Les Penicillin-Binding Proteins (PBP) sont des enzymes intervenant dans les étapes finales de la synthèse de la paroi bactérienne et sont les cibles des antibiotiques de la famille des β-lactamines. Dans les souches cliniques de Streptococcus pneumoniae résistantes aux β-lactamines, les PBPs ont de nombreuses mutations qui ont pour effet une diminution d'affinité de ces enzymes pour les antibiotiques. Il y a en moyenne 40 substitutions dans le domaine transpeptidase des deux acteurs majeurs de la résistance PBP2x et PBP1a.<br />Des études précédentes ont décrit le rôle de quatre mutations de PBP2x et de trois de PBP1a, mais celles-ci ne sont responsables que d'une partie de la résistance. Il n'y a très probablement qu'un nombre restreint de mutations responsables de la perte d'affinité des PBPs pour les β-lactamines ayant pour conséquence une augmentation du niveau de résistance.<br />Pour identifier toutes les mutations impliquées, une série de protocoles automatisés permettant de faire de la mutagénèse dirigée, de l'expression, de la purification et de la caractérisation fonctionnelle d'enzymes en utilisant des robots de types manipulateurs de liquides ont été développés. L'application de cette méthode nous a permis de réaliser une caractérisation exhaustive de plus de 40 mutations de PBP2x de la souche clinique<br />résistante 5204. Cette étude a abouti à l'identification de toutes les substitutions clés ainsi qu'à l'élucidation d'un nouveau mécanisme moléculaire de baisse d'affinité de PBP2x pour les β-lactamines. De plus, une étude fonctionnelle et phénotypique de la résistance impliquant PBP1a a été réalisée.<br />Ce travail apporte une vue globale des mécanismes moléculaires de la résistance de S. pneumoniae aux β-<br />lactamines impliquant les PBPs en utilisant une méthode exhaustive originale.

Contexte. Les phénotypes ABO et Rh(D) des donneurs de sang ainsi que des patients transfusés sont analysés de façon routinière pour assurer une complète compatibilité. Ces analyses sont accomplies par agglutination suite à une réaction anticorps-antigènes. Cependant, pour des questions de coûts et de temps d’analyses faramineux, les dons de sang ne sont pas testés sur une base routinière pour les antigènes mineurs du sang. Cette lacune peut résulter à une allo-immunisation des patients receveurs contre un ou plusieurs antigènes mineurs et ainsi amener des sévères complications pour de futures transfusions. Plan d’étude et Méthodes. Pour ainsi aborder le problème, nous avons produit un panel génétique basé sur la technologie « GenomeLab _SNPstream» de Beckman Coulter, dans l’optique d’analyser simultanément 22 antigènes mineurs du sang. La source d’ADN provient des globules blancs des patients préalablement isolés sur papiers FTA. Résultats. Les résultats démontrent que le taux de discordance des génotypes, mesuré par la corrélation des résultats de génotypage venant des deux directions de l’ADN, ainsi que le taux d’échec de génotypage sont très bas (0,1%). Également, la corrélation entre les résultats de phénotypes prédit par génotypage et les phénotypes réels obtenus par sérologie des globules rouges et plaquettes sanguines, varient entre 97% et 100%. Les erreurs expérimentales ou encore de traitement des bases de données ainsi que de rares polymorphismes influençant la conformation des antigènes, pourraient expliquer les différences de résultats. Cependant, compte tenu du fait que les résultats de phénotypages obtenus par génotypes seront toujours co-vérifiés avant toute transfusion sanguine par les technologies standards approuvés par les instances gouvernementales, les taux de corrélation obtenus sont de loin supérieurs aux critères de succès attendus pour le projet. Conclusion. Le profilage génétique des antigènes mineurs du sang permettra de créer une banque informatique centralisée des phénotypes des donneurs, permettant ainsi aux banques de sang de rapidement retrouver les profiles compatibles entre les donneurs et les receveurs. / Background. ABO and Rh(D) phenotyping of both blood donors and transfused patients is routinely performed by blood banks to ensure compatibility. These analyses are done by antibody-based agglutination assays. However, blood is not routinely tested for minor blood group antigens on a regular basis because of cost and time constraints. This can result in alloimmunization of the patient against one or more minor antigens and may complicate future transfusions. Study design and Methods. To address this problem, we have generated an assay on the GenomeLab SNPstream genotyping system (Beckman Coulter, Fullerton, CA) to simultaneously test polymorphisms linked to 22 different blood antigens using donor’s DNA isolated from minute amounts of white blood cells. Results. The results showed that both the error rate of the assay, as measured by the strand concordance rate, and the no-call rate were very low (0.1%). The concordance rate with the actual red blood cell and platelet serology data varied from 97 to 100%. Experimental or database errors as well as rare polymorphisms contributing to antigen conformation could explain the observed differences. However, these rates are well above requirements since phenotyping and cross-matching will always be performed prior to transfusion. Conclusion. Molecular profiling of blood donors for minor red blood cell and platelet antigens will give blood banks instant access to many different compatible donors through the set-up of a centralized data storage system.

