A evolução da resistência de insetos a culturas que expressam proteínas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) é o maior desafio para a manutenção dessa biotecnologia em programas de manejo integrado de pragas. Diante do risco de evolução de resistência de Helicoverpa armigera (Hübner) à soja MON87701 × MON89788 foi realizada uma análise de risco levando em consideração o conjunto de fatores que influenciam no processo de seleção. Portanto, os objetivos do presente estudo foram a de caracterizar a suscetibidade à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera e H. zea, caracterizar a eficácia da soja MON87701 × MON89788, bem como a adequação do produto ao conceito de alta dose para H. armigera e H. zea, avaliar a frequência dos alelos que conferem resistência à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera, identificar a preferência hospedeira de H. armigera e H. zea em diferentes culturas e paisagens agrícolas e avaliar os parâmetros biológicos e demográficos de H. armigera e H. zea em diferentes hospedeiros. A espécie H. zea foi aproximadamente 60 vezes mais tolerante à proteína Cry1Ac que H. armigera. Além disso, baixa variabilidade na suscetibilidade à Cry1Ac foi verificada em populações de H. armigera coletadas em diferentes regiões do Brasil, o que pode ser explicada pela recente introdução dessa espécie no continente americano. A soja MON87701 × MON89788 resultou em mortalidade completa de H. armigera durante todo o ciclo da cultura, enquanto que para H. zea não foi verificado 100% de mortalidade sob condições de laboratório em bioensaios de cinco dias de duração, apesar dos altos níveis de mortalidade encontrados. Uma baixa frequência (frequência estimada = 0,0011) de alelos que conferem resistência à soja MON87701 × MON89788 em populações de campo de H. armigera foi estimada pelo método de F2 screen. A avaliação da tabela de vida em laboratório demonstrou que H. armigera tem altos níveis de desenvolvimento e a reprodução nas principais culturas das regiões dos Cerrados, sendo a cultura do algodão a que resulta nos maiores valores de crescimento populacional e menor tempo entre gerações. Por outro lado, H. zea se mostrou menos polífaga, se estabelecendo até a fase adulta e gerando descendentes apenas em milho e milheto. A ocorrência das duas espécies no campo corrobora com as informações encontradas na tabela de vida, na qual H. armigera foi encontrada em grande parte as culturas da soja e algodão, e em menor frequência à cultura do milho, enquanto que H. zea apresentou comportamento funcionalmente monófago no campo, associada apenas à cultura do milho. Os parâmetros toxicológicos da soja MON87701 × MON89788 associada à alta suscetibilidade de H. armigera à proteína Cry1Ac e à baixa frequência inicial de alelos que conferem resistência se adéquam aos preceitos da estratégia de alta dose/refúgio. A manutenção das áreas de refúgio com plantas não-Bt, de acordo com as recomendações, é essencial para retardar o processo de seleção de resistência de populações de H. armigera à soja MON87701 × MON89788 no Brasil. / Insect resistance to crops expressing proteins derived from Bacillus thuringiensis proteins (Bt) impose the biggest challenge to maintaining the value of this biotechnology in integrated pest management programs. To support a resistance to Helicoverpa armigera (Hübner) to soybean MON87701 × MON89788 was carried out a risk analysis taking into account all factors that influence the selection process. Therefore, the objectives of this study were to characterize the suscetibidade the Cry1Ac protein in H. armigera populations and H. zea, characterize the effectiveness of soybean MON 87701 × MON 89788, as well as the suitability of the product to the concept of high dose H. armigera and H. zea, evaluate the frequency of alleles that confer resistance to Cry1Ac protein in H. armigera populations from different regions of agricultural production, understand the host preference of H. armigera and H. zea in different crops in and agricultural landscapes and evaluate the biological and demographic parameters of H. armigera and H. zea on different hosts. The species H. zea was approximately 60 times more tolerant to Cry1Ac protein than H. armigera. Low variability on susceptibility to Cry1Ac was found among field H. armigera populations, what can be explained by the recent introduction of this species into America. MON 87701 × MON 89788 soybean resulted in complete mortality of H. armigera throughout the crop cycle, while incomplete mortality was found for H. zea using leaf disc bioassays, although high levels of mortality were found. A low resistance allele frequency (estimated frequency = 0.0011) to MON 87701 × MON 89788 soybean was estimated by using the F2 screen methodology. The assessment of the Life Table parameters in laboratory demonstrated the main row crops such as cotton, soybean and maize are suitable for the development and reproduction of H. armigera, wherein cotton resulted in higher values of population growth parameter and shorter times between generations. Conversely, H. zea was less polyphagous in which only corn and millet were suitable hosts. Field occurrence of both species was consistent with laboratory studies. H. amigera was mostly found in soybean and cotton, and rarely on corn, while H. zea was found mainly on maize. Overall, toxicological aspects of MON87701 × MON89788 soybean associated with high susceptibility of H. armigera to Cry1Ac protein and low initial resistance allele frequency fit properly to the highdose/ refuge strategy to delay resistance evolution. Therefore, maintenance of compliance with the refuge recommendation is essential to delay the evolution of resistance in H. armigera to MON87701 × MON89788 soybean in Brazil.

