A oxidação do DNA por espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio molecular singlete [O2 (1Δg)] , pode estar relacionada ao aparecimento de mutações e ao desenvolvimento de doenças. O O2 (1Δg) pode ser gerado biologicamente por reação de fotossensibilização, pela reação de H2O2 e HOCl e pela decomposição de peróxidos orgânicos contendo hidrogênio alfa (α-ROOH), na presença de metais de transição (Fe2+, Cu2+) ou HOCl. A decomposição de α-ROOH, como hidroperóxidos de lipídeos ou proteínas na presença de metais de transição, pode gerar O2 (1Δg) via mecanismo de Russell. Neste mecanismo, a oxidação de α -ROOH gera radicais peroxila, que podem reagir entre si, formando um intermediário tetraóxido linear. Este intermediário tetraóxido linear pode decompor através de um mecanismo cíclico e produzir O2 (1Δg), um álcool e um composto carbonílico. Como a decomposição de α-ROOH pelo mecanismo de Russell pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) decidimos investigar se o α-hidroperóxido de timina, 5-(hidroperoximetil)uracil (5-HMPU), poderia gerar esta espécie reativa na presença de metais (Ce4+, Fe2+, Cu2+) e HOCl. Outro objetivo foi avaliar os efeitos oxidativos, em DNA plasmidial (pBR322), da decomposição de 5-HPMU na presença de Cu2+. A geração de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl foi demonstrada por meio do monitoramento da emissão de luz monomolecular de O2 (1Δg) na região do infravermelho próximo (IR-próximo, λ = 1270 nm) e bimolecular na região do visível (λ = 634 e 703 nm). A aquisição do espectro de emissão de O2 (1Δg) forneceu evidências inequívocas da geração desta espécie reativa na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl. Além disto, a formação de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Fe2+, Cu2+ ou HOCl foi demonstrada através da captação química de O2 (1Δg) utilizando 9,10- divinilsulfonatoantraceno (AVS) e detecção por HPLC/MS/MS do endoperóxido (AVSO2) formado. A detecção por HPLC/MS/MS dos produtos de decomposição de 5-HPMU, 5- (hidroximetil)uracila (5-HMU) e 5-formiluracila (5-FoU), reforçaram a hipótese de geração de O2 (1Δg) pelo mecanismo de Russell. A análise dos resultados da incubação de pBR322, 5-HPMU e crescente concentração de Cu2+ mostraram o aumento da forma circular aberta (OC), indicando a formação de quebra de fita simples do DNA, provavelmente proveniente da presença dos radicais peroxila e alcoxila de 5-HPMU. Já a utilização das enzimas de reparo FPG e NTH na incubação de pBR322, 5-HPMU e Cu2+ forneceu evidências da formação preferencial de purinas oxidadas, especialmente de 2’-desoxiguanosina (dGuo). O aumento significativo da forma OC na presença de FPG indicou a formação de 8-oxo-2’-desoxiguanosina, resultante da oxidação da dGuo por O2 (1Δg) e/ou pelos radicais derivados de 5-HPMU. Podemos concluir que 5-HPMU pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) . Além disto, a presença de 5-HPMU pode levar a propagação dos danos oxidativos no DNA, pois sua decomposição pode gerar radicais peroxila e alcoxila / Oxidation of DNA by singlet molecular oxygen O2 (1Δg) can be involved in the development of mutations and diseases. In vivo, O2 (1Δg) can be generated by photosensitization reaction, H2O2 and HOCl reaction and decomposition of organic hydroperoxides with α-hydrogen (α-ROOH) in the presence of metal ions (Fe2+, Cu2+) or HOCl. The α-ROOH decomposition, such as lipid or protein hydroperoxides in the presence of metal ions or HOCl can generate O2 (1Δg) by Russell mechanism. In this mechanism, the self-reaction of peroxyl radicals generates a linear tetraoxide intermediate that decomposes to O2 (1Δg) , an alcohol and an aldehyde. Therefore, the purpose of this work is to investigate if O2 (1Δg) can be generated by α-thymine hydroperoxide, 5- (hydroperoxymethyl)uracil (5-HPMU) in the presence of Ce4+, Fe2+, Cu2+ or HOCl. Another purpose is to study base modification and strand breaks formation in plasmid DNA (pBR322) by 5-HPMU decomposition in the presence of Cu2+. The generation of O2 (1Δg) in the reaction of 5- HPMU and Ce4+ or HOCl was monitored by monomol light emission in the near-infrared region (NIR, λ = 1270 nm) and dimol light emission in the visible region (λ = 634 e 703 nm). The generation of O2 (1Δg) during the reaction of 5-HPMU and Ce4+ or HOCl was confirmed by acquisition of the light emission spectrum in the NIR. Furthermore, the generation of O2 (1Δg) produced by 5-HPMU and Fe2+, Cu2+ or HOCl was also confirmed by chemical trapping using anthracene-9,10-divinylsulfonate (AVS) and HPLC/MS/MS detection of the corresponding endoperoxide (AVSO2). The detection by HPLC/MS/MS of 5-(hydroxymethyl)uracil (5-HMU) and 5-formyluracil (5-FoU), two 5-HPMU decomposition products, support the Russell mechanism. Plasmid results from pBR322, 5-HPMU and Cu2+ reaction showed formation of DNA open circular form (OC), probably produced by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. Additionally, the reaction of pBR322, 5-HPMU and Cu2+ following by Fpg and NTH enzyme treatment demonstrated evidences of purine modification, especially 2’-deoxyguanosine (dGuo). The use of FPG enzyme indicated the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, a dGuo oxidation product formed by O2 (1Δg) and/or 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. We can conclude that 5-HPMU can be a biological source of O2 (1Δg)] and 5-HPMU decomposition can lead to an enhancing of DNA oxidative damage by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals formation