L’aérosolthérapie est une modalité thérapeutique complexe souvent prescrite dans les services de réanimation et de surveillance continue, les services d’urgences et les unités de soins intensifs, notamment chez les patients obstructifs, ce qui fait des bronchodilatateurs la classe médicamenteuse la plus prescrite par voie aérosolisée. Les patients de ces unités de soins aiguë nécessitent aussi fréquemment un support ventilatoire parmi lesquels le haut débit nasal humidifié se montre être une modalité prometteuse en raison de ses effets physiologiques, y compris chez les patients obstructifs. La question de l’administration d’aérosols de médicaments et notamment de bronchodilatateurs chez des patients soumis au haut débit nasal est donc posée. L’administration d’aérosols médicamenteux au cours du haut débit nasal directement dans le circuit de ce support ventilatoire pourrait être une méthode simple, efficace, voire même bénéfique. / Aerosol therapy is a complex method of drug delivery frequently used in intensive care units, step down units and emergency departments, especially in obstructive patients which makes bronchodilators the most prescribed drug class in critical care. Critically ill patients often require ventilatory support, including nasal high flow therapy which showed promising clinical benefits. Given the physiologic effects of nasal high flow therapy, its implementation may be beneficial for obstructive patients. Consequently, the question of aerosol administration, especially bronchodilators, in patients undergoing nasal high flow arises. Aerosol administration during nasal high flow therapy directly in the high flow circuit could be a simple, efficient and possibly beneficial method. However, technical and physiological issues may jeopardize efficacy of this combined administration.

Les maladies neuromusculaires sont des maladies souvent très sévères et très handicapantes, et un fardeau pour les patients, leurs familles, ainsi que pour le système de santé. Le but de ce projet était de mettre au point et de valider une approche de capture de séquence et de séquençage haut débit pour identifier les mutations en cause chez les patients atteints de maladies neuromusculaires et également trouver les nouveaux gènes qui sont impliqués dans une sous-classe de myopathies, les myopathies centronucléaires. Nous avons montré que l’approche de capture de séquence et de séquençage haut débit peux être utile dans le domaine des maladies neuromusculaires car elle est moins coûteuse que les approches conventionnelles « gène par gène » mise en oeuvre dans les laboratoires de diagnostics génétiques.Cette stratégie devrait élargir les spectres cliniques connus et identifier de nouvelles maladies alléliques (des mutations dans un gène causant différentes maladies). De plus, cela sera utile pour l’élargissement des connaissances sur les corrélations génotypes-phénotypes qui sont nécessaires à une prise en charge plus adaptée et au développement de stratégies thérapeutiques. / Neuromuscular disorders (NMD) are genetic diseases affecting muscles, nerves and neuromuscular junctions. They are rare and often severe with different age of onset from childhood to adulthood with significant burden to the patients, their families and public health system. For testing the possibility of using massively parallel sequencing as a routine technique in molecular diagnosis of neuromuscular disorders, the first aim of my PhD project was to use massively parallel sequencing technique in patients with different NMDs for disease-causing mutation detection. The second aim of my PhD project was to find novel gene(s) implicated in centronuclear myopathies (CNM). CNM are inherited neuromuscular disorders and a type of congenital myopathies, characterized mainly by presence of central and one or more internalized nuclei in muscle fibers with different severities and age of onset, using massively parallel sequencing. About 20% of CNM patients don’t have any mutations in four implicated genes. Disease- causing mutation(s)/ gene(s) in these patients need to be identified. We could show that next generation sequencing is a robust technique for gene identification if a homogenous cohort of patients is available and also is useful to use as a routine technique in molecular diagnosis as it istime and cost effective technique.