A evolução da resistência de insetos a culturas que expressam proteínas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) é o maior desafio para a manutenção dessa biotecnologia em programas de manejo integrado de pragas. Diante do risco de evolução de resistência de Helicoverpa armigera (Hübner) à soja MON87701 × MON89788 foi realizada uma análise de risco levando em consideração o conjunto de fatores que influenciam no processo de seleção. Portanto, os objetivos do presente estudo foram a de caracterizar a suscetibidade à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera e H. zea, caracterizar a eficácia da soja MON87701 × MON89788, bem como a adequação do produto ao conceito de alta dose para H. armigera e H. zea, avaliar a frequência dos alelos que conferem resistência à proteína Cry1Ac em populações de H. armigera, identificar a preferência hospedeira de H. armigera e H. zea em diferentes culturas e paisagens agrícolas e avaliar os parâmetros biológicos e demográficos de H. armigera e H. zea em diferentes hospedeiros. A espécie H. zea foi aproximadamente 60 vezes mais tolerante à proteína Cry1Ac que H. armigera. Além disso, baixa variabilidade na suscetibilidade à Cry1Ac foi verificada em populações de H. armigera coletadas em diferentes regiões do Brasil, o que pode ser explicada pela recente introdução dessa espécie no continente americano. A soja MON87701 × MON89788 resultou em mortalidade completa de H. armigera durante todo o ciclo da cultura, enquanto que para H. zea não foi verificado 100% de mortalidade sob condições de laboratório em bioensaios de cinco dias de duração, apesar dos altos níveis de mortalidade encontrados. Uma baixa frequência (frequência estimada = 0,0011) de alelos que conferem resistência à soja MON87701 × MON89788 em populações de campo de H. armigera foi estimada pelo método de F2 screen. A avaliação da tabela de vida em laboratório demonstrou que H. armigera tem altos níveis de desenvolvimento e a reprodução nas principais culturas das regiões dos Cerrados, sendo a cultura do algodão a que resulta nos maiores valores de crescimento populacional e menor tempo entre gerações. Por outro lado, H. zea se mostrou menos polífaga, se estabelecendo até a fase adulta e gerando descendentes apenas em milho e milheto. A ocorrência das duas espécies no campo corrobora com as informações encontradas na tabela de vida, na qual H. armigera foi encontrada em grande parte as culturas da soja e algodão, e em menor frequência à cultura do milho, enquanto que H. zea apresentou comportamento funcionalmente monófago no campo, associada apenas à cultura do milho. Os parâmetros toxicológicos da soja MON87701 × MON89788 associada à alta suscetibilidade de H. armigera à proteína Cry1Ac e à baixa frequência inicial de alelos que conferem resistência se adéquam aos preceitos da estratégia de alta dose/refúgio. A manutenção das áreas de refúgio com plantas não-Bt, de acordo com as recomendações, é essencial para retardar o processo de seleção de resistência de populações de H. armigera à soja MON87701 × MON89788 no Brasil. / Insect resistance to crops expressing proteins derived from Bacillus thuringiensis proteins (Bt) impose the biggest challenge to maintaining the value of this biotechnology in integrated pest management programs. To support a resistance to Helicoverpa armigera (Hübner) to soybean MON87701 × MON89788 was carried out a risk analysis taking into account all factors that influence the selection process. Therefore, the objectives of this study were to characterize the suscetibidade the Cry1Ac protein in H. armigera populations and H. zea, characterize the effectiveness of soybean MON 87701 × MON 89788, as well as the suitability of the product to the concept of high dose H. armigera and H. zea, evaluate the frequency of alleles that confer resistance to Cry1Ac protein in H. armigera populations from different regions of agricultural production, understand the host preference of H. armigera and H. zea in different crops in and agricultural landscapes and evaluate the biological and demographic parameters of H. armigera and H. zea on different hosts. The species H. zea was approximately 60 times more tolerant to Cry1Ac protein than H. armigera. Low variability on susceptibility to Cry1Ac was found among field H. armigera populations, what can be explained by the recent introduction of this species into America. MON 87701 × MON 89788 soybean resulted in complete mortality of H. armigera throughout the crop cycle, while incomplete mortality was found for H. zea using leaf disc bioassays, although high levels of mortality were found. A low resistance allele frequency (estimated frequency = 0.0011) to MON 87701 × MON 89788 soybean was estimated by using the F2 screen methodology. The assessment of the Life Table parameters in laboratory demonstrated the main row crops such as cotton, soybean and maize are suitable for the development and reproduction of H. armigera, wherein cotton resulted in higher values of population growth parameter and shorter times between generations. Conversely, H. zea was less polyphagous in which only corn and millet were suitable hosts. Field occurrence of both species was consistent with laboratory studies. H. amigera was mostly found in soybean and cotton, and rarely on corn, while H. zea was found mainly on maize. Overall, toxicological aspects of MON87701 × MON89788 soybean associated with high susceptibility of H. armigera to Cry1Ac protein and low initial resistance allele frequency fit properly to the highdose/ refuge strategy to delay resistance evolution. Therefore, maintenance of compliance with the refuge recommendation is essential to delay the evolution of resistance in H. armigera to MON87701 × MON89788 soybean in Brazil.

Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013 causing serious damage to several crops, especially soybean and cotton crops. Because of this severe damage and also because H. armigera is more tolerant to insecticides in compare to other lepidopteran pests in Brazil, there was a significant increase of selection pressure with insecticides in the field. Many cases of insecticide resistance, especially to pyrethroids, have been reported in some countries of the Old World. The main objective of the present study was to characterize the susceptibility of H. armigera and to investigate the mechanisms of its resistance to pyrethroids and indoxacarb in Brazilian populations. Mortality of H. armigera populations was less than 50% when treated with the highest dose of 10 μg a.i./3rd-instar larva of fenvalerate and deltamethrin. Field populations of H. armigera monitored from 2013 to 2016 growing seasons showed mean mortalities of 10 to 40% at the diagnostic dose of 10 μg a.i./3rd-instar larva. The resistance ratio to pyrethroid was 780-fold. The frequency of the chimeric P450 CYP337B3 gene was above 0.95 in all 33 populations screened. The genetic basis of H. armigera resistance to pyrethroids was also investigated. The dominance degree varied from 0.66 to 0.92, i.e., incompletely to completely dominant, and resistance was characterized as autosomal and polygenic. Possible mutations in the sodium channel were investigated, as well as the expression of other P450 genes via RT-qPCR. Two non-synonymous mutations, V937G and Q960H were found, and the genes CYP6AB10, CYP301A, CYP4S13 and CYP321A5 were up-regulated in the Brazilian pyrethroid-resistant strain compared to the susceptible strain. The susceptibility of H. armigera populations to indoxacarb was characterized with a diet overlay bioassay in 3rd-instar larvae. LC50 values ranged from 0.22 (0.16-0.28) μg a.i./cm2 to 0.57 (0.41-0.82) μg a.i./cm2, varying 2.6-fold. The populations were monitored through the 2013-2017 growing seasons, with the diagnostic dose of 6.1 μg a.i./cm2; during the period, the susceptibility to indoxacarb decreased. An indoxacarb-resistant strain was selected under laboratory conditions and showed a resistance ratio of 297.5-fold. These results will contribute to decision-making and implementation of insect resistance-management (IRM) programs in Brazil and other recently invaded countries in Brazil. / Helicoverpa armigera (Hübner) foi reportada oficialmente no Brasil em 2013, ano em que causou grandes perdas em lavouras de soja e algodão no país. Devido ao ataque severo de H. armigera e por ser mais tolerante do que as demais pragas que ocorriam no Brasil, houve um aumento significativo da pressão de seleção com inseticidas no campo. Inúmeros casos de resistência desta praga a inseticidas do grupo dos piretroides já havia sido reportado em alguns países do Velho Mundo. Dentro desse contexto o objetivo desse trabalho foi caracterizar a suscetibilidade e investigar possíveis mecanismos de resistência a piretroides bem como indoxacarb no Brasil. A mortalidade das populações de H. armigera foi menor do que 50 % quando tratadas com a dose máxima de 10 μg i.a./lagarta de 3º instar para fenvalerato e deltametrina. As populações de campo de H. armigera monitoradas entre os anos de 2013 a 2016 na dose diagnóstica de 10 μg i.a./lagarta de 3º instar apresentaram mortalidade de 10 a 40%. A frequência do gene P450 CYP337B3 foi maior do que 0,95 em 33 populações testada. Além disso, as bases genéticas da resistência de H. armigera a piretroides foram investigadas e a razão de resistência com a linhagem suscetível foi de 780 vezes. O grau de dominância variou de 0,66 a 0,92, incompletamente e completamente dominante e a resistência foi caracterizada como autossômica e poligênica. Adicionalmente investigou-se a presença de possíveis mutações no canal de sódio bem como a expressão de outros genes P450 em uma linhagem resistente a piretroides. Foi possível detectar duas mutações não-sinonímias V937G, e Q960H no canal de sódio e os genes CYP6AB10, CYP301A, CYP4S13 e CYP321A5 foram super expressos na linhagem resistente. A suscetibilidade de populações de H. armigera para o inseticida indoxacarb foi caracterizada a partir de bioensaios de ingestão com lagartas de 3° instar. Os valores de CL50 variaram de 0,22 (0,16 - 0,28) μg i.a./cm2 até 0,57 (0,41 - 0,82) μg i.a./cm2 variando em 2,6 vezes. As populações foram monitoradas ao longo das safras agrícolas entre 2013 e 2017 com a concentração diagnóstica de 6,1 μg i.a./cm2 e observou-se uma diminuição na suscetibilidade da praga a indoxacarb. Uma linhagem resistente a indoxacarb foi selecionada em laboratório e comparada com uma linhagem suscetível de referência, apresentando uma razão de resistência de 297,5 vezes. Os resultados obtidos são extremamente importantes e poderão contribuir na tomada de decisões bem como na implementação de programas de manejo da resistência de insetos (MRI) no Brasil.

Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013. This species is closely related to Helicoverpa zea (Boddie) and has caused significant crop damage in Brazil. The use of genetically modified crops expressing insecticidal protein from Bacillus thuringiensis (Berliner) has been one of the control tactics for managing these pests. Genetically modified maize expressing Vip3Aa20 was approved to commercial use in Brazil in 2009. Understanding the genetic diversity and the susceptibility to B. thuringiensis proteins in H. armigera and H. zea populations in Brazil are crucial for establishing Insect Resistance Management (IRM) programs in Brazil. Therefore, the objectives of this study were: (a) to infer demographic parameters and genetic structure of H. armigera and H. zea Brazil; (b) to assess the intra and interspecific gene flow and genetic diversity of H. armigera and H. zea; and (c) to evaluate the susceptibility to Vip3Aa20 protein in H. armigera and H. zea populations of Brazil. A phylogeographic analysis of field H. armigera and H. zea populations was performed using a partial sequence data from the cytochrome c oxidase I (COI) gene. H. armigera individuals were most prevalent on dicotyledonous hosts and H. zea individuals were most prevalent on maize crops. Both species showed signs of demographic expansion and no genetic structure. High genetic diversity and wide distribution were observed for H. armigera. A joint analysis indicated the presence of Chinese, Indian, and European lineages within the Brazilian populations of H. armigera. In the cross-species amplification study, seven microsatellite loci were amplified; and showed a potential hybrid offspring in natural conditions. Interespecific analyses using the same microsatellite loci with Brazilian H. armigera and H. zea in compare to the USA H. zea were also conducted. When analyses were performed within each species, 10 microsatellites were used for H. armigera, and eight for H. zea. We detected high intraspecific gene flow in populations of H. armigera and H. zea from Brazil and H. zea from the USA. Genetic diversity was similar for both species. However, H. armigera was more similar to H. zea from Brazil than H. zea from the USA and some putative hybrid individuals were found in Brazilian populations.Tthere was low gene flow between Brazilian and USA H. zea. The baseline susceptibility to Vip3Aa20 resulted in low interpopulation variation for H. zea (3-fold) and for H. armigera (5-fold), based on LC50. H. armigera was more tolerant to Vip3Aa20 than H. zea (≈ 40 to 75-fold, based on CL50). The diagnostic concentration for susceptibility monitoring, based on CL99, was fairly high (6,400 ng Vip3Aa20/cm2) for H. zea and not validated for H. armigera due to the high amount of protein needed for bioassays. Implementing IRM strategies to Vip3Aa20 in H. armigera and H. zea will be of a great challenge in Brazil, mainly due to the low susceptibility to Vip3Aa20 and high genetic diversity and gene flow in both species, besides a potential of hybrid individuals between H. armigera and H. zea under field conditions. / Helicoverpa armigera (Hübner) foi oficialmente reportada no Brasil em 2013. Esta espécie é estreitamente relacionada a Helicoverpa zea (Boddie) e tem causado danos significativos nas culturas no Brasil. O uso de plantas geneticamente modificadas, que expressam proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis (Berliner), tem sido uma das táticas de controle para o manejo dessas pragas. O milho geneticamente modificado que expressa Vip3Aa20 foi aprovado para comercialização no Brasil em 2009. O entendimento da diversidade genética e da suscetibilidade às proteínas de B. thuringiensis em populações de H. armigera e H. zea no Brasil são cruciais para o estabelecimento de