El presente trabajo ha sido financiado por los proyectos BMC2000-0948-C02-02 y PB96-0330 del Ministerio de Ciencia y Tecnología y GV97-VS-25-82 de la Generalitat Valenciana.

La regulación de las vías involucradas en la captación y asimilación de las diferentes fuentes de nitrógeno en respuesta a su disponibilidad son cruciales en todos los organismos. Las vías del metabolismo del nitrógeno se han estudiado en detalle en la arquea halófila Haloferax mediterranei. Sin embargo, el conocimiento sobre la regulación de dicho metabolismo en las haloarqueas es muy escaso y hasta la fecha no se han identificado las proteínas reguladoras implicadas. Los avances en el campo de la biología molecular han revelado que muchos RNAs pequeños no codificantes o non-coding small RNAs (sRNAs) están involucrados en la regulación de multitud de vías metabólicas. Sorprendentemente, existen muy pocos estudios en el dominio Archaea y, concretamente, ningún estudio se ha centrado en la regulación de las respuestas a las fluctuaciones ambientales del nitrógeno mediante sRNAs en las haloarqueas. Para identificar sRNAs implicados en la regulación de genes relacionados con la asimilación de nitrógeno en Hfx. mediterranei y, por tanto, proponer nuevos mecanismos reguladores, se realizó la secuenciación del RNA, en inglés RNA-Sequencing (RNA-Seq), a partir de cultivos en presencia de dos fuentes de nitrógeno diferentes: amonio y nitrato. Para ello se realizaron dos estrategias distintas: (1) generando previamente una biblioteca de posibles sRNAs a partir de sRNAs identificados en otras especies de arqueas, y (2) analizando manualmente los datos de RNA-Seq en ambas fuentes de nitrógeno, obteniendo el sRNAoma en ambas condiciones. A partir de los sRNAs identificados mediante ambas estrategias se realizó el análisis de expresión transcripcional diferencial, la predicción de la estructura secundaria de los sRNAs, la búsqueda de sus posibles genes diana y el análisis de la conservación de las secuencias en otras especies de arqueas. Ambas estrategias han permitido la primera identificación de sRNAs en Hfx. mediterranei, algunos de los cuales muestran diferentes patrones de expresión según la fuente de nitrógeno. Estos resultados suponen un punto de partida para el estudio de la regulación de la asimilación de nitrógeno mediante sRNAs en Hfx. mediterranei. A partir de los resultados anteriores se selecionaron los sRNAs 310, 311 y 456 para analizar su expresión en presencia de distinta fuente de nitrógeno (amonio o nitrato), en condiciones de ausencia de fuente de nitrógeno o carbono, y bajo diferentes condiciones de estrés (alta/baja temperatura, alta/baja salinidad, en presencia de etanol y estrés oxidativo), para dilucidar en qué procesos pueden estar implicados. Por otra parte, se construyeron exitosamente los primeros mutantes de deleción de sRNAs en Hfx. mediterranei (sRNA310, 311 y 451) mediante el método pop-in/pop-out. Estos resultados suponen el punto de partida para dilucidar las funciones que desempeñan estos sRNAs en el metabolismo de Hfx. mediterranei. Por otra parte, las proteínas Sm, like-Sm y Hfq, pertenecientes a la superfamilia de proteínas Sm, están representadas en todos los dominios de la vida. Se han descrito las funciones de las proteínas Hfq bacterianas y Sm eucariotas, pero los conocimientos sobre las funciones in vivo de las proteínas Lsm en arqueas siguen siendo limitados. El genoma de Hfx. mediterranei contiene un gen lsm que se solapa con el gen rpl37e. Se determinó la expresión de los genes lsm y rpl37e y la cotranscripción de ambos mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR) en diferentes condiciones de cultivo. Para investigar las funciones biológicas de la proteína Lsm, se generaron y caracterizaron mutantes de deleción del gen lsm completo y del motivo Sm1. La comparación del mutante de deleción del gen lsm, el mutante de deleción del motivo Sm1 y la cepa parental HM26 en condiciones de crecimiento estándar y condiciones de estrés reveló diferencias de crecimiento. Además, se realizaron ensayos de shock térmico y estrés oxidativo a diferentes tiempos. Se realizó un análisis transcripcional en condiciones de déficit de carbono y déficit de nitrógeno de la cepa parental HM26 y del mutante de deleción del motivo Sm1 mediante microarrays de expresión, lo que permite identificar los genes que se ven afectados por la mutación del gen lsm en estas condiciones. Finalmente, se determinó la estructura cuaternaria de la proteína Lsm. Para ello se realizó una sobrexpresión homóloga en la cepa mutante del gen lsm, se purificó la proteína mediante dos cromatografías de afinidad HIS-Trap secuenciales, y se determinó su peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular empleando tampones con distinta concentración de NaCl (0,5 M, 1 M, 1,5 M y 2 M). / La presente tesis doctoral ha sido financiada gracias a la subvención para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral concedida por la Generalitat Valenciana (ACIF/2018/200).