Le sepsis est une dérégulation de la réponse de l’hôte à une infection, associé à un dysfonctionnement des organes engageant le pronostic vital du patient. Plus de 30 millions de cas et 5 millions de décès sont estimés par an dans le monde. Le diagnostic du sepsis est basé sur des signes cliniques non spécifiques et la longue procédure d’identification des pathogènes responsables de l’infection. L’objectif de cette étude est de développer et d’évaluer le potentiel de la spectroscopie vibrationnelle appliquée au sérum pour améliorer le diagnostic du sepsis. Les défis inhérents à la nature de l’échantillon et à la technique de même que certains paramètres pré-analytiques ont été évalués pour assurer la qualité des données. Les variations de contenu en eau des échantillons après séchage pouvant affecter la discrimination des données, ont été corrigées en testant différentes méthodes. Enfin, des sérums de patients septicémiques (n=380) collectés avant chirurgie et jusqu’à 3 jours avant et le jour du diagnostic ont été analysés. Les échantillons du groupe contrôle (n=353) collectés suivant la même cinétique, provenant de patients ayant un profil similaire en termes d’âge, de sexe, de procédure chirurgicale subie mais n’ayant pas développé de sepsis et des échantillons (n=180) de patients atteints d’un syndrome de réponse inflammatoire systémique collectés avant chirurgie et le jour du diagnostic ont également été analysés. Les données acquises ont été exploitées par méthodes chimiométriques pour discriminer des zones spectrales reflétant des différences de composition moléculaire avec des sensibilités et spécificités supérieures à 70% malgré l’influence de l’eau résiduelle. / Sepsis is a dysregulated host response to an infection that causes life-threatening organ dysfunction. Each year, over 30 million cases and 5 million deaths are estimated worldwide. Diagnosis of sepsis is based on non-specific clinical signs and time consuming positive identification of the causative pathogen. The objective of this study is to develop and evaluate the potential of vibrational spectroscopy applied to human serum to improve diagnosis of sepsis. Challenges of serum spectroscopy inherent to the sample nature and preparation as well as to the technique have been assessed to determine the most suitable methodological approach. Then, some aspects of the pre-analytical phase have been addressed in order to standardise protocols in sample handling and preparation for spectral acquisitions to ensure quality and reproducibility of spectral data collected. Different methods have been tested to correct water content variations in dried serum, which can impact on data discrimination. Finally, based upon the developed methodology, patient serum samples (n=380) collected before surgery, up to 3 days before sepsis diagnosis, and on the day of sepsis diagnosis have been analysed. Control serum samples (n=353) from age/ sex/ procedure-matched patients who did not go on to develop sepsis have been also analysed over similar timeframes post-surgery as well as samples (n=180) from patients with systemic inflammatory response syndrome. Spectral data acquired have been interrogated by chemometric methods to identify spectral zones reflecting differences in molecular composition allowing discrimination with over 70% of sensitivities and specificities despite water interferences.

Un biomarqueur est une molécule (ou un ensemble de molécules) présente dans l’organisme qui témoigne de l’apparition d’un processus pathologique. Il permet ainsi de dépister une maladie, d’en prédire sa gravité ou encore d’évaluer l’efficacité d’un traitement. Les liquides biologiques représentent des milieux de choix pour la recherche de biomarqueurs en pathologie humaine car leur collection est habituelle dans la prise en charge des patients et moins invasive comparée aux biopsies d’organes ou de tissus. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux exosomes présents dans ces liquides biologiques. Les exosomes sont des nanovésicules dont le diamètre est compris entre 30 et 100 nanomètres. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et contiennent des protéines cytoplasmiques et membranaires spécifiques de leur cellule d’origine. L’intérêt majeur des exosomes isolés à partir des liquides biologiques, est qu’ils constituent une source de biomarqueurs. Ils peuvent donc être assimilés à une « biopsie liquide ». L’analyse des exosomes pourrait compléter utilement des examens classiques de dépistage, de diagnostic et de suivi d’une pathologie. Dans le cadre de projet de cette thèse, nous avons appliqué des techniques de protéomique à haut débit pour l’analyse des exosomes. Nous nous sommes tout d’abord intéressés à l’analyse du profil protéique des exosomes urinaires dans le contexte de deux pathologies du tractus urinaire : la cystinurie et le cancer du rein. La cystinurie est une néphropathie lithiasique d’origine génétique pour laquelle il y a peu de marqueurs biologiques pouvant prédire son évolution vers l’insuffisance rénale terminale. Nous avons développé une méthode de préparation des exosomes urinaire permettant d’analyser de façon reproductible leurs profils protéiques. Nous avons appliqué cette méthode à huit patients cystinuriques et comparé les résultats aux profils obtenus chez dix sujets sains. Un panel de 38 protéines différentiellement exprimé dans les exosomes des patients a été identifié et en partie validé par Western blot. Concernant le cancer du rein à cellules claires pour lequel le diagnostic nécessite des prélèvements invasifs par biopsie, nous avons analysé les exosomes urinaires de huit patients avant et après néphrectomie. Nous avons ainsi pu mettre en évidence un panel de 25 protéines surexprimées dans les exosomes des patients. Enfin, le dernier volet de cette thèse a été consacré à l’analyse des exosomes du lavage broncho-alvéolaire provenant de patients MV, maladie d’origine génétique qui atteint principalement les poumons. L’analyse des exosomes de lavage broncho-alvéolaire pourrait permettre de donner un éclairage nouveau sur la physiopathologie de la maladie. Nous avons réalisé la comparaison des profils protéiques des exosomes de quatre patients MV, et six patients asthmatiques. L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse montre que l’analyse protéomique des exosomes issus de fluides biologiques peut aider la recherche de biomarqueurs diagnostics ou pronostics de maladies. / A biomarker is a molecule (or a cluster of molecule) which will reflect the occurrence of a pathological state, giving us the ability to detect a disease, to predict its severity or to assess drug efficiency. Biological fluids are the golden standards for biomarker research in human as they are routinely collected for patients’ follow-up and are less invasive than biopsies. During my PhD, I focused on exosomes that can be found in these biological fluids. Exosomes are nanovesicles with a diameter ranging between 30 and 100 nanometers. Exosomes are secreted by all cell types and harbor cytoplasmic and membranous proteins specific of their cells of origins. One of the major interest of exosomes enriched from biological fluids is that they represent a valuable source of biomarkers. They can be considered as a « liquid biopsy ». Their analysis could complete classical diagnosis and follow-up tools. In this project, we applied high resolution, high throughput proteomic techniques for exosomes analysis. We firstly focused on protein profiles in urinary exosomes in the context of two urinary tract diseases: cystinuria and kidney cancer. Cystinuria is an inherited autosomal recessive disease that is characterized by the formation of cystine stones in the kidneys. To date, there are no markers to predict the evolution toward end stage renal disease. We developed a method to prepare exosomes in order to reproducibly analyze their protein profiles. We applied this method to eight cystinuria patients and compared their profiles to those of ten healthy subjects. A panel of 38 differentially expressed proteins in patients were found and validated by western blots. We also applied this method to patients with clear cell renal cell carcinoma, for which invasive biopsies are necessary for clear diagnosis. We analyzed urinary exosomes form eight patients before and after nephrectomy. We were able to highlight 25 overexpressed proteins in patients’ exosomes. Eventually, the last part of my thesis was dedicated to the analysis of exosomes enriched from bronchoalveolar lavage fluid collected in cystic fibrosis patients, a disease that affects mostly the lungs. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes analysis could give a new insight on the mechanisms of this disease. We compared protein profiles in exosomes from four cystic fibrosis patients and six asthmatic patients. The whole point of this work is to show that proteomic analysis of exosomes isolated from biological fluids could become a golden standard for the discovery of diagnosis or prognosis biomarkers.