programas de Manejo da Resistência de Insetos (MRI). Assim, os objetivos desse estudo foram: (a) inferir parâmetros demográficos e estrutura genética de H. armigera e H. zea no Brasil; (b) avaliar o fluxo gênico intra e interespecífico e a diversidade genética em H. armigera e H. zea; e (c) aferir a suscetibilidade de populações brasileiras de H. armigera e H. zea a proteína Vip3Aa20. Uma análise filogeográfica de populações de campo de H. armigera e H. zea foi realizada com o uso de sequências do gene citocromo c oxidase I (COI). Indivíduos de H. armigera foram mais prevalentes em dicotiledôneas e H. zea na cultura do milho. Ambas as espécies mostraram sinais de expansão demográfica e ausência de estrutura genética. Alta diversidade genética e ampla distribuição foram observadas em H. armigera. Análises conjuntas indicaram a presença de linhagens da China, Índia e Europa em populações brasileiras de H. armigera. A partir de um estudo de amplificação cruzada de microssatélites, sete locos amplificaram em ambas as espécies e evidenciaram a possibilidade de hibridização no campo. Estes mesmos locos foram usados para análises interespecíficas de H. armigera e H. zea do Brasil em comparação a H. zea dos EUA. Nas análises para cada espécie, 10 microssatélites foram usados para H. armigera e oito para H. zea. Alto fluxo gênico intraespecífico foi detectado em populações de H. armigera e H. zea. A diversidade genética foi similar em ambas as espécies. H. armigera foi mais similar a H. zea do Brasil que dos EUA e possíveis híbridos foram encontrados nas populações brasileiras. Houve um baixo fluxo gênico entre populações brasileiras e americanas de H. zea. A linha-básica de suscetibilidade a Vip3Aa20 resultou numa variação interpopulacional baixa em H. zea (3 vezes) e em H. armigera (5 vezes), baseada na CL50. H. armigera foi mais tolerante a Vip3Aa20 que H. zea (≈ 40 to 75 vezes, baseado na CL50). A concentração diagnóstica, baseada na CL99, foi bastante alta (6.400 ng Vip3Aa20/cm2) para H. zea e não validada para H. armigera devido à alta quantidade de proteína necessária para os bioensaios. A implementação de estratégias de MRI a Vip3Aa20 em H. armigera e H. zea serão um grande desafio no Brasil, principalmente devido à baixa suscetibilidade a Vip3Aa20 e alta diversidade genética e fluxo gênico em ambas as espécies, além da possibilidade de indivíduos híbridos entre H. armigera e H. zea nas condições de campo.

Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013. This species is closely related to Helicoverpa zea (Boddie) and has caused significant crop damage in Brazil. The use of genetically modified crops expressing insecticidal protein from Bacillus thuringiensis (Berliner) has been one of the control tactics for managing these pests. Genetically modified maize expressing Vip3Aa20 was approved to commercial use in Brazil in 2009. Understanding the genetic diversity and the susceptibility to B. thuringiensis proteins in H. armigera and H. zea populations in Brazil are crucial for establishing Insect Resistance Management (IRM) programs in Brazil. Therefore, the objectives of this study were: (a) to infer demographic parameters and genetic structure of H. armigera and H. zea Brazil; (b) to assess the intra and interspecific gene flow and genetic diversity of H. armigera and H. zea; and (c) to evaluate the susceptibility to Vip3Aa20 protein in H. armigera and H. zea populations of Brazil. A phylogeographic analysis of field H. armigera and H. zea populations was performed using a partial sequence data from the cytochrome c oxidase I (COI) gene. H. armigera individuals were most prevalent on dicotyledonous hosts and H. zea individuals were most prevalent on maize crops. Both species showed signs of demographic expansion and no genetic structure. High genetic diversity and wide distribution were observed for H. armigera. A joint analysis indicated the presence of Chinese, Indian, and European lineages within the Brazilian populations of H. armigera. In the cross-species amplification study, seven microsatellite loci were amplified; and showed a potential hybrid offspring in natural conditions. Interespecific analyses using the same microsatellite loci with Brazilian H. armigera and H. zea in compare to the USA H. zea were also conducted. When analyses were performed within each species, 10 microsatellites were used for H. armigera, and