Haemophilus influenzae type b (Hib) é uma importante bactéria Gram-negativa causadora de pneumonia, meningite e septicemia em crianças abaixo dos 5 anos de idade. A prevenção contra a doença pode ser alcançada pela imunização da população com vacina conjugada polissacarídeo-proteína, uma vez que a vacina de polissacarídeo não é eficiente. As vacinas conjugadas disponíveis comercialmente custam para o governo brasileiro cerca de US2,7 a dose, sendo necessárias no mínimo 3 doses para imunização completa. O presente estudo desenvolveu um novo método de conjugação de polissacarídeo capsular de Hib (PRP) com toxóide tetânico (TT). O método hidrazona baseia-se em 3 etapas simples: oxidação e derivatização de PRP com espaçador molecular e conjugação com TT na presença de uma carbodiimida e de um éster amino reativo. Após um estudo detalhado de cada etapa do método hidrazona, o novo processo mostrou excelentes resultados de rendimento mesmo após escalonamento. A imunogenicidade e o índice de avidez do conjugado hidrazona foram avaliados e os resultados encontrados foram comparáveis a vacina comercial Hiberix®. A técnica de HPSEC mostrou-se eficaz e o perfil cromatográfico do conjugado hidrazona foi muito similar ao da vacina Hiberix. Finalmente, o novo processo de conjugação de vacina permitiu o desenvolvimento de uma poderosa tecnologia constituindo uma excelente opção para o governo brasileiro. / Haemophilus influenzae type b (Hib) is an important encapsulated bacteria, which causes pneumonia, meningitis and septicaemia in infants. Prevention against infection is achieved by the currently available polysaccharide protein conjugate vaccine. However, due to its high production costs (around U$ 2,7 per dose) this formulation cannot be used in mass immunization programs in Brazil. In the present study, we developed a new method for the conjugation of Hib polysaccharide (PRP) and tetanus toxoid (TT). The hydrazone method is based on 3 singles steps: PRP oxidation, PRP derivatization with linker spacer and conjugation with TT in the presence of carbodiimide and an amino reactive ester. After detailed study of each step of method, the new process showed very good yield of conjugation even when it was scaled-up. The immunogenicity and the avidity index of hydrazone conjugate were evaluated and the results were comparable with those obtained with the commercial vaccine Hiberix®. The HPLC hydrazone profile was very similar to HPLC Hiberix profile. Finally, the new conjugation process allows the development of a powerful vaccine technology, constituting an excellent choice for the brazilian government.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-08T17:19:50Z No. of bitstreams: 1 01d.pdf: 1587828 bytes, checksum: 1a8694d38c20b5c410d6e957fd6a2575 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-08T17:19:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01d.pdf: 1587828 bytes, checksum: 1a8694d38c20b5c410d6e957fd6a2575 (MD5) Previous issue date: 2005-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O objetivo deste trabalho foi aprimorar a qualidadeanalítica do laboratório de Controle Físico-Químico, LAFIQ, de Bio - Manguinhosatravés da implantação de ferramentas que permitam avaliar o desempenho dos resultados do laboratório e criar um modelo de controle. Foram estudados dois métodosde análise: determinação do conteúdo de polissacarídeo na vacina contra Haemophillus influenzaetipo B – Hib que corresponde a categoria de método tipo I, conforme Farmacopéia Americana e da condutividade em água para injetáveis correspondente a categoria de método tipo III. Os parâmetros de validação e adequação dos dois métodos foram estudados e cartas controle foram construídas utilizando os dados das análises de amostras referência realizadas por diversos analistas em dias diferentes. Com parâmetros calculados a partir destas cartas foi possível avaliar quão correto é um resultado comparado ao valor desejado, representado pelo valor da grandeza que está sendo medido. O parâmetro desvio-padrão, e o correspondente intervalo de confiança foram utilizados para medir a dispersão dos resultados através do cálculo das incertezas das medições. Para o método tipo I as estimativas das incertezas padrão combinada e expandida foram u = 0,50 µg / mL e U = 1,00 µg / mL, respectivamente. Foram considerados os parâmetros Reprodutibilidade, a concentração da solução de trabalho, do volume, da pureza do reagente, e da massa, como os que mais contribuírampara a incerteza desta categoria de método. Para o método