Anticiper l’impact de fluctuations environnementales de nature climatique ou alimentaire est un enjeu crucial dans les systèmes de productions animales, et plus particulièrement sur la volaille. Cette influence de l’environnement sur les phénotypes passe en partie par des phénomènes épigénétiques, notamment la méthylation de l’ADN, et qui peuvent intervenir dans la régulation de l'expression des gènes. Ce sont des mécanismes qui n'affectent pas la séquence d'ADN mais qui peuvent être transmis par la mitose ou la méiose. Ces interactions entre épigénomes et expression des gènes sont de plus en plus étudiées dans les modèles animaux et chez les plantes. Cependant, les mécanismes de régulation de l'expression du génome par la méthylation de l’ADN sont assez peu connus chez les oiseaux. Ce travail de thèse repose sur deux dispositifs expérimentaux réalisés chez la poule, le but étant de caractériser le méthylome par séquençage haut-débit. Les profils de méthylation le long du génome, et le lien avec l’expression, sont établis d’abord par un séquençage tout-génome (WGBS) au sein d’embryons entiers, puis par un séquençage d'une sous-représentation du génome (RRBS) au sein d’hypothalamus d’individus adultes. À ce jour, aucune étude d'analyses de méthylome par RRBS chez la poule n'a été publiée. Ces deux analyses sont réalisées grâce au développement d'un pipeline bioinformatique, optimisé, disponible à la communauté scientifique. Globalement, le profil de méthylation chez la poule est similaire à ce qui est connu chez les mammifères : les îlots CpG - régions riches en dinucléotides CG, souvent peu méthylées, qui ponctuent le génome principalement dans les régions promotrices des gènes - sont globalement peu méthylés dans les promoteurs sur les données WGBS et RRBS. Les analyses du méthylome des embryons ont confirmé l'absence d'un phénomène de compensation de dose sur les chromosomes sexuels, ou la présence sur le chromosome Z d'une région hyperméthylée. Les analyses des données RRBS révèlent une hyperméthylation globale des CG sur le génome, suggérant une réponse de la méthylation à un stress environnemental. Sur les données WGBS, le niveau de méthylation dans le promoteur est négativement corrélé à l'expression du gène associé. Une méthylation allèle spécifique est également détectée entre les lignées, phénomène mis en évidence pour la première fois chez la poule et dont la fréquence est comparable à ce qui a été observé chez l'Homme. Sur les données RRBS, des résultats préliminaires de la réponse du méthylome aux stress environnementaux montrent le caractère complexe de cette relation. L’utilisation d’aliments moins énergétiques entraînerait une plus grande mobilisation des réserves lipidiques, tandis que les individus soumis à un stress à la chaleur ont un poids corporel plus léger. Une intégration de ces données à des mesures phénotypiques permettrait de faire le lien entre méthylation et environnement. Au-delà de l'aspect fondamental de cette thèse, l'application plus concrète de ces connaissances peut s'appliquer aux systèmes d'élevage pour obtenir des animaux mieux adaptés à l’environnement, en améliorant les caractères de production / Anticipating the impact of environmental changes (on climate and feed) is a crucial issue for livestock production systems, including poultry. The influence of the environment on phenotypes is partly mediated by epigenetic phenomena, including DNA methylation, which may be involved in the regulation of gene expression. These mechanisms do not affect the DNA sequence but can be inherited by mitosis or meiosis. The interactions between epigenomes and gene expression are increasingly being studied in animal models and in plants. However, the mechanisms of regulation of genome expression through DNA methylation are relatively unknown in birds. This thesis work is based on two experimental devices realized in chicken aiming to characterize the methylome by high-throughput sequencing. The methylation patterns across the genome, and their link with expression, were first established by whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) in whole embryos, following a reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) from hypothalamus of adults. To date, no specific chicken RRBS study has been published. These two analyses were carried out by developing an optimized bioinformatics pipeline, available for scientific community. Overall, the pattern of methylation in chicken is like those in mammals: CpG islands - dinucleotides CG-rich regions which are often poorly methylated, and which are found mainly in the promoter regions of the genome - are generally poorly methylated in promoters on WGBS and RRBS data. Embryo methylome analyses confirmed the absence of a dose-compensation phenomenon on sex chromosomes, or the presence of a hypermethylated region on the Z chromosome. The analyses of RRBS data revealed an overall hypermethylation of CGs across the genome, suggesting a methylation response to environmental stress. From the analysis of WGBS data, we found that the level of methylation in promoters was negatively correlated with the expression of the associated gene. For the first time, a specific allele methylation was also detected between chicken lines whose frequency is comparable to that observed in humans. On the RRBS data, preliminary results of the methylome response to environmental stresses showed the complex nature of this relationship. The use of a low-energy diet would led to greater mobilization of body fat, while individuals with heat stress had a lighter body weight. Integrating these data with phenotypic measurements would allow to link methylation and environment. Beyond the fundamental aspect of this thesis, the method developed in this work could be applied to livestock systems to breed animals better adapted to a changing environment, by improving production traits.