Na / Na

L'étape initiale dans l'expression génique est la transcription de l'ADN génomique du gène en ARN. La transcription être initiée par l'assemblage d'ARN pol II autour du site de début de transcription, qui est également connues comme promoteurs. Cependant, la transcription est nécessite un autre gène distal des régions, des amplificateurs, qui sont augmenté ainsi la probabilité de la transcription. Amplificateurs et les promoteurs sont généralement définis par leur éloigné des sites d'initiation de la transcription et souvent distingués par les modifications des histones. Récemment, des études, il a été de plus en plus ont révélé de grandes similitudes entre les amplificateurs et les promoteurs. Les résultats antérieurs ont suggéré la possibilité que certains promoteurs de gènes peuvent afficher les fonctions activatrices. Cependant l'étendue de ce type de promoteurs et si elles fonctionnent réellement réglementé l'expression des gènes distales sont restés insaisissable.Mon projet est réalisé en vue de répondre à ces questions. En exploitant un essai amplificateurs reporter à haut débit, je démêler une partie sous-estimée du promoteur de base présentant une activité d'activateur, définie comme Epromoters. Ils présentent des propriétés distinctes par rapport à des amplificateurs et des promoteurs classiques distales, sont associés à la réponse au stress et d'interagir plus souvent avec d'autres promoteurs. En utilisant CRISPR complète / cas9 approche de suppression I a démontré que Epromoters sont généralement impliqués dans l'activation des gènes distales. Nos résultats identifient d'abord une nouvelle catégorie de promoteurs avec activité in vivo dans amplificateurs. / The initial step of gene expression is the transcription of genomic DNA of the gene into RNA. The transcription can only be initiated by the assembly of RNAPII machinery around transcription start site of a gene, known as core promoter. However, transcription also requires other gene-distal regulatory DNA regions, known as enhancers. Enhancers and promoters are traditionally distinguished by their histone modifications. Recently, there has been increasing number of studies revealing broad similarities between enhancers and promoters. Previous findings have suggested the possibility that some gene promoters display enhancer activity. However, the questions of how can we identify this type of promoter in genome-wide and whether they actually function to regulated the expression of distal genes are remained elusive.My project has carried out aiming to answer these above questions. Firstly, I have optimized the technique that has developed in the lab, named CapStarr-seq, which used as an approach to exploiting a high-throughput enhancer activity. Performing CapStarr-seq in human cell lines, I unraveled an underestimated proportion of promoter displaying enhancer activity, defined as Epromoters. They display distinct properties as compared to distal enhancers and classical promoters, are associated with stress response genes and interact more frequently with other promoters. Moreover, by using comprehensive CRISPR/Cas9 genomic deletion approach, I demonstrated that Epromoters are generally involved in the activation of distal genes. Taken together, our results first identify a new category of promoters with dual promoter and enhancer functions.

Dans le passé, Nichols et al. (Cell, 2010) ont criblé une collection de mutants de déletion d’Escherichia coli (~4000 gènes) dans ~324 conditions. L’utilisation de la taille des colonies comme indicateur de croissance, leur a permis de définir des phénotypes robustes pour ~50% des mutants, conduisant ainsi à de nouvelles idées biologiques. Cependant, 50% des gènes restants n’ont pas donné de réponse significative.J’ai souhaité dépasser les limitations du précédent criblage en augmentant le crible dans 2 directions : tout d’abord, j’ai augmenté le nombre et la complexité des conditions de stress dans le but d’imiter les contraintes d'origine naturelle. Puis, j’ai adapté le test «rouge Congo» afin de tester la formation de biofilm.J’ai ainsi généré deux ensembles de données, contenant ~2 millions de phénotypes de croissance et de biofilm, dans approximativement 250 conditions de stress simples et complexes. Les données ont révélé des phénotypes pour ~80% des mutants testés, la majorité d'entre eux provenant de conditions de stress complexes et de la mesure de biofilm. L'utilisation de ces phénotypes a permis la construction d’un réseau connectant les complexes de protéines connus avec ~500 gènes de fonction inconnue.De plus, la mesure de biofilm a permis d’identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la formation de biofilm. Les données obtenues grâce au test «rouge Congo» ont également révélé que de nombreux enzymes régulant les niveaux de ci-di-GMP servent de senseurs pour différents signaux entrants impliqués dans cette même voie. L’identité des signaux entrants a été révélée par les phénotypes spécifiques à une condition. / In the past, Nichols et al. probed a knock out collection of E. coli across 324 conditions. Using colony size as a proxy for fitness allowed them to define robust phenotypes (5% FDR) for about 50% of the knockouts, leading to novel insights into E. coli’s biology. The remaining 50% of the genes did not yield a significant response even when growth was probed in such diverse conditions.I address the limitations of this previous high-throughput screen by expanding the screen design it in 2 directions: First, I increased the number and complexity of conditions to mimic naturally occurring stresses. Second, I adapted the Congo-red assay to probe biofilm formation in parallel to growth. I was able to generate two datasets that consist of more than 2 million growth and biofilm phenotypes across ~250 simple and complex stresses. The datasets revealed phenotypes for ~80% of the knockouts probed (5% FDR) with the large majority of them originating from complex stresses and the biofilm readout. Using these phenotypes, I generated a high-confident network connecting known protein complexes with >500 uncharacterized genes. In addition, the biofilm readout captured dozens of new players involved in biofilm formation. Even further, the color dataset revealed that the multiple enzymes regulating the levels of ci-di-GMP, serve as sensors for different input signals that feed into the same pathway. Identity of the input signals was revealed by the condition-specific phenotypes.