Obwohl EtG seit dem Jahr 2000 intensiv als Alkoholmarker in Haaren beforscht wird, bietet die Thematik weiterhin Raum für Forschung, insbesondere im Bereich der instrumentellen Analytik. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Beleuchtung dieser und weiterer Aspekte. Die Extraktion erfolgte überwiegend mittels der sogenannten Mikropulverisierung. Sie ermöglichte die simultane Mahlung der Haarmatrix und Extraktion des EtGs mit einem hohen Probendurchsatz. Die Selektion und anschließende Detektion erfolgte überwiegend durch HPLC-MS/MS. Die Sicherheit bei der Bestimmung des Analyten wurde durch die erfolgreiche Teilnahme an drei Ringversuchen der Society of Hair Testing (SoHT) belegt. Wiederholbedingungen wurden durch Herstellung von eigenen Haarreferenzmaterialien und die Verwendung von homogenen Fremdhaarmaterialien sichergestellt. Zur Evaluierung der Stabilität von EtG wurden zwei Haarmaterialien unter thermischen Stressbedingungen eingelagert und mit dem Gehalt von Referenzproben verglichen. Der Analyt zeigte außergewöhnliche Stabilität unter den gewählten Bedingungen. Ebenso erfolgte eine Beurteilung des Zerstörungsgrads von EtG im Haar durch oxidierende Substanzen, einhergehend mit der Entwicklung eines zerstörungsfreien Schnelltests mittels FTIR zur Detektion von oxidierten Cysteinspezies in Haaren. Das Modellsystem Barthaar wurde für zwei Experimentreihen etabliert: die Korrelation des EtG-Gehaltes im Barthaar nach Aufnahme definierter Alkoholmengen und den Nachweis von glucuronidierten Spezies im Barthaar nach Aufnahme der korrespondierenden Muttersubstanzen. Während keine eindeutige Korrelation zwischen aufgenommener Alkoholmenge und EtG-Gehalt im Barthaar hergestellt werden konnte, war es durchaus möglich, zwei glucuronidierte Metabolite von Arzneistoffen im Barthaar nach Konsum der Ausgangssubstanzen nachzuweisen. / Although EtG is subject to extended research since the year 2000, the topic still holds headroom for further experiments, especially when it comes to the field of instrumental analysis. The goal of the present thesis was the clarification of crucial analytical and further aspects. The extraction was mostly carried out using the so-called micropulverisation. It rendered the simultaneous milling of the hair matrix and extraction of EtG possible with a high sample throughput. Selection of the analyte and following detection was mainly carried out using HPLC-MS/MS. The quality of analysis was ensured by the successful participation in three interlaboratory tests carried out by the Society of Hair Testing (SoHT). Repetitive conditions were ensured by manufacturing of own hair reference materials as well as by the usage of homogeneous external hair materials. Two hair materials were treated under thermal stress conditions and the EtG values were compared to reference samples to verify the analytes stability. EtG showed extraordinary stability under the chosen conditions. Likewise, an assessment of the degree of EtG decay after oxidative treatment as well as the development of a nondestructive assay via FTIR to detect oxidized cysteine species were established. The model system beard hair was arranged for the conduction of two experimental series: the correlation of the EtG content in beard hair after defined oral consumption of ethanol and the detection of glucuronidation of the corresponding parent substances after consumption. Whilst no distinct correlation could be observed for the ethanol experiment, it was possible to provide evidence for the existence of two glucuronized metabolites of drugs after consumption of the parent compounds.

Cette étude a eu pour objectif de contribuer à une meilleure compréhension du comportement photochimique de certains micropolluants de type antibiotiques vétérinaires (sulfaquinoxaline, pyriméthamine) ou antibactérien (triclosan) en solution aqueuse et à la surface de la kaolinite, utilisée comme un modèle de sol.L’étude du comportement photochimique de la sulfaquinoxaline a été réalisée sous excitation à 254 nm et 365 nm. Dans tous les cas, une dégradation efficace est observée avec un rendement quantique qui dépend de la longueur d’onde d’excitation, du pH et la concentration d’oxygène dissous. De plus, la présence de l’oxygène moléculaire dans le milieu conduit à une inhibition partielle la photodégradation mettant en évidence l’implication partielle de l’état excité triplet. Ce dernier a pu être mis en évidence par photolyse laser nanoseconde à travers un transfert Triplet-Triplet (T-T) en employant le β-carotène comme accepteur. Sur le plan analytique, la phototransformation de la sulfaquinoxaline conduit à la formation d’un grand nombre de produits qui ont été identifiés par HPLC/ESI/MS/MS en identifiant les processus de fragmentation intervenant pour chaque molécule étudiée. L’étude a permis de montrer que les états excités singulet et triplet sont tout les deux impliqués dans la photodegradation et que les processus principaux intervenant sont la photohydrolyse, la désulfonation avec un réarrangement intramoléculaire, l'hydroxylation des motifs aromatiques et l'isomérisation selon un processus de type photo Fries.L’étude de la photoréactivité de la pyriméthamine a montré que la dégradation est plus efficace avec la forme neutre. Le rendement quantique a été évalué à environ 4,0x10-2 en milieu aéré et sous excitation à 254 nm. L’étude par photolyse laser a montré la formation intermédiaire de l’état excité triplet mais également de l’électron solvaté (absorption à 700 nm). Les processus de formation des photoproduits primaires sont la substitution de l’atome de chlore par un groupement hydroxyle ou par un atome d’hydrogène et l’hydroxylation du noyau aromatique.La dégradation des micropolluants à la surface du sol a pu être abordée en utilisant l’argile kaolinite comme support modèle. Ce système simplifié nous a permis d’étudier la photodégradation sous excitation en Suntest sur le plan cinétique et analytique. L’étude cinétique a été entreprise en fonction de différents paramètres tels que l’épaisseur de la kaolinite et la concentration initiale du substrat. Le premier effet nous a permis de montrer que pour des épaisseurs inférieures à 70 µm, la vitesse de diffusion du composé des zones sombres vers les zones irradiées est très rapide devant la photolyse et de ce fait, elle peut être négligée. Cet aspect a conduit à la détermination du rendement quantique de disparition à la surface de la kaolinite. Sur le plan analytique, les réactions observées sur l’argile sont différentes de celles observées en solution aqueuse. En effet, dans le cas de la sulfaquinoxaline, seul le produit de désulfonation est observé. Au contraire de la sulfaquinoxaline, l’étude complète de la molécule de triclosan a montré la formation de plusieurs produits et notamment des dimères ou des oligomères ce qui suggère la présence du substrat sous forme d’agrégats à la surface de l’argile. Afin de confirmer cette observation expérimentale, nous avons abordé une étude de