eight for H. zea. We detected high intraspecific gene flow in populations of H. armigera and H. zea from Brazil and H. zea from the USA. Genetic diversity was similar for both species. However, H. armigera was more similar to H. zea from Brazil than H. zea from the USA and some putative hybrid individuals were found in Brazilian populations.Tthere was low gene flow between Brazilian and USA H. zea. The baseline susceptibility to Vip3Aa20 resulted in low interpopulation variation for H. zea (3-fold) and for H. armigera (5-fold), based on LC50. H. armigera was more tolerant to Vip3Aa20 than H. zea (≈ 40 to 75-fold, based on CL50). The diagnostic concentration for susceptibility monitoring, based on CL99, was fairly high (6,400 ng Vip3Aa20/cm2) for H. zea and not validated for H. armigera due to the high amount of protein needed for bioassays. Implementing IRM strategies to Vip3Aa20 in H. armigera and H. zea will be of a great challenge in Brazil, mainly due to the low susceptibility to Vip3Aa20 and high genetic diversity and gene flow in both species, besides a potential of hybrid individuals between H. armigera and H. zea under field conditions. / Helicoverpa armigera (Hübner) foi oficialmente reportada no Brasil em 2013. Esta espécie é estreitamente relacionada a Helicoverpa zea (Boddie) e tem causado danos significativos nas culturas no Brasil. O uso de plantas geneticamente modificadas, que expressam proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis (Berliner), tem sido uma das táticas de controle para o manejo dessas pragas. O milho geneticamente modificado que expressa Vip3Aa20 foi aprovado para comercialização no Brasil em 2009. O entendimento da diversidade genética e da suscetibilidade às proteínas de B. thuringiensis em populações de H. armigera e H. zea no Brasil são cruciais para o estabelecimento de programas de Manejo da Resistência de Insetos (MRI). Assim, os objetivos desse estudo foram: (a) inferir parâmetros demográficos e estrutura genética de H. armigera e H. zea no Brasil; (b) avaliar o fluxo gênico intra e interespecífico e a diversidade genética em H. armigera e H. zea; e (c) aferir a suscetibilidade de populações brasileiras de H. armigera e H. zea a proteína Vip3Aa20. Uma análise filogeográfica de populações de campo de H. armigera e H. zea foi realizada com o uso de sequências do gene citocromo c oxidase I (COI). Indivíduos de H. armigera foram mais prevalentes em dicotiledôneas e H. zea na cultura do milho. Ambas as espécies mostraram sinais de expansão demográfica e ausência de estrutura genética. Alta diversidade genética e ampla distribuição foram observadas em H. armigera. Análises conjuntas indicaram a presença de linhagens da China, Índia e Europa em populações brasileiras de H. armigera. A partir de um estudo de amplificação cruzada de microssatélites, sete locos amplificaram em ambas as espécies e evidenciaram a possibilidade de hibridização no campo. Estes mesmos locos foram usados para análises interespecíficas de H. armigera e H. zea do Brasil em comparação a H. zea dos EUA. Nas análises para cada espécie, 10 microssatélites foram usados para H. armigera e oito para H. zea. Alto fluxo gênico intraespecífico foi detectado em populações de H. armigera e H. zea. A diversidade genética foi similar em ambas as espécies. H. armigera foi mais similar a H. zea do Brasil que dos EUA e possíveis híbridos foram encontrados nas populações brasileiras. Houve um baixo fluxo gênico entre populações brasileiras e americanas de H. zea. A linha-básica de suscetibilidade a Vip3Aa20 resultou numa variação interpopulacional baixa em H. zea (3 vezes) e em H. armigera (5 vezes), baseada na CL50. H. armigera foi mais tolerante a Vip3Aa20 que H. zea (≈ 40 to 75 vezes, baseado na CL50). A concentração diagnóstica, baseada na CL99, foi bastante alta (6.400 ng Vip3Aa20/cm2) para H. zea e não validada para H. armigera devido à alta quantidade de proteína necessária para os bioensaios. A implementação de estratégias de MRI a Vip3Aa20 em H. armigera e H. zea serão um grande desafio no Brasil, principalmente devido à baixa suscetibilidade a Vip3Aa20 e alta diversidade genética e fluxo gênico em ambas as espécies, além da possibilidade de indivíduos híbridos entre H. armigera e H. zea nas condições de campo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objectives of this study were to evaluate the effects