tipo III foram encontradasas incertezas u = 0,03 µS / cm e U = 0,06 µS / cm, como incertezas padrão combinada e padrão expandida. Os fatores que mais contribuíram na incerteza deste método foram os relacionados a qualificação / calibração do equipamento, a estabilidade da amostra e a precisão do procedimento dos analistas. O uso destes recursos estatísticos desenvolvidos e estudados na presente dissertação levarão ao aprimoramento do controle da qualidade dos imunobiológicos garantindo a qualidade do trabalho dos analistas e a maior confiabilidade dos resultados fornecidos pelo LAFIQ. / The objective of this work was to improve the quality of the Bio-Manguinhos’ Laboratory of Physico-Chemical Quality Control using tools that allow to evaluate the analytical performance. The work was carried out studying two analytical methodologies: determination of the content of polysaccharide in Haemophillus influenzaetype b vaccine, that is type I according to American Pharmacopeia’s and conductivity measurement in injectable waters, type III. In thisstudy it was suggested a model that allows to guarantee the quality of results emitted by the Control Laboratory. The validation of the chosen methods and the construction of chart controls were made by evaluating the validation parameters, data for reference sample and estimating the uncertainty of the measurements. This last one is considered the quantified attribute that allows estimating if the result is correct comparedto the certified value. The uncertainty corresponds to the range of the established confidence that means the dispersion of the results. All these statistics tools will improve the implementation of a Quality System. For the method type I the uncertainty standard and expanded were u = 0,50 µg / mL and U = 1,00 µg / mL, respectively. The calculations of themeasurement uncertainty were performed considering the follow sources: Reproducibility, concentration of the standard solutions, volume, purity of reagent, and mass. Forthe method type III, the values were u = 0,02 µS/cm and U = 0,06 µS/cm. The parameters that contributed to the uncertainty of this method were: the behavior of the sample, the qualification and performance of equipment used and the stability of water samples. For both studied analytical methods the main contribution for the analytical results uncertainties was the precision of the analytical procedures. The use of these statistic tools willimprove the confidence on the analytical results from the LAFIQ.

Introdução: O Haemophilus influenzae type b (Hib) é a primeira maior causa de meningites e pneumonias provocadas por bactérias encapsuladas. Trabalhos revelam que anticorpos maternos, séricos e secretores, podem proteger recém nascidos (RN) destes patógenos encapsulados e contribuem para a maturação do sistema imune do infante. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo investigar a transferência materno-infantil de anticorpos anti-Hib em mães vacinadas e que não receberam a vacina anti-Hib. Materiais e Métodos: Nós avaliamos 29 mulheres saudáveis, das quais 13 foram vacinadas e 16 não receberam a vacina ActHib®. Destas mães foram obtidas amostras de sangue periférico e do cordão umbilical, colostro e leite, sendo determinadas as imunoglobulinas totais (lgG e IgA) e suas subclasses (IgG1 e 2) por Imunodifusão Radial Quantitativa (IDR) e nefelometria. A concentração de anticorpos IgG, as subclasses (lgG1 e 2) e IgA anti-Hib foram analisados por ensaio imunoenzimático (ELlSA), também utilizado para determinar a avidez dos anticorpos IgG e IgA anti-Hib. Avaliação qualitativa destes anticorpos foi realizada a partir de ensaios de immunoblotting (IB). Resultados: As amostras maternas de mães vacinadas não apresentaram diferenças quantitativas de imunoglobulinas secretoras (lgA), séricas (lgG) e suas subclasses (lgG1 e 2) totais, comparadas às amostras de mães que não receberam a vacina anti-Hib. O grupo vacinado mostrou maior concentração e avidez de anticorpos específicos para o Hib quando relacionados ao grupo de mães não vacinado. Os soros de cordões umbilicais de mães imunizadas apresentaram menor taxa de passagem transplacentária que os cordões de mães não vacinadas. Em ambos os grupos, as amostras de colostro apresentaram maior concentração de imunoglobulinas totais e específicas para o Hib que as amostras de leite. O 18 revelou o mesmo padrão de reconhecimento antigênico para o Hib entre as amostras maternas, nas duas populações. Conclusão: Os resultados revelaram que o perfil de resposta humoral