Les zones polaires sont les premières à subir les effets du réchauffement climatique.L'estimation de l‟impact physiologique d‟une augmentation de température sur les espèces de ces régions est capitale afin de prédire l'évolution des écosystèmes polaires. Les conséquences physiologiques de l‟augmentation des températures peuvent affecter les capacités de résistance et de survie des organismes. Le krill constitue un maillon clé des écosystèmes polaires, il est aussi à la base de la chaine trophique de ces régions. Dans ce contexte, une étude comparative de la thermotolérance de trois espèces de krill polaires a été effectuée. Deux espèces d‟Antarctique Euphausia superba et Euphausia crystallorophias, et une espèce d‟Arctique, Thysanoessa inermis. La détermination de la température limite de tolérance (CT50) a été estimée sur ces 3 espèces. E. superba et T. inermis présentent des tolérances thermiques similaires, alors que E. crystallorophias a une CT50 légèrement inférieure. Cinq isoformes d‟Hsp70 ont été caractérisées, pour chaque espèce. Leur expression génique a été suivie au cours d‟augmentations de la température du milieu. Le suivi de ces biomarqueurs a permis d‟estimer la température limite à laquelle les premiers dommagescellulaires apparaissent. Les cinétiques d‟expressions de chaque espèce se sont révéléesdifférentes : une forte réponse Hsp70 a été observée chez T. inermis, alors que chez E.crystallorophias celle–ci est beaucoup plus faible. Aux mêmes températures E .superba ne développe pas de réponse Hsp70, malgré sa forte thermotolérance. La multiplication des expériences de choc thermique sur cette espèce (intensité et durée) n'a pas révélé de réponseHsp70, mais confirmé sa grande thermotolérance pour un organisme antarctique. / Polar regions are the first to be impacted by global warming. The physiological impact appraisal of a temperature increase over local species is critical to foresee future evolutions of polar ecosystems. Physiological consequences of temperature rises can affect organisms both in their hardness and survival. Krill stands as a key component for polar ecosystems and therefore constitutes the core diet of local predators. In such context, a thermal tolerance comparative analysis of three distinct polar krill species has been carried out: two Antarctic species Euphausia superba and Euphausia crystallorophias, and one Arctic species,Thysanoessa inermis. The determination of thermal tolerance (CT50) was conducted on these three species. E. superba and T. inermis analysis showed similar thermal tolerances, while E.crystallorophias CT50 was slightly lower. Five isoforms of Hsp70 have been characterized foreach species. Their gene expression has been monitored through temperature increases of their environment. This biomarkers monitoring allowed an estimation of the critical temperature at which cellular damages appear. Kinetic expressions vary for each species: a strong response was observed in Hsp70 T. inermis, whereas response is much lower in E.crystallorophias. For similar temperatures, E .superba does not provide any Hsp70 response,despite its high thermal tolerance. The accumulation of heat shock experiments on this species, in intensity and duration, still did not provide any Hsp70 response, although it confirmed its highly noticeable heat tolerance for an Antarctic organism.

En la acuicultura intensiva existe una práctica creciente encaminada a maximizar tanto el crecimiento como la productividad de los peces mediante altas densidades de producción, dietas altamente energéticas y elevados regímenes de alimentación. Sin embargo, debido al interés en aumentar los mecanismos de control y mejora del bienestar animal, es necesario encontrar nuevos marcadores que evalúen la actividad piscícola. En este sentido, el uso de marcadores mitocondriales de estrés oxidativo y lipotoxicidad constituyen una herramienta indispensable para evaluar los riesgos sobre el bienestar de los peces. Es importante reseñar que cada uno de estos marcadores ofrece una información complementaria e integradora de especial interés cuando se considera una determinada especie, tejido y factor de estrés. Uno de esos mecanismos es la chaperona mitocondrial de la familia de las proteínas de choque térmico 70 (proteína regulada por la glucosa 75, GRP75/mortalina), que protege a los componentes mitocondriales de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Un segundo mecanismo es el llevado a cabo por las proteínas desacopladoras (UCP), una familia de transportadores mitocondriales que desacoplan la fosforilación oxidativa mediante la descarga neta del gradiente de protones y la disminución de la producción de ROS en un ambiente rico en ácidos grasos. La caracterización molecular de la GRP75/mortalina y las UCPs en dorada (Sparus aurata) reveló un alto grado de conservación de los rasgos estructurales y parentesco evolutivo de estas familias de proteínas. En el caso de la GRP75/mortalina, esto permitió el uso de anticuerpos heterólogos para el análisis de expresión a nivel de proteína. Sin embargo, para la UCP1 y UCP3 fue necesario la evaluación de la actividad mediante medidas de respiración mitocondrial y la producción de anticuerpos específicos. / Bermejo Nogales, A. (2012). MARCADORES MITOCONDRIALES DE ESTRÉS OXIDATIVO Y LIPOTOXICIDAD EN DORADA (Sparus aurata) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/15189 / Palancia

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Hsp70 molecular chaperones protect proteins from aggregation, assist in their native structure formation, and regulate stress responses in the cell. A mechanistic understanding of Hsp70 function will be necessary to explain its physiological roles and guide the therapeutic modulation of various disease states. To this end, several fundamental features of the Hsp70 structure-function relationship are investigated. The central component of Hsp70 chaperone function is its capacity for allosteric signaling between structural domains and tunable binding of misfolded protein substrates. In order to identify a cooperative network of sites that mediates interdomain allostery within Hsp70, a mutational correlation analysis is performed using genetic data. Evolutionarily correlations that describe an allosteric network are validated by examining roles for implicated sites in cellular fitness and molecular function. In a second component of the Hsp70 molecular mechanism, a novel function is discovered for the disordered C-terminal tail. This region of the protein enhances the refolding efficiency of substrate proteins independently of interdomain allostery and is required in the cell upon depletion of compensatory chaperones, suggesting a previously undescribed mode of chaperone action. Finally, experiments are initiated to assess the dynamic assembly of Hsp70 domains in various allosteric states and how domain orientations may be guided through interaction with partner co-chaperone proteins.