of Bt toxin and seeds treatment with insecticides (imidacloprid + thiodicarb) on initial growth of corn and the control of Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) in soil; the effect of Bt corn and insecticides (seed treatment with imidacloprid + thiodicarb and spray application of novaluron and/or methomyl) for the control of S. frugiperda in crop shoots during early and late planting seasons; and the effects of Bt corn and insecticides control of S. frugiperda on the occurrences and damages from Diatraea sp. and Helicoverpa zea (Boddie) pests. Three experiments were conducted under field conditions and natural infestation of pests, in Itaara and Santiago, in Rio Grande do Sul state, Brazil, during the 2008/2009 planting seasons. The initial growth of corn was not affected by the production of Bt toxin (Cry1Ab) and insecticide seed treatment in areas without pest infestation. The toxin (Cry1Ab) present in the Bt corn as well as seeds treatment in non-transformed corn effectively protected the plants to cut-off S. frugiperda. Seeds treatment enables the reduction of damages caused by S. frugiperda in Bt corn (Cry1Ab) to the shoots of crops in early infestations. The Bt corn (Cry1Ab) is effective in controlling S. frugiperda, especially when infestations are low to moderate. When high infestations of S. frugiperda occurred in late planting, insecticide spray on Bt corn (Cry1Ab) resulted to less damages and fewer lavae development comparatively with unsprayed plots. Insecticide treatment of nontransformed corn seeds during early infestations of Diatraea sp. and Bt corn reduced the percentage of stems attacked and injuries. However, insecticides sprayed for the control of S. frugiperda had no effect on the percentage of stems attacked and the injuries caused by Diatraea sp.. Application of insecticides to seeds or spraying for the control of S. frugiperda did not affect the percentage of corn ears attacked and the injuries caused by H. zea, while the Bt corn (Cry1Ab) reduced the percentage of ears attacked by H. zea despite not having much effect in reducing the ear-feeding injuries. / O objetivo do estudo foi avaliar: o efeito da toxina Bt e do tratamento de semente com inseticidas (imidacloprido + tiodicarbe), no crescimento inicial das plantas de milho e no controle de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) no solo; o efeito do milho Bt e dos inseticidas (imidacloprido + tiodicarbe em tratamento de semente e novalurom e/ou metomil em pulverizações), no controle de S. frugiperda na parte aérea da cultura, na semeadura do cedo e do tarde; e os efeitos do milho Bt e dos inseticidas para o controle de S. frugiperda, na ocorrência e na injúria da Diatraea sp. e da Helicoverpa zea (Boddie). Foram realizados três experimentos em condições de campo e com infestação natural dos insetos-praga, em Itaara e Santiago, RS, durante a safra 2008/09. O crescimento inicial das plantas de milho não é afetado pela produção da toxina Bt (Cry1Ab) e pelos inseticidas em tratamento de semente, em áreas sem infestação de insetos-praga. A toxina Cry1Ab, presente no milho Bt, assim como o tratamento de semente no milho convencional, protegem de forma eficiente as plantas do corte de S. frugiperda. O tratamento de semente, possibilita a redução da injúria na parte aérea da cultura causada por S. frugiperda em milho Bt (Cry1Ab), em infestações precoces. O milho Bt (Cry1Ab) é eficiente no controle de S. frugiperda, especialmente quando as infestações são baixas a moderadas. Em época de semeadura, na qual ocorrem altas infestações de S. frugiperda, o milho Bt (Cry1Ab) quando pulverizado com inseticida, apresenta em relação ao sem pulverização, menos injúria e menor número de lagartas grandes. O tratamento de semente com inseticidas em milho convencional, quando em infestações precoces de Diatraea sp. e o milho Bt, reduzem as injúrias e o percentual de colmos atacados, porém os inseticidas pulverizados para o controle de S. frugiperda, não têm efeito sofre as injúrias e no percentual de colmos atacados por Diatraea sp.. Os inseticidas aplicados na semente ou em pulverizações para o controle de S. frugiperda, não afetam as injúrias e o percentual de espigas atacadas por H. zea, porém o milho Bt (Cry1Ab) reduz o percentual de espigas atacadas por H. zea, apesar de não ter efeito significativo na redução das injúrias nas espigas.