de mães vacinadas pode proteger mais o infante que as mães não vacinadas, pois o primeiro grupo transferiu maior quantidade de anlicorpos com melhor avidez para a criança, conferindo proteção eficaz com relação às doenças causadas por Hib. / Background: Haemophilus influenzae, type b (Hib) has been one of the major causes of bacterial meningitis and pneumonia. Recent works show that maternal, seric and secretory antibodies, may protect the newborn and contribute the maturation of the infant immune system. Objective: The present study has as aim to investigates the maternal-infantile transfer of anti-Hib antibodies in immunized and not immunized mothers\' with anti-Hib vaccine. Material and Methods: We evaluated 29 healthy women, from whitch 13 mothers were immunized and 16 not immunized mothers with the ActHib® vaccine. From these mothers it were obtained peripheric and cord serum, colostrum and milk samples, the total immunoglobulin (IgG and IgA) and its subclass (lgG1 and IgG2) was determined by Quantitative Radial Immunodiffusion (IDR) and nephelometry. The concentration of anti-Hib IgG, subclass (lgG1 IgG2) and IgA antibodies were analyzed by immunoenzymatic assay (ELlSA), it also were utilized to determine the antibodies avidities\'. Qualitative evaluation these antibodies were determined by Immunoblotting assays (IB). Results: The results didn\'t show difference between maternal samples of the immunized and not immunized mothers in the concentration of the total secretory and seric imunoglobulins as well as its total immunoglobulins subclasses. The immunized set showed higher avidity and anti-Hib antibody levels comparing to the non-immunized mother sets. The umbilical cord serums\' from immunized mothers revealed lower rate of placental transfer than the cord serum of not immunized mothers. In both sets, the colostrum sample showed higher antibody levels comparing to the milk samples. IB revealed the same recognition pattern of Hib antigens between mother and cord serum IgG and colostrum and milk IgA, in both populations. Conclusion: The results shows that the antibodies profile response of the immunized mother can protect more the infant than the not immunized mother, because the first set transported higher quantity of antibodies with better avidity for the children, these antibodies confere an efficient protection to infections provoked by Hib.

Haemophilus influenzae tipo b é uma bactéria Gram-negativa, patogênica causadora de meningites em crianças. A cápsula polissacarídica (PSb) é o principal fator de virulência e é usado como antígeno vacinal. O método clássico de purificação do PSb envolve várias etapas de precipitação com etanol, fenol e detergente catiônico (inflamável, corrosivo e tóxico), e etapas de ultracentrifugação. O objetivo deste estudo foi substituir total ou parcial as precipitações e/ou uso das centrífugas por cromatografia, digestão enzimática, microfiltração e ultrafiltração tangencial. As cromatografias de troca iônica e de filtração em gel não apresentaram boas purificações, entretanto a hidrofóbica pode eliminar as proteínas contaminantes. As precipitações com etanol foram necessárias para obter a pureza requerida. O etanol de alguma forma favoreceu a ação enzimática e facilitou a posterior ultrafiltração. A separação com etanol em fibra-oca de microfiltração tangencial mostrou melhores purificações do que a centrifugação, mas com uso repetido verificou-se redução na eficiência. / Haemophilus influenzae type b is Gram-negative pathogenic bacterium cause meningitis in children. The capsular polysaccharide (PSb) is the main virulence factor and it is used as vaccine antigen. The classical PSb purification process includes ethanol, phenol and cationic detergent precipitations (explosion prone, corrosive, toxic) and ultracentrifugation steps. The aim of this work was to replace total or partial ethanol precipitations steps and/or elimination of centrifugation by chromatography methods, enzymatic digestion and ultrafiltration (UF) or microfiltration. The results have showed that ion exchange chromatography and gel filtration did not result in good purification, however the hydrophobic can be used for proteins elimination. The ethanol precipitation steps are necessary to achieve the required purity of PSb. In some way ethanol contributed for enzymes action and further improvements in the UF. The ethanol separation with hollow fiber microfiltration exhibited better purification than centrifugation, but after some uses the efficiency has reduced.