Le corps humain compte plus de 200 types cellulaires différents possédant une copie identique du génome mais exprimant un ensemble différent de gènes. Le contrôle de l'expression des gènes est assuré par un ensemble de mécanismes de régulation agissant à différentes échelles de temps et d'espace. Plusieurs maladies ont pour cause un dérèglement de ce système, notablement les certains cancers, et de nombreuses applications thérapeutiques, comme la médecine régénérative, reposent sur la compréhension des mécanismes de la régulation géniques. Ce travail de thèse propose, dans une première partie, un algorithme d'annotation (GABI) pour identifier les motifs récurrents dans les données de séquençage haut-débit. La particularité de cet algorithme est de prendre en compte la variabilité observée dans les réplicats des expériences en optimisant le taux de faux positif et de faux négatif, augmentant significativement la fiabilité de l'annotation par rapport à l'état de l'art. L'annotation fournit une information simplifiée et robuste à partir d'un grand ensemble de données. Appliquée à une base de données sur l'activité des régulateurs dans l'hématopoieïse, nous proposons des résultats originaux, en accord avec de précédentes études. La deuxième partie de ce travail s'intéresse à l'organisation 3D du génome, intimement lié à l'expression génique. Elle est accessible grâce à des algorithmes de reconstruction 3D à partir de données de contact entre chromosomes. Nous proposons des améliorations à l'algorithme le plus performant du domaine actuellement, ShRec3D, en permettant d'ajuster la reconstruction en fonction des besoins de l'utilisateur. / The human body has more than 200 different cell types each containing an identical copy of the genome but expressing a different set of genes. The control of gene expression is ensured by a set of regulatory mechanisms acting at different scales of time and space. Several diseases are caused by a disturbance of this system, notably some cancers, and many therapeutic applications, such as regenerative medicine, rely on understanding the mechanisms of gene regulation. This thesis proposes, in a first part, an annotation algorithm (GABI) to identify recurrent patterns in the high-throughput sequencing data. The particularity of this algorithm is to take into account the variability observed in experimental replicates by optimizing the rate of false positive and false negative, increasing significantly the annotation reliability compared to the state of the art. The annotation provides simplified and robust information from a large dataset. Applied to a database of regulators activity in hematopoiesis, we propose original results, in agreement with previous studies. The second part of this work focuses on the 3D organization of the genome, intimately linked to gene expression. This structure is now accessible thanks to 3D reconstruction algorithm from contact data between chromosomes. We offer improvements to the currently most efficient algorithm of the domain, ShRec3D, allowing to adjust the reconstruction according to the user needs.

La recherche de nouvelles réactions est un des enjeux fondamentaux de la chimie organique. En dehors de l’approche classique basée sur la conception d’une réaction en s’appuyant sur les propriétés chimiques des substrats, une nouvelle approche utilisant le criblage systématique de combinaisons aléatoires de fonctions réactives a été récemment adoptée par plusieurs groupes. Cette stratégie nécessite un outil analytique permettant de cribler un très grand nombre de réactions par jour et d’identifier les meilleures combinaisons conduisant à la formation de produits intéressants. Les travaux de thèse présentés dans ce mémoire s’inscrivent dans le contexte de l’utilisation des techniques de dosages immuno-enzymatiques (ELISA) comme outil de criblage pour la recherche de nouvelles réactions de couplage. Dans un premier temps le criblage de 2688 combinaisons de fonctions réactives et de catalyseurs choisies au hasard a été effectué. Ce criblage a permit de mettre en évidence deux nouveaux couplages en présence de sels de cuivre : une réaction entre les thiourées et les phénols conduisant à la formation des isourées et une réaction entre les N-hydroxythiourées et les alcynes conduisant à la formation des thiazole-2-imines. Dans un second temps le criblage de 2816 combinaisons de fonctions sélectionnées, cette fois-ci, de façon rationnelle