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Clostridium difficile, the causative agent of C. difficile infection (CDI), causes hundreds of thousands of hospital-acquired infections in the United States and Canada annually. Furthermore, the prevalence and severity of CDI has been on the rise in developed countries, especially with the appearance of “hypervirulent” strains. Detection of CDI is thus of great importance. Traditional detection methods can be time consuming or lack the desired sensitivity. On the other hand, aptamers pose great prospects as diagnostic and therapeutic agents. Aptamers are nucleic acid ligands with molecular recognition capabilities rivaling those of antibodies. They are obtained by a process of in vitro selection known as systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). However, the current approach may result in aptamers that experience non-specific binding in complex or biological samples. Here, we propose a multiple domain selection (MDS) method for aptamer isolation. This method utilizes independent selections on separate components of a single target in order to obtain uniquely specific aptamers. The aptamers can then be unified into a heterobivalent construct able to recognize two sites on one target. We hypothesize the combined aptamer would result in greater affinity and specificity for the target, resulting in greatly increased aptamer utility in current and future applications. In the current study, we have cloned and purified full length C. difficile DnaK as well as the N-terminal domain (NTD) and C-terminal domain (CTD) of the protein. MDS was performed on each target and the resulting aptamers were combined into a heterobivalent construct. The construct resulted in an approximately 100-fold affinity increase relative to the single aptamer for DnaK, and could detect much smaller quantities of target. Although it experienced low level recognition of high concentrations of purified E. coli DnaK, there was no detectable non-specific binding in several biological samples. / Thesis / Master of Science (MSc)

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En 1977, Carl Woese sépare les procaryotes en deux grands groupes en proposant une nouvelle classification basée sur des critères phylogénétiques. Les Archaea deviennent ainsi un domaine à part entière aux cotés des Bacteria et des Eucarya. Depuis, la compréhension de ce nouveau groupe et de ses relations avec les deux autres domaines, essentielles pour comprendre l’évolution ancienne du vivant, est largement passée par l’étude de leur phylogénie. Presque 40 ans de recherche sur les archées ont permis de faire évoluer leur image : de bactéries vivant dans des milieux spécialisés, souvent extrêmes, on est passé à un domaine indépendant, très diversifié aussi bien génétiquement, métaboliquement ou encore écologiquement. Ces dernières années la barre symbolique de cent génomes complets d’archées séquencés a été franchie et, parallèlement, les projets génomiques et métagénomiques sur des groupes peu caractérisés ou de nouvelles lignées de haut rang taxonomique (e.g. Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, groupe MGC, groupe II des Euryarchaeota, etc.) se sont multipliés. Tout ceci apporte un matériel sans précédent pour l’étude de l’histoire évolutive et de la diversité des Archaea. Les protéines ribosomiques ont été utilisées de façon courante pour inférer la position phylogénétique des nouvelles lignées d’Archaea. Néanmoins, les phylogénies résultantes ne sont pas complètement résolues, laissant des interrogations concernant d’importantes relations de parenté. La recherche de nouveaux marqueurs est donc cruciale et c’est dans ce contexte que mon projet de thèse s’inscrit. À partir de l’analyse des génomes de deux Thaumarchaeota et d’une Aigarchaeota, nous avons identifié 200 protéines conservées et bien représentées dans les différents phyla d’archées. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, ce qui peut apporter un signal phylogénétique complémentaire à celui des marqueurs de type informationnel utilisés par le passé. En plus de confirmer la plupart des relations phylogénétiques inférées à partir de ces derniers (i.e., protéines ribosomiques et sous unités de l’ARN polymérase), l’analyse phylogénétique de ces nouveaux marqueurs apporte un signal permettant une meilleure résolution de la phylogénie des archées et la clarification de certaines relations jusqu’ici confuses. Un certain nombre de ces nouveaux marqueurs sont aussi présents chez les bactéries. Les relations entre les grands phyla d’archées restant encore non résolues, nous avons utilisé ces protéines pour essayer de placer la racine de l’arbre des Archaea en utilisant comme