modélisation par dynamique moléculaire. Celle-ci a donnée des informations très importantes sur l’organisation des molécules à la surface de la kaolinite. Ainsi, l’adsorption du triclosan fait intervenir d'importantes liaisons hydrogène avec la surface de la kaolinite. En présence de plusieurs molécules, la formation d’agrégats est gouvernée par une importante interaction entre les noyaux aromatiques de type π-stacking. / The study undertaken within this thesis concerns the photochemical behavior of the veterinary antibiotics sulfaquinoxaline and pyrimethamine, as well as the antimicrobial triclosan in aqueous solutions and at the surface of kaolin, used as a soil model.The photochemical study on sulfaquinoxaline was performed at 254 and 365 nm. In all cases, an efficient degradation was observed with a quantum yield that depends on the excitation wavelength, pH and the dissolved molecular oxygen concentration. Molecular oxygen acts as an inhibitor which reflects the involvement of the triplet excited state. Sulfaquinoxaline was clearly shown to be a photosensitizer of β-carotene via a triplet-triplet transfer process. From the analytical point of view, several photoproducts were generated and identified by using HPLC/ESI/MS/MS technique through a close analysis of the fragmentation processes. The byproducts that were formed via the singlet as well as the triplet excited states were mainly generated by photohydrolysis, desulfonation, hydroxylation and isomerisation reactions.The photochemical study of pyrimethamine indicates an efficient photoreactivity with the molecular form. The laser flash photolysis study reveals the implication of singlet and triplet excited states. The byproducts were mainly formed through the substitution of the chlorine atom by an hydroxyl group and the hydroxylation of the aromatic moiety.The photochemical study at the surface of soil was undertaken by using kaolin as a model support. Such simple system appears to be a guideline for precise kinetic and analytical studies. The former was performed as a function of several important parameters such as the layer thickness and the initial concentration of the substrate. The first parameter clearly indicates that for a thickness lower than 70 µm, the rate of diffusion is so fast that this process can be neglected when compared to the photochemical process. Thus, the first rate constant at the surface of kaolin was determined. Only the product of desulfonation was observed with sulfaquinoxaline while with triclosan, several byproducts were obtained such as dimers and oligomers suggesting the formation of aggregates at the surface of the solid support. In order to confirm this aspect, molecular dynamics studies were undertaken and indicate that the adsorption of triclosan mainly occurs at the surface of kaolin via hydrogen molecular bonds. The arrangement of the molecules in a cluster is governed by π-stacking type interactions between the aromatic moieties.

O estudo do processo da peroxidação de lipídios tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido à implicação dos hidroperóxidos de lipídios (LOOH) em diversos processos patológicos. A decomposição destes LOOH é capaz de gerar subprodutos capazes de promover danos em biomoléculas, incluindo proteínas e DNA. No presente trabalho, utilizando hidroperóxidos de ácido linoléico isotopicamente marcado com átomo de oxigênio-18 (LA18O18OH), fomos capazes de demonstrar que estas moléculas gerararam oxigênio singlete marcado [18(1O2)] em células em cultura. A detecção de tal espécie foi possível através da utilização de uma nova metodologia utilizando um derivado antracenico. Para este propósito foi utilizado o derivado de antraceno 3,3\'-(9,10-antracenodiil) bisacrilato (DADB), cujo produto especifico da reação com o 1O2 (o endoperóxido do DADB DADBO2) do pode ser facilmente detectado por HPLC-MS/MS. De forma a expandir a compreensão dos efeitos tóxicos desses LOOH, investigamos o efeito destes compostos gerados intracelularmente. Para tal, foi utilizado o Rosa bengala (RB), um fotosensibilizador que tem afinidade por espaços apolares como membranas e lisossomos. A fotosenssibilização deste composto foi capaz de induzir a morte celular, e esta morte estaria relacionada a uma maior formação de 1O2 e a um maior acumulo de peróxidos. Nestes estudos foi possível demonstrar que carotenóides e sistemas antioxidantes dependentes de glutationa foram capazes de proteger contra os efeitos tóxicos da fotosensibilização na presença de RB. Adicionalmente foram avaliados os efeitos da hemoglobina (Hb) e do hidroperóxido do ácido linoléico (LAOOH) em uma série de parâmetros toxicológicos, como citotoxicidade, estado redox, a peroxidação lipídica e dano ao DNA. Nós demonstramos que a pré-incubação das células com Hb e sua posterior exposição à LAOOH (Hb + LAOOH) levou a um aumento na morte celular, a oxidação do DCFH, formação de malonaldeído e fragmentação do DNA e que esses efeitos estavam relacionados com o grupo peróxido e ao heme presentes na Hb. Foi demonstrado que as células incubadas com LAOOH e Hb apresentaram um nível maior das lesões de DNA; 8-oxo-7,8-diidro-2 \'desoxiguanosina e 1,N2-etheno-2\'-desoxiguanosina. Além disso, as incubações com Hb levaram a um aumento nos níveis de ferro intracelular, e este alto nível de ferro correlacionada com a oxidação do DNA, avaliadas através da medida de sitios EndoIII e Fpg sensíveis. Nossos resultados comprovam que os LAOOHs apresentaram efeito citotóxico e genotóxico, mesmo em concentrações muito baixas, podendo contribuir para o desencadeamento de processos patologicos como o câncer e doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. / The study of the process of lipid peroxidation has increased in recent years, mainly due to the involvement of lipid hydroperoxide (LOOH) in a series of pathological processes. The decomposition of LOOH is able to generate products that can promote damage to biomolecules, including proteins and DNA. In the present work, using linoleic acid hydroperoxide isotopically labeled with 18O2 (LA18O18OH), we demonstrate that these molecules were able to generate labeled singlet oxygen [18(1O2)] in cultured cells. The detection of such species was possible using a new methodology using an anthracene derivative .For this purpose we used the anthracene derivative of 3,3\'-(9,10-antracendiil) bisacrilate (DADB), whose specific reaction product with 1O2 (DADB endoperoxide DADBO2) can be easily detected by HPLC-MS/MS. In order to expand the understanding of the toxic effects of LOOH, we investigated the effect of these compounds generated intracellularly. For this porpoise, we used Rose Bengal (RB), a photosensitizer that has affinity for apolar spaces such as membranes and lysosomes. The photosensitization of this compound was able to induce cell death, and this death was related to increased formation of 1O2 and a higher accumulation of peroxides. In these studies we have shown that carotenoids and glutathione-dependent antioxidant systems were capable of protecting against the toxic effects of photosensitization in the presence of RB. Additionally, we evaluated the effects of hemoglobin (Hb) and linoleic acid hydroperoxide (LAOOH) in a series of toxicological endpoints such as cytotoxicity, redox status, lipid peroxidation and DNA damage. We demonstrated that preincubation of cells with Hb and its subsequent exposure to LAOOH (Hb + LAOOH) led to an increase in cell death, DCFH oxidation, formation of malonaldehyde and DNA fragmentation, and that these effects were related to the peroxide and the heme group. It was demonstrated that cells incubated with LAOOH and Hb showed a higher level of the DNA lesions, 8-oxo-7,8-dihydro-2\'deoxyguanosine and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine. Furthermore, incubations with Hb led to an increase in intracellular iron levels, and this high level of iron correlates with the oxidation of DNA, measured as EndoIII and Fpg-sensitive sites. Our results show that the LOOHs showed cytotoxic and genotoxic, even at very low concentrations and may contribute to the onset of chronic malignancies like cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases.

O oxigênio molecular eletronicamente excitado ao estado singlete 1Δg (1O2) é bastante reativo frente a moléculas orgânicas com alta densidade eletrônica. As reações do 1O2 com o ácido desoxirribonucleico (DNA) têm sido estudadas extensivamente, uma vez que, provocam lesões que têm sido relacionadas com diversos processos citotóxicos e patológicos. Esse trabalho visou estudar os mecanismos pelos quais ocorrem os processos de oxidação de bases do DNA por 1O2. Para isso, um parâmetro essencial foi a identificação dos produtos de oxidação gerados na reação dessa biomolécula com 1O2. Foi desenvolvida uma fonte de 1O2, com caráter não-iônico, preparada com oxigênio-18 molecular e a N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\'-(1 ,4-naftilideno) dipropanamida (DHPN18O2 ). A fonte é capaz de gerar 1O2 isotopicamente marcado (18[1O2]). A incubação de DNA de timo de bezerro e células de fibroblastos com os endoperóxidos hidrofílicos do 3,3\'-(1 ,4-naftilideno)dipropanoato de sódio (NDPO2) e da N, N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\' -( 1,4-naftilideno )dipropanamida (DHPNO2), como fontes puras de 1O2, mostrou que a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-desoxiguanosina (8-oxodGuo) é a lesão majoritária. Quando o DHPNO2 foi usado, níveis mais altos de 8-oxodGuo foram detectados devido ao seu maior rendimento de formação de 1O2 e por ser capaz de penetrar em células. O uso do DHPN 18O2 na incubação de células demonstrou que o 1O2 lesa diretamente o DNA nuclear e forma 8-oxodGuo com oxigênio-18 incorporado. A identificação dos principais produtos de oxidação da 8-oxodGuo por 1O2 ou 18[1O2] foi feita usando análises de HPLC e espectrometria de massas em tandem com ionização por electrospray. Dessa forma, a imidazolona, oxazolona e os diastereoisômeros da espiroiminodihidantoína marcados com oxigênio-18 foram detectados. Além disso, foi caracterizado um nucleosídeo modificado que exibe as características da guanidinohidantoína oxidada. O uso do EAS para captação de 1O2 em sistemas aquosos e detecção do produto EASO2 por HPLC e espectrometria de massas possibilitou mostrar que a decomposição espontânea de ONOO- não gerava 1O2. O trabalho desenvolvido contribuiu na elucidação de algumas propostas fundamentais para esclarecer os mecanismos que envolvem a geração do 1O2 e sua interação com o DNA. A compreensão desses processos é importante para desvendar fenômenos biológicos importantes como envelhecimento e câncer. / Singlet oxygen (1O2) exhibits a substantial reactivity towards electron-rich organic molecules. Since DNA damage has been related to aging, cancer and other cytotoxic effects, its reaction with 1O2 have been extensively studied. Although, the mechanism and products of these reactions are not yet completely elucidated. The aim of the present work was to study the mechanism of DNA oxidation by 1O2. Emphasis was placed on the identification of the main products generated by the reaction of 1O2 with DNA. For this purpose, we developed a water-soluble naphthalene endoperoxide, the DHPN18O2, whose thermodecomposition leads to the formation of isotopically labeled singlet oxygen (18[1O2]). Calf thymus DNA and fibroblast cells were incubated with the hydrophilic endoperoxides NDPO2 and DHPNO2, as chemical generators of pure 1O2. It was found that 8-oxodGuo is the major 1O2-mediated DNA damage product. In order to demonstrate that 1O2 is directly involved in the formation of 8-oxodGuo, the DHPN18O2 was used. Incubation of the cells with such a generator of 18[1O2] resulted in the formation of 18O-labeled 8-oxodGuo in the nuclear DNA, clearly demonstrating that 1O2, when released within cells, is able to directly oxidize cellular DNA. The qualitative identification of the 1O2-oxidation products of 8-oxodGuo was achieved using HPLC coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry. Thus, the [18O]-labeled and unlabeled imidazolone, oxazolone, together with the diastereoisomeric spiroiminodihydantoin nucleosides, were detected as the main degradation products. In addition, a modified nucleoside that exhibits similar features than those of the oxidized guanidinohydantoin molecule was also produced. In this way, we contributed in the elucidation of some proposals of great importance to clarify the mechanisms that are involved in the interaction of 1O2 with DNA.

