatory capacity and finally it displays a high concentration in the lethality (DL50) intracerebroventricular (i.c.v.) showing that the toxin doesn't contribute significantly with the lethality of the total poison. The serineprotease with thrombin like activity has the property of inducing the platelet aggregation in platelets-rich plasma (PRP), and that effect is inhibited in the presences of the PMSF. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:19:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VilcaQuispe_Augusto_D.pdf: 3256672 bytes, checksum: 5fbbaf997230230025e7a3945d3d9410 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: No presente trabalho duas novas serinoproteases com atividade trombina-simile, nomeadas TLBbz e TLBro isoladas a partir de Bothrops brazili e Bothrops roedingeri respectivamente, foram purificadas em um único passo cromatográfico por HPLC de fase reversa com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. Ambas serinoproteases foram caracterizadas fisico-quimicamente, revelando uma massa molecular relativa de TLBbz = 35,13 KDa e TLBro = 20,24 KDa por SDS-PAGE. Ambas apresentaram atividade proteolítica perante o substrato cromogenico DL-Ba?NA. Os estudos da atividade cinética mostraram que as serinoproteases tiveram um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-Ba?NA, apresentando uma Vmax = 1,89 nmoles ?-NA/Lt/min e KM = 0,853 mM para TLBbz; e Vmax = 0,0432 nmoles ?-NA/Lt/min e KM = 0,039 mM para TLBro. Ambas serinoproteases apresentam uma atividade ótima em torno de 38 oC e pH 8,0; sendo inibidas pela ação do fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e outros inibidores, através dos quais a atividade trombina-simile foi reduzida em mais dos 50 % (TLBbz = 86.2 % and TLBro = 42.6 %). Ambas TLBbz e TLBro possuem caráter acido ao apresentar um elevado numero de aminoácidos ácidos, assim como uma boa quantidade em numero de aminoácidos hidrofóbicos, o que garante a estabilidade conformacional da proteína. A presença de 12 cisteinas sugere a possível formação de 6 pontes dissulfeto. TLBbz e TLBro evidenciaram uma atividade fibrinogenolitica frente ao fibrinogenio bovino hidrolisando a cadeia alfa (?) e beta (?), comportando-se como uma trombina-simile tipo AB no caso da TLBro e tipo B, por hidrolizar a cadeia beta (?), no caso da TLBbz. Finalmente, estudos da atividade biológica indicam a propriedade de induzir agregação plaquetaria e esse efeito e inibido pela presença de PMSF / Abstract: In this work, two new serine proteases with thrombin-like activity called TLBbz and TLBro from Bothrops brazili and Bothrops roedingeri respectively were purified in a single chromatographic step by reverse phase HPLC with a high degree of purity and molecular homogeneity without loss of biological activity. Both serine proteases have been characterized physico-chemically, showing a relative molecular mass of TLBbz = 35.13 and TLBro = 20.24 kDa by SDS-PAGE. On the other hand, showed a proteolytic activity towards the chromogenic substrate DL-Ba?NA. The studies of the kinetic activity showed that serine proteases have a michaelian behavior when tested with the substrate DL-Ba?NA, with a Vmax = 1.89 nmoles ?- NA/Lt/min and KM = 0.853 mM for TLBbz, and Vmax = 0.0432 nmoles ?-NA/Lt/min and KM = 0.039 mM for TLBro. Both serine proteases have an optimal activity around 38 °C and pH 8,0; and were inhibited by the action of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and other inhibitors, whereby the thrombin-like activity was reduced in more than 50 % (TLBbz = 86.2 % and TLBro = 42.6 %). Both TLBbz and TLBro have acidic character by presenting a large number of aminoacids acids and a good amount of hydrophobic amino acids, which ensures the conformational stability of the protein. The presence of 12 cysteines suggests the possible formation of six disulfide bridges. TLBbz and TLBro showed a fibrinogenolytic activity against the bovine fibrinogen and hidrolise alpha (?) and beta (?) chain, behaving as a thrombin-like AB types in the case of TLBro and hydrolyzing the beta chain (?) behaving as a thrombin-like B types in the case of TLBbz. Finally, studies of biological activity indicate the ability to induce platelet aggregation and this effect is inhibited by the presence of PMSF / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

No / A novel high-performance liquid chromatography (HPLC) assay for the estimation of formoterol in urine samples was developed and validated. A solid phase extraction (SPE) using Oasis HLB was optimised to isolate formoterol from a urine matrix followed by HPLC with UV detection. This extraction procedure concentrated the final analyte forty times so that UV detection can be used to determine even a low concentration of formoterol in urine samples. The urinary assay was performed in accordance with FDA and ICH regulations for the validation of bioanalytical samples. The samples were injected onto a C18 Spherisorb® (250 mm x 4.6 mm x 5 ¿m) analytical column maintained at 30 °C. The mobile phase consisted of 5 mM of potassium dihydrogen orthophosphate buffer (adjusted to pH 3 with ortho phosphoric acid):acetonitrile (ACN) (70:30, v/v), and the formoterol peak was detected at wavelength 214 nm. The extraction recovery of formoterol from the urine sample was >95%. The calibration curve was linear (r2=0.99) over formoterol concentrations ranging from 1.5 to 25 ng/mL (n=6). The method had an accuracy of >92% and intra and inter-day precision CV% of <3.9% and <2.2%, respectively, at three different concentrations low, medium and high (10, 15, 20 ng/mL). The limit of quantification (LOQ) for formoterol was found to be 1.50 ng/mL. The accuracy and precision at the LOQ level were 95% and %CV <3.7% (n = 10), respectively. The method reported is simple, reliable, precise, and accurate and has the capacity to be used for determination of formoterol in urine samples.