groupe extérieur les bactéries. Nous avons ainsi pu identifier 38 protéines, parmi les 200 sélectionnées précédemment, ayant un signal phylogénétique suffisamment fiable pour cette étude, auxquelles nous avons ajouté 32 protéines ribosomiques universelles. L’utilisation conjointe de ces données nous a permis de placer la racine entre les Euryarchaeota, d’une part, et un groupe rassemblant les Thaumarchaeota, les Aigarchaeota, les Korarchaeota et les Crenarchaeota, d’autre part. Ce nouvel éclairage sur l’évolution ancienne des archées nous a amené à proposer une révision de leur taxonomie avec, principalement, la création du nouveau phylum "Proteoarchaeota" contenant les quatre phyla actuels que nous proposons de rétrograder en classes : Thaumarchaea, Aigarchaea, Korarchaea et Crenarchaea.Finalement, l’analyse des protéines codées dans les trois génomes qui ont servi de point de départ de ma thèse nous a permis de générer une masse considérable de données qui ont révélé des traits particuliers ou encore des histoires évolutives inattendues. Un exemple est l’histoire du complexe formé par la chaperonne DnaK et de ses co-chaperonnes GrpE, DnaJ, et DnaJ-Fer chez les Thaumarchaeota, impliquant plusieurs transferts horizontaux entre les trois domaines du vivant. / In 1977, Carl Woese proposed a new classification of organisms based on phylogenetic criteria where he divided prokaryotes into two major groups. Thus, Archaea were defined as a new domain, together with Bacteria and Eucarya. Since then, the study of this group and its relationships with the two other domains, essential to understand the early evolution of Life, has been largely done through the investigation of its phylogeny. Almost 40 years of research on the archaea have led to a significant evolution of the knowledge on this group: from considering them as bacteria living in specialized environments, most often extreme ones, to defining them as an independent domain, highly diversified in genetic, metabolic and ecological terms. During the last years, the symbolic barrier of 100 complete archaeal genome sequences has been reached and, simultaneously, many genome projects from poorly-known groups or new high-rank lineages (e.g., Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, MGC, group II Euryarchaeota, etc.) have been launched. All this provides unprecedented information to study the evolutionary history of Archaea. Ribosomal proteins have been used recurrently to infer the phylogenetic position of new archaeal lineages. Nevertheless, the resulting phylogenies are not fully resolved and several important nodes remain uncertain. The identification of new phylogenetic markers is therefore crucial. This represents the framework of my PhD thesis project. On the basis of the analysis of the genome sequences of two Thaumarchaeota and one Aigarchaeota, we have identified 200 conserved proteins well represented among the different archaeal phyla. These proteins are involved in a number of cellular functions, thus providing a phylogenetic signal complementary to the one obtained from the informational proteins (i.e., ribosomal proteins and RNA polymerase subunits). The phylogenetic analysis of these new markers has led to a better resolution of the archaeal phylogeny, including several relationships that remained unclear. Several of the new markers are also present in bacteria. Since the relationships among the different archaeal phyla are not yet resolved, we have used those markers to try to place the root of the archaeal phylogeny using the bacterial sequences as outgroup. We have identified 38 proteins among the 200 detected before containing a phylogenetic signal useful for that purpose, to which we have added 32 universal ribosomal proteins. The use of this complete dataset allowed us locating the root between the Euryarchaeota and a large group joining the Thaumarchaeota, Aigarchaeota, Korarchaeota and Crenarchaeota. This new result on the ancient evolutionary history of Archaea has led us to propose a taxonomic revision for this domain, in particular the erection of a new phylum "Proteoarchaeota", containing the current four phyla that we propose to retrograde into classes (Thaumarchaeales, Aigarchaeales, Korarchaeales and Crenarchaeales). Finally, the analysis of the proteins encoded by the three reference genomes at the origin of this work has generated a large amount of data, which reveals particular traits in certain organisms or unexpected evolutionary histories. One example concerns the evolution in Thaumarchaeota of the protein complex composed of the DnaK chaperon and its co-chaperons GrpE, DnaJ, and DnaJ-Fer, which involves several horizontal gene transfer events among the three domains of Life.