Introdução: O Haemophilus influenzae type b (Hib) é a primeira maior causa de meningites e pneumonias provocadas por bactérias encapsuladas. Trabalhos revelam que anticorpos maternos, séricos e secretores, podem proteger recém nascidos (RN) destes patógenos encapsulados e contribuem para a maturação do sistema imune do infante. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo investigar a transferência materno-infantil de anticorpos anti-Hib em mães vacinadas e que não receberam a vacina anti-Hib. Materiais e Métodos: Nós avaliamos 29 mulheres saudáveis, das quais 13 foram vacinadas e 16 não receberam a vacina ActHib®. Destas mães foram obtidas amostras de sangue periférico e do cordão umbilical, colostro e leite, sendo determinadas as imunoglobulinas totais (lgG e IgA) e suas subclasses (IgG1 e 2) por Imunodifusão Radial Quantitativa (IDR) e nefelometria. A concentração de anticorpos IgG, as subclasses (lgG1 e 2) e IgA anti-Hib foram analisados por ensaio imunoenzimático (ELlSA), também utilizado para determinar a avidez dos anticorpos IgG e IgA anti-Hib. Avaliação qualitativa destes anticorpos foi realizada a partir de ensaios de immunoblotting (IB). Resultados: As amostras maternas de mães vacinadas não apresentaram diferenças quantitativas de imunoglobulinas secretoras (lgA), séricas (lgG) e suas subclasses (lgG1 e 2) totais, comparadas às amostras de mães que não receberam a vacina anti-Hib. O grupo vacinado mostrou maior concentração e avidez de anticorpos específicos para o Hib quando relacionados ao grupo de mães não vacinado. Os soros de cordões umbilicais de mães imunizadas apresentaram menor taxa de passagem transplacentária que os cordões de mães não vacinadas. Em ambos os grupos, as amostras de colostro apresentaram maior concentração de imunoglobulinas totais e específicas para o Hib que as amostras de leite. O 18 revelou o mesmo padrão de reconhecimento antigênico para o Hib entre as amostras maternas, nas duas populações. Conclusão: Os resultados revelaram que o perfil de resposta humoral de mães vacinadas pode proteger mais o infante que as mães não vacinadas, pois o primeiro grupo transferiu maior quantidade de anlicorpos com melhor avidez para a criança, conferindo proteção eficaz com relação às doenças causadas por Hib. / Background: Haemophilus influenzae, type b (Hib) has been one of the major causes of bacterial meningitis and pneumonia. Recent works show that maternal, seric and secretory antibodies, may protect the newborn and contribute the maturation of the infant immune system. Objective: The present study has as aim to investigates the maternal-infantile transfer of anti-Hib antibodies in immunized and not immunized mothers\' with anti-Hib vaccine. Material and Methods: We evaluated 29 healthy women, from whitch 13 mothers were immunized and 16 not immunized mothers with the ActHib® vaccine. From these mothers it were obtained peripheric and cord serum, colostrum and milk samples, the total immunoglobulin (IgG and IgA) and its subclass (lgG1 and IgG2) was determined by Quantitative Radial Immunodiffusion (IDR) and nephelometry. The concentration of anti-Hib IgG, subclass (lgG1 IgG2) and IgA antibodies were analyzed by immunoenzymatic assay (ELlSA), it also were utilized to determine the antibodies avidities\'. Qualitative evaluation these antibodies were determined by Immunoblotting assays (IB). Results: The results didn\'t show difference between maternal samples of the immunized and not immunized mothers in the concentration of the total secretory and seric imunoglobulins as well as its total immunoglobulins subclasses. The immunized set showed higher avidity and anti-Hib antibody levels comparing to the non-immunized mother sets. The umbilical cord serums\' from immunized mothers revealed lower rate of placental transfer than the cord serum of not immunized mothers. In both sets, the colostrum sample showed higher antibody levels comparing to the milk samples. IB revealed the same recognition pattern of Hib antigens between mother and cord serum IgG and colostrum and milk IgA, in both populations. Conclusion: The results shows that the antibodies profile response of the immunized mother can protect more the infant than the not immunized mother, because the first set transported higher quantity of antibodies with better avidity for the children, these antibodies confere an efficient protection to infections provoked by Hib.