A lipoperoxidação gera diversas espécies carbonílicas altamente reativas dentre as quais se destacam acroleína (ACR), malondialdeído (MDA), 4-hidroxi-2-hexenal (HHE) e 4-hidroxi-2-nonenal (HNE). A principal via endógena de metabolização desses compostos é através de conjugação com glutationa por ação da glutationa-S-tranferase. Contudo, diversos trabalhos têm mostrado que dipeptídeos contendo histidina, tal como a carnosina (CAR), também podem formar conjugados com aldeídos e auxiliar na detoxificação desses compostos. Em nosso trabalho adutos de CAR com ACR, HHE, HHEd5, HNE e HNEd11 foram sintetizados, purificados e caracterizados. A reação da CAR com ACR foi estudada em detalhes. Resultados mostraram que a carnosina reage com acroleína formando 03 produtos principais: m/z = 265, m/z = 283 e m/z = 303, sendo este último mais estável e mais abundante. Dados de RMN H1, COSY e HSQC permitiram elucidar a estrutura dessa molécula (m/z = 303) e propor uma rota de reação. Em seguida, uma metodologia baseada em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas do tipo \"Ion Trap\" (ESI+ HPLC/MS-MS) foi desenvolvida e validada para quantificação simultânea dos adutos sintetizados. Pelo método desenvolvido é possível quantificar com precisão 25 pmol de CAR-HHE, 1 pmol de CAR-ACR e 1 pmol de CAR-HNE com um coeficiente de variação de aproximadamente 10 % e acurácia de 98 % (HHEd5 e HNEd11 foram usados como padrão interno). Análise em urina de adultos não fumantes mostraram que os produtos sintetizados estão presentes na urina de humanos em concentrações de 3,6 ± 1,4; 2,3 ± 1,5 e 1,3 ± 0,5 nmol / mg de creatinina, respectivamente para CAR-ACR, CAR-HHE e CAR-HNE. Em ratos transgênicos SODG93A modelo para esclerose lateral amiotrófica (ELA), a suplementação da dieta dos animais com 35 ± 5 mg carnosina/animal/semana melhorou a manutenção do peso e a sobrevida dos animais. Análises dos adutos sintetizados em amostras de músculo sugerem que a metabolização de aldeídos esteja comprometida nesses animais e que a carnosina poderia funcionar como \"scavenger\" para esses compostos. Esses resultados comprovam que dipeptídeos de histidina atuam na detoxificação de compostos carbonílicos e participa de suas vias de excreção. Além disso, a caracterização da estrutura e desenvolvimento de método sensível de detecção abre a possibilidade de utilização desses adutos como biomarcadores de estresse redox e exposição a aldeídos. / Lipid peroxidation generates reactive carbonyl species, including 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), acrolein (ACR), 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) and malondialdehyde (MDA). One major pathway of aldehyde detoxification in vivo is through conjugation with glutathione catalyzed by glutathione-S-transferases or, alternatively, by conjugation with endogenous histidine containing dipeptides, such as carnosine (CAR). The reaction of CAR with ACR was investigated in an effort to assess its possible biological role. One stable adduct was isolated by reverse-phase HPLC and characterized on the basis of extensive spectroscopic measurements. The proposed reaction route for product formation involves the reaction of the CAR amino group with ACR via a Schiff base formation followed by dehydration and cyclization through Michael addition in the imidazole ring forming an instable compound with m/z = 265. The subsequent reaction with another molecule of ACR followed by cyclization gives rise to the final product with m/z = 303.A highly sensitive method involving HPLC-MS analysis was developed for the simultaneous accurate quantification of CAR- ACR, CAR-HHE and CAR-HNE adducts in human urinary samples from non-smoking adults. This methodology permits quantification of 10 pmol CAR-HHE and 1 pmol of CAR-ACR and CAR-HNE. Adduct levels in urine were 3.6 ± 1.4, 2.3 ± 1.5, 1.3 ± 0.5 nmol/mg of creatinine, respectively to CAR-ACR, CAR-HHE and CAR-HNE. In SODG93A transgenic rats model to amyotrophic lateral sclerosis (ALS), the food supplementation of the animals with 35 ± 5 mg carnosine/animal/week improve de body weight and the life span of the ALS treated group. Analysis of the synthesized adducts in muscle sample showed suggest than aldehyde metabolization is compromised in this animals and that may be carnosine work like a scavenger for these compounds. Our results indicate that carnosine adduction can be an important detoxification route of α,β -unsaturated aldehydes. Moreover, carnosine adducts quantification may be useful as redox stress indicator in vivo.