Ce travail de thèse illustre l’intérêt d’utiliser le séquençage de nouvelle génération (Next- Generation Sequencing ou NGS) pour améliorer le diagnostic moléculaire des formes de prédispositions aux cancers. Nous avons appliqué deux stratégies différentes, l’une basée sur l’analyse simultanée d’un panel de gènes impliqués dans une pathologie, l’autre sur l’analyse de toutes les parties codante du génome ou exome.Nous avons montré que le développement d’un panel de 10 gènes impliqués dans la carcinogenèse des cancers coliques a permis d’améliorer le diagnostic moléculaire de ces formes de cancers. Cette technologie a diminué le délai de rendu des résultats et est plus sensible que le séquençage Sanger et la QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fragment).L’application d’une stratégie d’analyse d’exomes de trio par NGS, à l’analyse de deux formes de cancers sporadiques de phénotype extrême, cancers du sein et de l’ovaire, a permis la détection de mutations de novo portant sur des gènes impliqués dans l’oncogenèse. Pour mettre en cause ces mutations dans le phénotype, nous avons réalisé des tests fonctionnels et des études de récurrence. / The working thesis Illustre interest of the USE next generation sequencing (NGS Next- Generation Sequencing e) pay Improve Molecular diagnosis of predisposition to cancer forms. Have we applied two different strategies you in June based on the simultaneous analysis of genes not involved in panel A pathology, the Other on the analysis of all the parties of the coding genome e exome.Nous Have Shown que le development of a panel of 10 genes involved in carcinogenesis of colon cancer a Permit to improve the molecular diagnosis of forms of CES dE cancers. This technology has reduced the Delai rendering results and is more reasonable That Sanger sequencing and QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fragment) .The application OF exomes an analysis by NGS trio Strategy at analysis of two forms of sporadic cancer phenotype extreme, breast cancer and ovarian cancer, permit the detection of de novo mutations on genes involved in oncogenesis. For Questioning mutations IN THESE phenotype, We Have made Functional testing and induction studies.