Haemophilus influenzae tipo b é uma bactéria Gram-negativa, patogênica causadora de meningites em crianças. A cápsula polissacarídica (PSb) é o principal fator de virulência e é usado como antígeno vacinal. O método clássico de purificação do PSb envolve várias etapas de precipitação com etanol, fenol e detergente catiônico (inflamável, corrosivo e tóxico), e etapas de ultracentrifugação. O objetivo deste estudo foi substituir total ou parcial as precipitações e/ou uso das centrífugas por cromatografia, digestão enzimática, microfiltração e ultrafiltração tangencial. As cromatografias de troca iônica e de filtração em gel não apresentaram boas purificações, entretanto a hidrofóbica pode eliminar as proteínas contaminantes. As precipitações com etanol foram necessárias para obter a pureza requerida. O etanol de alguma forma favoreceu a ação enzimática e facilitou a posterior ultrafiltração. A separação com etanol em fibra-oca de microfiltração tangencial mostrou melhores purificações do que a centrifugação, mas com uso repetido verificou-se redução na eficiência. / Haemophilus influenzae type b is Gram-negative pathogenic bacterium cause meningitis in children. The capsular polysaccharide (PSb) is the main virulence factor and it is used as vaccine antigen. The classical PSb purification process includes ethanol, phenol and cationic detergent precipitations (explosion prone, corrosive, toxic) and ultracentrifugation steps. The aim of this work was to replace total or partial ethanol precipitations steps and/or elimination of centrifugation by chromatography methods, enzymatic digestion and ultrafiltration (UF) or microfiltration. The results have showed that ion exchange chromatography and gel filtration did not result in good purification, however the hydrophobic can be used for proteins elimination. The ethanol precipitation steps are necessary to achieve the required purity of PSb. In some way ethanol contributed for enzymes action and further improvements in the UF. The ethanol separation with hollow fiber microfiltration exhibited better purification than centrifugation, but after some uses the efficiency has reduced.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30 / Introdução: Apesar de relatos sobre a Atenção Integrada às Doenças Prevalentes na Infância (AIDPI) melhorar a assistência à saúde da criança até cinco anos, não são identificados estudos direcionados ao componente peri-neonatal dessa estratégia. Objetivo: avaliar, após a capacitação em AIDPI Neonatal, o conhecimento e a percepção de médicos e enfermeiros quanto à assistência à gestante e à criança do nascimento até os dois meses de vida, e sua aplicabilidade prática em uma região da Amazônia. Método: estudo de coorte constituída de 31 médicos e 61 enfermeiros provenientes de 24 municípios, que participaram de sete capacitações em seis Pólos Regionais de Saúde no interior do Pará, Amazônia, realizado de abr/2006 a dez/2008. O estudo foi conduzido em duas fases, consistindo a 1ª fase na aplicação presencial de cinco questionários antes (T1) e imediatamente após 24 horas (T2) de capacitação em AIDPI Neonatal, conforme diretrizes da OPAS em 2007, adaptadas ao nosso meio. A 2ª fase compreendeu a aplicação presencial dos mesmos questionários aos 92 profissionais, em média 16 (14-20) meses após a 1ª fase (T3). Os questionários abordaram dados demográficos dos profissionais em T1, o conhecimento sobre assistência à gestante, reanimação neonatal, puericultura e doenças até dois meses em T1, T2 e T3, além da avaliação da capacitação em T2 e da percepção das condições de assistência no município e no local de prática clínica em T1 e T3. Para estimar as diferenças entre os tempos e as categorias profissionais foram criados escores de zero (inadequação completa) a 100 (adequaçãocompleta) comparados por meio da análise de variância com medidas repetidas. Resultados: os 92 profissionais caracterizaram-se por ser do sexo feminino (83%), nascidos (74%) e graduados (79%) no Pará, atender crianças duas ou mais vezes por semana (86%) e possuir pós-graduação (63%). Os médicos eram