a été effectué. Ce criblage a visé la découverte de nouvelles cycloadditions [3+2] répondant aux critères de la chimie « click ». Ainsi l’utilisation de dosage immuno-enzymatique a été étendue à l’optimisation des nouvelles réactions découvertes ainsi qu’à l’évaluation de leurs cinétique, chimiosélectivité et biocompatibilité. Près de 3000 tests complémentaires effectuées sur les « hits » issus du criblage primaire ont ainsi permit de mettre en évidence 4 nouvelles réactions de couplage dont une nouvelle réaction « click » : la cycloaddition sydnone-alcyne catalysée au cuivre (CuSAC). Dans la dernière partie de ce manuscrit les études plus détaillées sur la réaction CuSAC ont été effectuées, notamment l’identification de la structure du produit de couplage et l’étendue du champ d’application de cette réaction. Enfin, l’aspect « click » de la réaction CuSAC a été illustré par l’application de cette réaction au marquage d’une protéine. / Discovery of new reactions is one of the fundamental goals in organic chemistry. In addition to the traditional approach to reaction discovery, consisting in designing a reaction on the basis of known chemical properties of reagents, new approaches based on the screening of random combinations of reactive functions and catalysts have been recently developed. The main prerequisite of this strategy is an analytical tool allowing screening of a big number of reactions per day and identifying combinations leading to the formation of unanticipated products. In the work presented herein a high-throughput immunoassay screening has been used for the discovery of new coupling reactions. In the first part of this work a screening of 2688 combinations of randomly chosen reactive functions and catalysts was carried out. This screening led to the discovery of two copper-promoted coupling reactions: a reaction between thioureas and phenols leading to the formation of isoureas through desulfurization; and a reaction between N-hydroxythioureas and alkynes leading to the formation of thiazole-2-imines. In the second part of the work a screening of 2816 combinations of rationally designed chemical functions and catalysts was carried out. This screening was focused on the discovery of catalytic [3+2] cycloadditions that comply with the standards of “click” chemistry. In this study, the use of immunoassay screening was extended to optimize new reactions and to evaluate their kinetics, chemoselectivity and biocompatibility. Therefore, around 3000 complementary tests were carried out on the hits, identified in the primary screening. This allowed the discovery of 3 new coupling reactions and one new “click” reaction: a copper-catalyzed sydnone-alkyne cycloaddition (CuSAC). The last part of the work was focused on detailed studies of the CuSAC reaction. Identification of the structure of the coupling product and substrate scope of this reaction was carried out. Finally, the applicability of the CuSAC reaction for bioconjugation was demonstrated by an example of protein labeling.

Les dégénérescences lobaires frontotemporales (DLFT) représentent la deuxième étiologie neurodégénérative chez l’adulte de moins de 65 ans. Les DLFT sont constituées d’un ensemble hétérogène de phénotypes cliniques et sont fréquemment héréditaires. Leurs particularités neuropathologiques communes reposent sur une atrophie des lobes frontaux et/ou temporaux associée à la présence d’inclusions de protéines agrégées parmi lesquelles la protéine TAR DNA binding protein 43 (TDP43). Actuellement, aucun marqueur protéique n’est validé pour diagnostiquer les DLFT du vivant du patient.Une cohorte de cas certains DLFT-TDP43 a été constituée grâce au développement d’outils spécifiques de diagnostic moléculaire. Une analyse des concentrations pondérales de protéine TDP43 dans le liquide cérébrospinal (LCS) a été réalisée dans cette cohorte, puis comparée à des cohortes bien caractérisées sur le plan clinique et neuropathologique. Finalement, les profils qualitatifs de la protéine TDP43 ont été étudiés dans différents compartiments accessibles du vivant du patient : les profils des formes solubles (LCS et plasma) et des formes intracellulaires (éléments figurés du sang) de la protéine TDP43 ont été comparés aux profils protéiques obtenus sur des tissus cérébraux présentant des inclusions de protéine TDP43. Les profils protéiques des culots plaquettaires présentent des similitudes avec le tissu cérébral et pourraient