O oxigênio molecular eletronicamente excitado ao estado singlete 1Δg (1O2) é bastante reativo frente a moléculas orgânicas com alta densidade eletrônica. As reações do 1O2 com o ácido desoxirribonucleico (DNA) têm sido estudadas extensivamente, uma vez que, provocam lesões que têm sido relacionadas com diversos processos citotóxicos e patológicos. Esse trabalho visou estudar os mecanismos pelos quais ocorrem os processos de oxidação de bases do DNA por 1O2. Para isso, um parâmetro essencial foi a identificação dos produtos de oxidação gerados na reação dessa biomolécula com 1O2. Foi desenvolvida uma fonte de 1O2, com caráter não-iônico, preparada com oxigênio-18 molecular e a N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\'-(1 ,4-naftilideno) dipropanamida (DHPN18O2 ). A fonte é capaz de gerar 1O2 isotopicamente marcado (18[1O2]). A incubação de DNA de timo de bezerro e células de fibroblastos com os endoperóxidos hidrofílicos do 3,3\'-(1 ,4-naftilideno)dipropanoato de sódio (NDPO2) e da N, N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\' -( 1,4-naftilideno )dipropanamida (DHPNO2), como fontes puras de 1O2, mostrou que a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-desoxiguanosina (8-oxodGuo) é a lesão majoritária. Quando o DHPNO2 foi usado, níveis mais altos de 8-oxodGuo foram detectados devido ao seu maior rendimento de formação de 1O2 e por ser capaz de penetrar em células. O uso do DHPN 18O2 na incubação de células demonstrou que o 1O2 lesa diretamente o DNA nuclear e forma 8-oxodGuo com oxigênio-18 incorporado. A identificação dos principais produtos de oxidação da 8-oxodGuo por 1O2 ou 18[1O2] foi feita usando análises de HPLC e espectrometria de massas em tandem com ionização por electrospray. Dessa forma, a imidazolona, oxazolona e os diastereoisômeros da espiroiminodihidantoína marcados com oxigênio-18 foram detectados. Além disso, foi caracterizado um nucleosídeo modificado que exibe as características da guanidinohidantoína oxidada. O uso do EAS para captação de 1O2 em sistemas aquosos e detecção do produto EASO2 por HPLC e espectrometria de massas possibilitou mostrar que a decomposição espontânea de ONOO- não gerava 1O2. O trabalho desenvolvido contribuiu na elucidação de algumas propostas fundamentais para esclarecer os mecanismos que envolvem a geração do 1O2 e sua interação com o DNA. A compreensão desses processos é importante para desvendar fenômenos biológicos importantes como envelhecimento e câncer. / Singlet oxygen (1O2) exhibits a substantial reactivity towards electron-rich organic molecules. Since DNA damage has been related to aging, cancer and other cytotoxic effects, its reaction with 1O2 have been extensively studied. Although, the mechanism and products of these reactions are not yet completely elucidated. The aim of the present work was to study the mechanism of DNA oxidation by 1O2. Emphasis was placed on the identification of the main products generated by the reaction of 1O2 with DNA. For this purpose, we developed a water-soluble naphthalene endoperoxide, the DHPN18O2, whose thermodecomposition leads to the formation of isotopically labeled singlet oxygen (18[1O2]). Calf thymus DNA and fibroblast cells were incubated with the hydrophilic endoperoxides NDPO2 and DHPNO2, as chemical generators of pure 1O2. It was found that 8-oxodGuo is the major 1O2-mediated DNA damage product. In order to demonstrate that 1O2 is directly involved in the formation of 8-oxodGuo, the DHPN18O2 was used. Incubation of the cells with such a generator of 18[1O2] resulted in the formation of 18O-labeled 8-oxodGuo in the nuclear DNA, clearly demonstrating that 1O2, when released within cells, is able to directly oxidize cellular DNA. The qualitative identification of the 1O2-oxidation products of 8-oxodGuo was achieved using HPLC coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry. Thus, the [18O]-labeled and unlabeled imidazolone, oxazolone, together with the diastereoisomeric spiroiminodihydantoin nucleosides, were detected as the main degradation products. In addition, a modified nucleoside that exhibits similar features than those of the oxidized guanidinohydantoin molecule was also produced. In this way, we contributed in the elucidation of some proposals of great importance to clarify the mechanisms that are involved in the interaction of 1O2 with DNA.