graduados há 17 (1-35) anos e os enfermeiros há nove (0-31) anos (p<0,001). Os primeiros relataram maior atuação em pediatria, e qualificação específica, com residência ou especialização, do que os últimos. Observou-se variação do conhecimento de acordo com o tempo (T1, T2 e T3) e a profissão (médicos>enfermeiros: p<0,001). Entre T1 e T2 constatou-se acréscimo deconhecimento dos profissionais sobre a assistência à gestante (p=0,026), reanimação neonatal (p<0,001), puericultura (p<0,001) e doenças até dois meses (p<0,01). Tal conhecimento perdurou, no mínimo, após 16 meses da capacitação nas áreas de reanimação neonatal (p=0,028) e doenças até dois meses (p<0,001). A capacitação teve avaliação positiva dos profissionais (94%) que perceberam melhora na prática clínica no seu local de trabalho (p<0,001), porém sem relato de alteração nas condições de saúde do município (p=0,066) entre T1 e T3. Conclusão: os médicos e enfermeiros apresentaram acréscimo, no mínimo por 16 meses, no conhecimento sobre a assistência à gestante e à criança até dois meses, além de perceberem melhora em sua condição de prática clínica após a capacitação em AIDPI Neonatal. Essa capacitação pode servir de modelo a ser aplicado em outras regiões com semelhante contexto epidemiológico / Objective: to assess knowledge and perception of professionals about care of pregnant women and children to two months of life, after training in Neonatal Integrated Management of Childhood Illness (IMCI), and its practical applicability in the Amazon Region. Method: a cohort study comprising 92 professionals who participated in seven Neonatal IMCI training courses in Para, from April/2006 to December/2008. Five questionnaires were applied face-to-face before (T1) and 24h (T2) after training in Neonatal IMCI (PAHO, 2007), and 16 (14-20) months after training (T3). Scores ranging from zero (complete inappropriateness) to 100 (complete appropriateness) were compared by ANOVA with repeated measures. Results: Time since graduation was 17y (1-35) for physicians and 9y (0-31) for nurses (p<0.001). Variation of knowledge was observed according to time and profession (physicians>nurses: p<0.001). Between T1 and T2, enhanced knowledge was verified in care of pregnant women (p=0.026), neonatal resuscitation (p<0.001), neonatal and infant care (p<0.001) and diseases up to two months (p<0.01). Such knowledge was observed at least for 16 months in neonatal resuscitation (p=0.028) and diseases up to two months (p<0.001). The capacity-building was positively evaluated by professionals (94%), who perceived improvement in clinical practice (p<0.001), without report of change in health conditions of the city (p=0.066) between T1 and T3. Conclusion: Training in Neonatal IMCI enhanced knowledge about care of pregnant women and infants up to two months, in addition to acknowledging better clinical practice for physicians and nurses. This training can be a model to be applied in other regions with similar epidemiological context. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3277.pdf: 7015864 bytes, checksum: 9834075e819d2bb62213cf25d21ce5e5 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram negative bacterium responsible for causing meningitis worldwide. The capsular polysaccharide b, a polymer composed by repeating units of ribosyl-ribitol phosphate (PRP), is the major virulence factor and it is used in the formulation of the vaccine against this microorganism. Despite their high efficiency, the conjugated vaccine against Hib is a product of high production cost, which involves fermentation, purification and conjugation processes to obtain a final product within the specifications of the World Health Organization (WHO). The improvement of the culture medium and cultivation conditions can contribute to reduce the cost of this vaccine in order to facilitate its dissemination in developing countries. The main objective of this work was to identify culture conditions that result in higher production of capsular polysaccharide, helping to reduce costs in the steps of purification and conjugation. The