devenir un marqueur candidat pour le diagnostic probabiliste des DLFT / Frontotemporal lobar degeneration (FTLD) syndrome is the second most common of presenile dementia. FTLD is a clinically heterogeneous syndrome and comprises many hereditary cases. Common neuropathological features rely on a degeneration of the frontal and/or anterior temporal lobes, associated to specific inclusions of aggregated proteins including TAR DNA binding protein 43 (TDP43). Unfortunately, no practical protein marker is currently validated to improve FTLD diagnosis in living patients.A cohort of FTLD patients with definite TDP43 pathology was defined with the development of specific genetic testing. An analysis of TDP43 concentrations in cerebrospinal fluid (CSF) was performed in this cohort and then compared to other cohorts well-characterized on clinical and neuropathological features. Finally, qualitative patterns of TDP43 were studied in compartments accessible from the patient’s living: profiles of soluble TDP43 protein (in CSF or in plasma) and intracellular TDP43 protein (in the formed elements of blood) were compared to protein patterns observed in brain tissues with TDP43 protein inclusions. Platelet samples exhibit similar characteristics to brain tissue and could become a candidate biomarker for FTLD probabilistic diagnosis

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Les mutations de résistance pour une molécule sont produites avant que la molécule en question ne soit utilisée, et c’est sous « pression de sélection » que la souche résistante va être sélectionnée. Des données récentes montrent que des variants résistants minoritaires (VRMs) peuvent être une source d’échec virologique. Les nouvelles techniques de séquençage sont bien plus sensibles que les techniques classiques de séquençage et permettent la détection des VRMs. Afin d’évaluer l’intérêt de l’utilisation de ces techniques, nous avons étudié les prélèvements de patients en situation d’échec virologique après traitement par deux combinaisons antirétrovirales très utilisées (tenofovir/emtricitabine/efarirenz et tenofovir/emtricitabine/rilpivirine). De nombreux variants de résistance supplémentaires ont été détectés, touchant principalement la classe des Inhibiteurs Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INTIs), avec un impact potentiel sur le choix du traitement de relais. Nous avons également étudié la prévalence des mutations de résistance transmise sur le gène de la protéase et de la transcriptase inverse chez des patients naïfs chroniquement infectés, chez deux groupes de transmission : des patients hommes ayant des rapports avec d’autres hommes (HSH), et des patients hétérosexuels. Nous avons retrouvé une prévalence plus élevée de mutations touchant les INTIs dans le groupe des patients hétérosexuels. Parmi les patients HSH, ceux infectés par un virus de sous-type B étaient plus fréquemment infectés par un virus résistant. Cette thèse met en avant la puissance des ces techniques, dont les conditions d'utilisation ne sont pas encore complètement définies. / Resistance mutations for a given molecule are produced before the molecule is used, and it is under "selection pressure" that the resistant strain will be selected. Recent data show that minority resistant variants (MRV) can be a source of virologic failure. New sequencing techniques are much more sensitive than conventional sequencing techniques and allow MRV detection. To assess the value of these new techniques, we studied samples from patients experiencing virologic failure after treatment with two antiretroviral combinations widely used (tenofovir/emtricitabine/efarirenz et tenofovir/emtricitabine/rilpivirine). Many additional resistance variants affecting the class of nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) were detected, with a potential impact on the choice of the subsequent regimen. We also studied the prevalence of transmitted resistance mutations in the protease and reverse transcriptase genes among naive patients chronically infected, among two groups of transmission: patients of men who have sex with men (MSM) and heterosexual patients. We found a higher prevalence of NRTI mutations among the heterosexual group. Among MSM patients, those infected with subtype B viruses were more frequently infected with a resistant virus. This thesis highlights the power of these techniques, the conditions of use are not yet fully defined.