Le facteur nutritionnel affecte de façon significative la sécrétion et la composition des constituants du lait qui conditionnent sa qualité nutritionnelle. Dans la glande mammaire, ces processus font intervenir de nombreux gènes dont l’expression est modulée par l’alimentation, cependant les mécanismes de régulation sous-jacents ne sont pas connus. Les microARNs (miARN) sont des petits ARN non codants qui se lient sur leurs ARNm cibles pour en réguler l’expression. Ils ouvrent donc des pistes d’investigation pour la compréhension de ces mécanismes. La première partie de mon travail de thèse a consisté à obtenir une meilleure connaissance des miARN exprimés dans la glande mammaire, notamment en dressant les miRNomes de référence par séquençage haut débit chez la souris, la vache et la chèvre. Ensuite, pour la première fois, l’impact de la nutrition sur l’expression des miARN mammaires a été étudié. Deux modèles ruminants, un modèle dit « extrême » et un modèle de supplémentation lipidique proche des conditions d’élevage, ont permis d’identifier 30 et 2 miARN, respectivement, dont l’expression est nutrirégulée. L’analyse in silico des cibles des miARN nutrirégulés a révélé un rôle potentiel de ceux-ci dans le métabolisme des lipides. Certaines des cibles sont effectivement différentiellement exprimées dans ces modèles, parmi celles-ci certains gènes sont essentiels pour la lactation tels que ESR1. Enfin, une étude pilote de la fonction de trois miARN nutrigulés a été initiée in vitro dans des cellules épithéliales mammaires bovines. Ces travaux permettent donc d’apporter des premiers éléments pour la compréhension de la régulation de l’expression des gènes en réponse à la nutrition et de l’impact des miARN sur la lactation. / Nutrition significantly affects the secretion and the composition of milk which determine its nutritional quality. In the mammary gland, regulation of these processes involves numerous genes which expression can be affected by nutrition. However, their regulations remain unclear. MicroRNAs (miRNA) are small non coding RNA which can bind mRNAs and regulate their expression of target genes. Consequently, they offer opportunities to understand the regulation of gene expression in response to nutrition. The first step of my PhD aimed to obtain a better knowledge of miRNA expressed in the mammary gland. Mammary miRNome were established from the lactating mouse, cow and goat using high-throughput sequencing. Later, the effect of nutrition on the expression of miRNA in the mammary gland was analyzed for the first time. Two models in ruminants, a food deprivation (“extreme” model) and a lipid supplementation (model similar to breeding conditions) highlighted 30 and 2 nutriregulated miRNA, respectively. The analysis of nutriregulated miRNA’s predicted targets, in silico, revealed their potential role in lipid metabolism. Some of those target genes have been previously identified as differently expressed in the same conditions and could thus be involved in the regulation of the expression of genes essential for the mammary gland function, such as ESR1. Finally, three nutriregulated miRNA were selected and used in a preliminary study of their functions in vitro in bovine mammary epithelial cells. These works bring first evidences in understanding the nutritional regulation of gene expression in the mammary gland as well as the role of miRNA in lactation.

La diffusion du séquençage haut débit (ou NGS pour Next Generation Sequencing) représente un tel changement d’échelle par rapport aux méthodes classiques de séquençage que les indications et l’organisation du diagnostic moléculaire s’en trouvent profondément modifiées. Le NGS permet à la fois de raccourcir le temps d’analyse et de rendu de résultat et d'élargir considérablement le nombre de gènes testés. Il promet donc d’augmenter la proportion de diagnostics posés et de faciliter l'identification de nouveaux variants et de nouveaux gènes impliqués en pathologie. Cependant dans tous les cas, il génère une quantité de données importante, données qui doivent être analysées et interprétées à l’aide d’outils bioinformatiques spécifiques.Dans la première partie de ce travail, les stratégies existantes ainsi que les difficultés et les enjeux du séquençage haut débit pour le diagnostic moléculaire des maladies génétiques sont discutés. Dans la deuxième partie, la mise en place et la validation technique de cette approche diagnostique sont décrites au sein du laboratoire de Génétique Moléculaire de la Timone à Marseille et illustrées par trois exemples concrets de diagnostics moléculaires posés grâce à la technique de séquençage à haut débit. Dans le domaine spécifique des maladies rares, ces nouvelles technologies sont porteuses d’un réel espoir pour les patients atteints de maladie génétique, permettant d'améliorer globalement leur prise en charge et d'accélérer les progrès dans le domaine de la recherche. / The diffusion of Next Generation Sequencing (NGS) technologies induces an important change that modifies molecular diagnostics indications and prompts laboratories to re-think their diagnostic strategies, up-to-now based on Sanger sequencing routine. Several high throughput approaches are available from the sequencing of a gene panel, to a whole exome, or even a whole genome. In all cases, a tremendous amount of data are generated, that have to be filtered, interpreted and analyzed by the use of powerful bioinformatics tools.In part 1, existing strategies and the difficulties and challenges of high-throughput sequencing for molecular diagnosis in genetic diseases are discussed. In part 2, the set up and the technical validation of this diagnostic approach in the Molecular Genetics’ Laboratory of the Timone Hospital in Marseille is presented and illustrated by 3 examples of complex diagnostics solved thanks to NGS. NGS promises to shorten significantly the time of analysis and results reporting, and to expand the number of tested genes. It also promises to increase the proportion of positive diagnoses. Finally, the NGS can identify new variants and new genes involved in human pathology, thus will globally improve patient clinical care.