experiments were carried out in shake flasks or in bioreactors with 7-13 liters of capacity. The temperature was maintained at 37 °C, pH controlled at 7.5 by adding NaOH 5M and the concentration of dissolved oxygen (CDO) maintained at 30% of air saturation. The specific flow rate of air ranged between 0.2 and 1 VVM. Samples were collected at regular time intervals to measure optical density (DO540nm), biomass concentration, capsular polysaccharide (PRP) production and concentrations of glucose and metabolites. Two possibilities for increasing polysaccharide production were studied: 1) different strategies of fed-batch cultivation consisting of: a) intermittent addition of glucose (FBIG), b) constant feeding (FBCF), c) exponential feeding (FBEF), e d) exponential feeding with cell recycle and perfusion (FBER + P); 2) improvement of culture media composition regarding the carbon/nitrogen ratio through the use of central composite rotational design (CCRD) methodology, having as independent variables: Soy Peptone (S), Yeast Extract (YE) and Glucose (G). Quality parameters were also evaluated to assess the molecular weight profile of the product (PRP) as well as morphological aspects of the microorganism. Economic analysis of different cultivation strategies was used to identify the more economically viable process. The results of the different cultivation strategies together with the outputs of the studied processes cost analysis showed that FBCF, with a cost of U.S.$ 425.50/g PRP and productivity of 88 mg/L.h, showed to be the best alternative among PRP production processes due to its lower cost with a good productivity. In the study of the culture media composition through the statistical analysis of the CCRD results showed that the best culture media composition (BCM) consisted of S 5 g/L; YE 5.5g /L and G of 15.25 g/L. DO540nm and PRP volumetric production values of 8.4 and 410 mg/L, respectively, were attained in validation experiments carried out in shake flasks at the BCM condition. For the bioreactor BCM validation experiment, biomass concentration of 3 g DW/L and polysaccharide production of 600 mg PRP/L were observed. Similar values were reached at validation runs performed in shake flasks and bioreactor for the central point CP condition, showing that both BCM and CP conditions belong to the optimum region. The analysis of quality parameters showed that the cultivation time influences strongly the size of the polysaccharide molecule. The longer the cultivation time, the lower molecular weight was found. The analysis by transmission electron microscopy (TEM) of H. influenzae cells revealed a predominance of round cells in the sixth hour of cultivation, whereas in the twelfth hour of cultivation the cells exhibited a more elongated morphology with the presence of cytoplasmic inclusions in the shape of granules, possibly due to the accumulation of some reserve material. Based on these results, the new composition of the culture medium resulted in an increased of cell growth and capsular polysaccharide production with half of the sources nitrogen (soybean peptone and yeast extract) concentrations, which reduces the production cost. The cultivations that resulted in higher production and productivity of polysaccharide were FBCF (1600 mg PRP/L and 88 mg PRP/(L.h)) and FBER+ P (1800 mg PRP/L and 129 mg PRP/(L.h)). The FBER+P reached 30% higher productivity of polysaccharide than the best result described in the literature (90 mg PRP/(L.h)). However, the FBCF cultivation was economically more viable. / Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria Gram negativa responsável por causar meningite em todo o mundo. O polissacarídeo capsular b, um polímero composto por unidades repetidas de ribosil-ribitol-fosfato (PRP) e o principal fator de virulência, sendo utilizado na formulação da vacina contra este microrganismo. Apesar de sua elevada eficiência, a vacina conjugada contra Hib é um produto de alto custo de produção por envolver processos de fermentação, purificação e conjugação para obtenção de um produto final dentro das especificações da Organização Mundial da Saúde (OMS). O melhoramento do meio de cultura e das condições de cultivo pode contribuir para redução do custo desta vacina de forma a facilitar sua difusão nos países subdesenvolvidos. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi identificar condições de cultivo que resultem em maior produção de polissacarídeo capsular, contribuindo para reduzir os custos nas etapas de purificação e conjugação. Os ensaios foram conduzidos em frascos agitados ou em biorreatores com 7 a 13 litros de capacidade nominal. A temperatura foi mantida em 37oC, o pH controlado em 7,5 através da adição de NaOH 5M e a concentração de oxigênio dissolvido (COD) mantida em 30 % da saturação do ar. A vazão especifica de ar variou entre 0,2 e 1 VVM. Amostras foram coletadas em intervalos regulares de tempo para mensurar densidade óptica (DO540nm), concentração celular, produção de polissacarídeo capsular (PRP) e concentrações de glicose e metabolitos. Duas possibilidades para aumentar a produção de polissacarídeo foram estudadas: 1) diferentes estratégias de cultivo descontinuo alimentado consistindo por: a) adição intermitente de glicose (CDAIG), b) vazão constante (CDAVC), c) vazão exponencial (CDAVE), e d) reciclo de células seguido de perfusão (CDAVE+P)); e 2) o melhoramento da composição do meio de cultura quanto à relação carbono/nitrogênio através do uso da metodologia de delineamento composto central rotacional (DCCR), tendo como variáveis independentes: Peptona de Soja (S), Extrato de Levedura (EL) e Glicose (G). Parâmetros de qualidade também foram avaliados para verificar o perfil da massa molecular do produto (PRP) e os aspectos morfológicos do microrganismo. Os resultados das diferentes estratégias de cultivo juntamente com os resultados da analise econômica do custo dos processos estudados mostraram que o CDAVC, com custo de US$ 425.50/g PRP por ano e produtividade de 88 mg/(L.h), demonstrou ser a melhor alternativa para o processo de produção de PRP por apresentar menor custo com boa produtividade. Já o estudo da composição do meio de cultura através da analise estatística dos resultados do DCCR mostraram que a melhor composição do meio de cultivo (MMC) consistia em S de 5 g/L, EL de 5,5 g/L e G de 15,25 g/L. Valores de DO540nm de 8,4 e de produção volumétrica de polissacarídeo de 410 mg PRP/L foram alcançados em experimentos de validação na condição MMC realizados em shaker. Para o ensaio de validação da condição MMC em reator, a concentração de biomassa de 3,0 g MS/L e a produção de polissacarídeo capsular de 600 mg PRP/L foram observadas. Valores semelhantes foram obtidos em experimentos de validação realizados em shaker e biorreator na condição CPC, mostrando que tanto a condição CPC como a MMC pertencem a região de ótimo. A analise dos parâmetros de qualidade mostrou que o tempo de cultivo influencia fortemente no tamanho da molécula do polissacarídeo, sendo que quanto maior o tempo de cultivo, menor a sua massa molecular. A analise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) das células de H. influenzae mostrou a predominância de células com morfologia arredondada na sexta hora de cultivo, enquanto que, na décima segunda hora de cultivo, as células apresentaram morfologia mais alongada e exibiram a presença de inclusões citoplasmáticas na forma de grânulos, possivelmente devido ao acumulo de algum material de reserva. Diante dos resultados obtidos, a nova composição de meio resultou em maior crescimento celular e produção de polissacarídeo capsular, com metade das concentrações das fontes de nitrogênio (peptona de soja e extrato de levedura), o que reduz o custo de produção. Os cultivos que resultaram em maior produção e produtividade foram o CDAVC (1600 mg PRP/L e 88 mg PRP/L.h) e o CDAVE+P (1800 mg PRP/L e 129 mg PRP/L.h), sendo que este ultimo (CDAVE+P) atingiu produtividade 30 % maior que o melhor resultado ate então descrito na literatura (90 mg PRP/L.h). No entanto, o cultivo CDAVC apresentou maior viabilidade do ponto de vista econômico e de execução e passível de escalonamento.