[pt] Um grande vazamento de óleo bruto ocorreu na costa brasileira em 2019 afetando uma extensão de 4.334 km de faixa litorânea, 11 estados e várias localidades. Com isso, moradores locais entraram em contato direto com óleo cru ficando expostos à contaminação por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA). Os HPA são compostos orgânicos carcinogênicos de origem petrogênica e pirogênica, que são ubíquos e persistentes. Quando seres humanos são expostos a esses contaminantes, o organismo pode metabolizar e gerar metabólitos desses HPA com prováveis efeitos negativos à saúde humana. Com isso, este trabalho visou analisar a exposição de uma comunidade de pescadores (localizada em Canavierias, BA) aos HPA provindos de derrames de petróleo através da análise de metabólitos de HPA em urina. Para isso, as 44 amostras foram extraídas por extração em fase sólida (SPE) e analisadas por cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas triplo quadrupolo (HPLC-MS/MS). Este trabalho também contempla a comparação de diferentes métodos de extrações em 18 amostras de urina selecionadas. No Centro de Pesquisas, Desenvolvimento e Inovação Leopoldo Américo Miguez de Mello (CENPES) realizou-se extração em fase sólida e a extração líquido-líquido, enquanto na PUC-Rio foi realizada a extração por SPE. Os resultados referentes às 44 amostras analisada na PUC-Rio, demonstraram que 4 dos 11 metabólitos de interesse foram identificados e quantificados. Para o 1-OH-Nap a faixa de concentração foi (menor que LQ – 44 n mL(-1) ), (menor que LQ-21 ng mL(-1) ) para o 2-OHNap, (menor que LQ -5,4 ng mL(-1) ) para o 3,9-OH-Phe e (menor que LQ- 0,76 ng mL(-1) ) para o 6-OH-Chr. Ao comparar os resultados obtidos com trabalhos da literatura, observou-se que os moradores da comunidade de Canavieiras apresentaram valores baixos de concentração dos metabólitos que foram quantificados. Mesmo assim, é importante a existência de trabalhos voltados para o monitoramento destes compostos já que não somente o ambiente como também apresentam-se como um risco à saúde humana. / [en] A major crude oil spill occurred off the coast of Brazil in 2019 affectinga 4,334 km stretch of coastline, 11 states and several localities. As a result,residents came into direct contact with crude oil and were exposed tocontamination by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). PAHs arecarcinogenic organic compounds of petrogenic and pyrogenic origin, whichare ubiquitous and persistent. When humans are exposed to thesecontaminants, the organism can metabolize and generate metabolites ofthese PAHs with probable negative effects on human health. Therefore,this work aimed to analyze the exposure of a fishing community (located inCa-navierias, BA) to PAHs from oil spills through the analysis of PAHmetabolites in urine. For this, the 44 samples were extracted by solid phaseextraction (SPE) and analyzed by liquid chromatography coupled to triplequadrupole mass spectrometer (HPLC-MS/MS). This work also includes thecomparison of different extraction methods in 18 selected urine samples.Solid phase extraction and liquid-liquid extraction were performed at theLeopoldo Américo Miguez de Mello Research, Development and InnovationCenter (CENPES), while SPE extraction was performed at PUC-Rio. Theresults for the 44 samples analyzed at PUC-Rio showed that 4 of the 11metabolites of interest were identified and quantified. For 1-OH-Nap theconcentration range was (less than LQ - 44 n mL(-1)), (less than LQ-21 ng mL(-1)) for 2-OH-Nap,(less than LQ -5.4 ng mL(-1)) for 3,9-OH-Phe and (less than LQ- 0.76 ng mL(-1)) for 6-OH-Chr.When comparing the results obtained with literature works, it was observedthat the residents of the community of Canavieiras had low concentrationvalues of the metabolites that were quantified. Even so, it is important theexistence of works focused on the monitoring of these compounds since notonly the environment but also present themselves as a risk to human health.

A ciclobenzaprina é um relaxante muscular de ação central estruturalmente similar aos antidepressivos tricíclicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a bioequivalência de comprimidos contendo 10 mg de cloridrato de ciclobenzaprina em voluntários sadios. O estudo de bioequivalência entre o produto teste (Miosan®) e referência (Flexeril®) foi do tipo randomizado, aberto e cruzado. Os produtos foram administrados por via oral aos voluntários em dose única de 10 mg de cloridrato de ciclobenzaprina. Amostras de sangue foram coletadas até 240 horas após a administração do fármaco e quantificadas por método previamente validado através de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um detector de massas. As curvas médias de decaimento plasmático dos produtos teste (Miosan®) e referência (Flexeril®) foram semelhantes ASC0-t (teste: 193,00 ngxh/mL; referência: 191,66 ngxh/mL) e ASC0∞ (teste: 211,34 ngxh/mL; referência: 209,35 ngxh/mL). Assim como os parâmetros farmacocinéticos relativos à absorção de ciclobenzaprina, Cmax (teste: 7,16 ng/mL; referência: 6,95 ng/mL), tmax (teste: 4,61 h; referência: 4,48 h), Ka (referência: 0,79; teste: 0,67) e t(1/2)a (referência: 1,79 h; teste: 2,02 h). Os parâmetros farmacocinéticos relativos à eliminação plasmática de ciclobenzaprina Cl (teste: 31,15 L/h; referência: 31,73 L/h), Vd (teste: 1378,54 L e referência (1357,87 L), kß (referência: 0,08; teste: 0,08), t(1/2)ß (referência: 9,43 h; teste: 9,20 h), k&#947 (referência: 0,02; teste: 0,02) e t(1/2)&#947 (referência: 32,92 h; teste: 31,67 h) também apresentaram-se semelhantes entre os dois produtos. A análise multivariada realizada por meio da análise de variância (ANOVA), para a avaliação dos efeitos produto, grupo e período, revelou a ausência destes efeitos, indicando que o delineamento do estudo foi adequado. Os resultados do intervalo de confiança (I.C. 90 %) para a razão de Cmax (93,0 % - 112,0 %), ASC0-t(92,6 % - 111,1 %) e ASC0&#8734 (93,1 % - 110,4 %), encontram-se dentro dos limites estabelecidos pela ANVISA e FDA (80 - 125 %). A análise estatística dos parâmetros Cmax, ASC0-t e ASC0-&#8734 indicam que não há diferenças entre os dois produtos contendo 10 mg de cloridrato de ciclobenzaprina. Com base nos resultados deste estudo, conclui-se que os produtos avaliados são bioequivalentes e podem ser considerados intercambiáveis na terapêutica. / Cyclobenzaprine is a centrally acting muscle relaxant that has similarity with a tricyclic antidepressant. The purpose of this study was to evaluate the bioequivalence of two brands of cyclobenzaprine 10 mg tablets in healthy volunteers. The procedure of bioequivalence between test product (Miosan®) and reference product (Flexeril®) was a randomized, open and crossover study. The products were administered in a single oral dose of 10 mg of cyclobenzaprine hydrochloride to healthy volunteers. Blood samples were collected until 240 hours after administration and quantified by validated method using high-pressure liquid chromatography with mass spectrometric detection. The average plasmatic decay curves of test (Miosan&#174) and reference (Flexeril&#174) products were similar ASC0-t (test: 193,00 ngxh/mL; reference: 191,66 ngxh/mL), in the same way that absorption parameters Cmax (test: 7,16 ng/mL; reference: 6,95 ng/mL), tmax (test: 4,61 h; reference: 4,48 h), Ka (reference: 0,79; test: 0,67) e t(1/2)a (reference: 1,79 h; test: 2,02 h). The elimination parameters Cl (test: 31,15 L/h; reference: 31,73 L/h), Vd (test: 1378,54 L e reference (1357,87 L), k&#914 (reference: 0,08; test: 0,08), t(1/2)&#946 (reference: 9,43 h; test: 9,20 h), k&#947 (reference: 0,02; test: 0,02) e t(1/2)&#947 (reference: 32,92 h; test: 31,67 h) were similar between products too. The multivariate analysis accomplished trough analysis of variance (ANOVA), for assessment of product, group and period effects, revealed the absence of any of these effects in the present study, indicating that the crossover design was properly performed. The 90 % confidence intervals for the ratio of Cmax(93,0 % - 112,0 %), AUC0-t(92,6 % - 111,1 %) and AUC0&#8734 (93,1 % - 110,4 %) values for the test and reference products are within the 80 - 125 % interval proposed by ANVISA e FDA. Statistical analysis of Cmax, AUC0-t e AUC0-&#8734 parameters indicated no significant difference between two brands of 10 mg cyclobenzaprine hydrochloride products. Based in the results of this study, we can conclude that the two products are bioequivalent and can be considered interchangeable in the medical practice.

A ondansetrona (1,2,3,9-tetrahidro-9-metil-3-[(2-metil-1H-imidazol-1-il)metil]-4H-carbazol-ona) é o primeiro fármaco da classe dos antagonistas seletivos dos receptores de serotonina 5-HT3. É utilizada na prevenção de náusea e vômito induzidos por agentes quimioterápicos. O objetivo deste estudo foi avaliar a equivalência terapêutica através da análise da bioequivalência de dois produtos contendo 8 mg de ondansetrona, sendo um sob a forma de comprimidos de liberação convencional e outro sob a forma de comprimidos de desintegração oral, produzidos por laboratórios distintos. O ensaio de bioequivalência entre o produto teste (Vonau® flash) e o produto referência (Zofran®) foi do tipo randomizado, cruzado e aberto. Os produtos foram administrados por via oral aos voluntários em dose única de 8 mg de ondansetrona. Amostras de sangue foram coletadas até 24 horas após a administração e analisadas através de método de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um detector de massas. As curvas médias de decaimento plasmático dos produtos teste (Vonau® flash) e referência (Zofran®) e as médias dos parâmetros farmacocinéticos Cmax (referência: 31,88 ng/mL; teste: 30,42 ng/mL); tmax (referência: 1,99 h; teste: 2,15 h), ASC0-t (referência: 227,66 ng×h/mL; teste: 223,68 ng×h/mL) e ASC0- (referência: 252,76 ng×h/mL; teste: 248,22 ng×h/mL) apresentaram-se semelhantes. O intervalo de confiança 90 % para a razão de Cmax (87,5 % - 103,8 %), ASC0-t (89,3 % - 107,2 %) e ASC0- (89,7 106,0 %) encontram-se entre 80 125 %, dentro dos limites propostos pela ANVISA. Conclui-se que os produtos teste e referência são bioequivalentes, podendo ser administrados de forma intercambiável, sem prejuízo do efeito terapêutico. / Ondansetron (1,2,3,9-tetrahydro-9-methyl-3-[2-methyl-1H-imidazol-1yl)methyl]-4H-carbazol-one is the first drug of the class of antagonists selective receptor 5-HT3. It is used in the prevention of nausea and vomiting caused by chemotherapy agents. The purpose of this study was to evaluate the therapeutic equivalence examining the bioequivalence of two products containing 8 mg ondansetron, one in the conventional release tablet, and other in oral disintegration tablet produced by different laboratories. The bioequivalence assay between the test product (Vonau® flash) and reference product (Zofran®) was randomized, crossover and open study. The medication was administered in a single dose of 8 mg of ondansetron. Blood samples were collected until 24 hours after administration and analyzed using a validated high-performance liquid chromatographic method with mass spectrometer detection. The average plasmatic decay curves obtained for the test product (Vonau® flash) and reference product (Zofran®) and the averages of pharmacokinetics parameters Cmax (reference: 31.88 ng/mL; test: 30.42 ng/mL); tmax (reference: 1.99 h; test: 2.15 h), AUC0-t (reference: 227.66 ng×h/mL; test: 223.68 ng×h/mL) and AUC0- (reference: 252.76 ng×h/mL; test: 248.22 ng×h/mL) has been similar. The 90 % confidence intervals for the ratio of Cmax (87.5 % - 103.8 %), AUC0-t (89.3 % - 107.2%) and AUC0- (89.7 % - 106.0 %) values for the test and reference products are within the 80 125 % interval proposed by ANVISA. It was concluded that the test and reference products are bioequivalent and can be considered interchangeable in medical practice, without prejudice to the therapeutic effect.