Le séquençage à haut débit est une technique très utile pour l’étude des ARN. Pendant mon doctorat, nous l’avons utilisé pour la caractérisation des ARN extracellulaire (ARNex) du plasma humain. Les ARNex du plasma sont retrouvés soit à l’état soluble sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ou encapsulés au sein de vésicules extracellulaires (VE) de diverses origines (exosomes, microvesicles, …). Dans ce projet, j’ai démontré que le plasma contenait principalement des micro ARN, le fragment hY4 et des ARN ribosomiques dégradés. Par ailleurs, après chromatographie à exclusion de tailles ou par traitement consécutif protéinase K/RNase A, des VE hautement purifiées peuvent être obtenus. Nous ne retrouvons plus en majorité les micro ARN et l’ARN hY4 dans ces échantillons mais plutôt des ARN du microbiote humain, montrant une composition différente entre les ARNex solubles et ceux des vésicules purifiées. Par ailleurs, j’ai également effectué une étude comparative de kits commerciaux qui sont supposés purifier les exosomes par précipitation. La composition en ARN de ces fractions est très similaire au plasma humain total, montrant une forte contamination par les RNP solubles. Ainsi, nous sommes en mesure de proposer un protocole pour l’étude des ARNex dans le cadre de biopsies liquides avec des échantillons cliniques afin de découvrir de potentiels biomarqueurs de diagnostic. Au-delà de la caractérisation d’ARN, le séquençage à haut-débit peut être utilisé pour la détection et quantification des modifications post-transcriptionnelles. Pendant ma thèse, j’ai utilisé le séquençage pour l’analyse des 2’O-méthylation des ARN de transfert chez E. coli par RiboMethSeq. Sous plusieurs conditions de stress (manque de nutriments ou des concentrations non létales d’antibiotiques), certaines 2’O-méthylations montrent une réponse adaptative. Alors que plus de la moitié des 2’O-méthylations en position 18 (Gm18) sont augmentées dans toutes les conditions de stress étudiées, les positions Nm34 montrent un effet opposé avec une diminution dans certains stress (chloramphénicol et streptomycine). Chacun de ces deux comportements peut être relié à un phénomène de régulation cellulaire en réponse au stress : un changement au niveau de la wobble base pourrait être un moyen de réguler la traduction en modifiant l’usage des codons. En ce qui concerne Gm18, son rôle dans l’évasion du système immunitaire inné lors de l’invasion d’un hôte est en cours d’élucidation. / For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNA and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were not present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which are supposed to purify human exosomes by precipitation. Their RNA composition was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments (chloramphenicol and streptomycin). Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated.

Les zéolithes sont largement utilisées en catalyse. Un enjeu majeur est d'obtenir des cristaux nanométriques qui offrent des perspectives prometteuses dans la conception de catalyseurs acides plus actifs et plus sélectifs, notamment pour les procédés de conversion des coupes lourdes pétrolières. L'obtention de ces nano-cristaux peut résulter de l'utilisation d'inhibiteurs de croissance. Cette thèse s'est attachée à identifier deux familles de composés organiques limitant la croissance des cristaux. Pour la première, l'inhibition est envisagée par adsorption de composés organiques (polycations, acides aminés...) sur la surface des cristaux en formation. Cette étude a été réalisée en suivant une méthodologie d'expérimentation à haut-débit et a conduit à des cristaux de zéolithe Y (FAU) de 300 nm par l'ajout de L-lysine. La seconde famille est dérivée de l’approche de l’équipe de Ryoo et consiste en l’utilisation de composés bifonctionnels comportant une fonction structurante et une fonction inhibitrice de croissance. Cette étude a démarré par la synthèse de zéolithe MFI. La modélisation moléculaire a permis d'identifier un mono-ammonium alkylé favorisant la formation de nanofeuillets de zéolithe ZSM-5 d'épaisseur voisine de 2 nm. L'étude cinétique a révélé par ailleurs que cette zéolithe est synthétisée à partir d’un polysilicate lamellaire formé in situ. Cette stratégie d'identification, couplée à une méthodologie d'expérimentation à haut débit, a alors été appliquée à la synthèse des zéolithes EMC-1 (FAU) et EMC-2 (EMT), et a conduit à l'élaboration de nouveaux agents structurants et composés bi-fonctionnels. / Zeolites are widely used in catalysis. One of today’s major challenges is to obtain nanometer-sized crystals, offering promising prospects for the design of more active and more selective acid catalysts, in particular for heavy oil conversion processes. Zeolite nanocrystals can be obtained by using growth inhibitors. This thesis focused on the identification of two families of organic compounds limiting the crystals growth. For the first one, the growth inhibition is favored by the adsorption of organic compounds (polycations, amino acids…) on the surface of growing crystals. This study was conducted using a high-throughput experiment methodology and led to zeolite Y (FAU) crystals of 300 nm by the addition of L-lysine. The second family is derived from Ryoo’s team approach and consists of the use of bifunctional compounds including one structure-directing function and one growth-inhibiting function. This study started with the synthesis of MFI zeolite. The molecular modelling allowed identifying an alkyl mono-ammonium directing the formation of 2 nm-thick nanosheets of zeolite ZSM-5. The kinetic study revealed that this zeolite is synthesized from a lamellar polysilicate formed in situ. This identification strategy, coupled to a high-troughput experiment methodology, was applied to the synthesis of zeolites EMC-1 (FAU) and EMC-2 (EMT) and conducted to the elaboration of new structure-directing agents and their bifunctional counterparts.