Os reguladores de crescimento de insetos têm sido um dos mais importantes grupos de inseticidas recomendados para o controle de Helicoverpa armigera (Hübner) e Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) no Brasil, que são consideradas pragas-chave de vários sistemas de produção agrícola. Para implementar programas de manejo da resistência de insetos, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar a suscetibilidade a inseticidas reguladores de crescimento de insetos em populações de H. armigera e S. frugiperda do Brasil. A caracterização das linhas-básica de suscetibilidade de H. armigera a lufenuron e methoxifenozide e de S. frugiperda a methoxifenozide foi realizada com bioensaio de tratamento superficial da dieta artificial com inseticida, utilizando-se lagartas de 3º instar. Foram verificadas baixa variabilidade na suscetibilidade de H. armigera a lufenuron, com DL50 variando de 0,30 a 1,02 &mu;g de i.a./cm2 de dieta, e a methoxifenozide, com DL50 de 2,61 a 8,02 &mu;g de i.a./cm2 de dieta, em populações coletadas em diferentes regiões agrícolas na safra 2013/2014. As doses diagnósticas, baseadas na DL99, foram de 6,36 &mu;g de i.a/cm2 de dieta para lufenuron e 31,10 &mu;g de i.a/cm2 de dieta para methoxifenozide. Foram observadas variações geográfica e temporal na suscetibilidade a lufenuron e methoxifenozide em populações de H. armigera coletadas nas safras de 2013/2014 a 2016/2017; contudo, não foi possível isolar linhagens de H. armigera resistentes a estes inseticidas, mediante o uso de técnicas de \"F2 screen\" e seleção massal. Uma baixa variabilidade na suscetibilidade de S. frugiperda a methoxifenozide foi observada para as populações coletadas na segunda safra de 2016, com DL50 variando de 0,5 a 2,1 &mu;g de i.a/cm2 de dieta. A dose diagnóstica (DL99) para monitoramento da suscetibilidade a methoxifenozide em populações de S. frugiperda foi de 6 &mu;g de i.a/cm2 de dieta. Na 2ª safra de 2016, a sobrevivência das populações de S. frugiperda avaliadas foram baixas, com valores inferiores a 10% na dose diagnóstica. Por outro lado, na 1ª safra de 2017, houve aumento na sobrevivência das populações testadas, atingindo valores de até 62%. A linhagem de S. frugiperda resistente a methoxifenozide selecionada em condições de laboratório apresentou uma baixa razão de resistência (&asymp;5 vezes). Os resultados da presente pesquisa confirmaram a alta suscetibilidade de H. armigera a lufenuron e methoxifenozide e de S. frugiperda a methoxyfenozide. As informações obtidas no presente estudo servirão para a implementação de programas proativos de manejo da resistência a esses inseticidas. / Insect growth regulators have been one of the most important group of insecticides recommended for controlling Helicoverpa armigera (Hübner) and Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) in Brazil which are considered key pests of several crop production systems. To implement insect resistance management programs, the objective of this research was to characterize the susceptibility to insect growth regulators in H. armigera and S. frugiperda populations from Brazil. Baseline susceptibilities of H. armigera to lufenuron and methoxifenozide and S. frugiperda to methoxifenozide were conducted with artificial diet overlay bioassays using 3rd instar larvae. There was low variability in the susceptibility of H. armigera to lufenuron, with LD50 ranging from 0.30 to 1.02 &mu;g of a.i./cm2 of diet, and to methoxifenozide, with LD50 of 2.61 to 8.02 &mu;g of a.i./cm2 of diet across populations collected in different agricultural regions in 2013/2014 growing season. The diagnostic doses, based on DL99, were 6.36 &mu;g of a.i./cm2 of diet for lufenuron and 31.10 &mu;g of a.i./cm2 of diet for methoxifenozide. Geographic and temporal variations in susceptibility to lufenuron and methoxifenozide were observed in populations of H. armigera collected from 2013/2014 to 2016/2017 growing seasons; however, it was not possible to isolate resistant strains to these insecticides using F2 screen and massal selection approaches. There was also a low variability in the susceptibility of S. frugiperda to methoxifenozide across populations collected in the 2nd crop season in 2016, with LD50 ranging from 0.5 to 2.1 &mu;g of a.i./cm2 of diet. The diagnostic dose (DL99) for monitoring the susceptibility to methoxifenozide in S. frugiperda populations was 6 &mu;g of a.i./cm2 of diet. In the 2nd crop season of 2016, the survival at diagnostic dose of S. frugiperda populations evaluated was low (< 10%). On the other hand, in the 1st crop season of 2017, there was a significant increase in the survival across the populations tested, with values reaching up to 62% at diagnostic dose. The laboratory-selected resistant strain of S. frugiperda to methoxifenozide showed a low resistance ratio (&asymp;5 times). We confirmed the high susceptibility of H. armigera to lufenuron and methoxifenozide and S. frugiperda to methoxifenozide in Brazil. The information collected in this study will be important for implementing a proactive resistance management programs to these insecticides.

O manejo de Helicoverpa armigera (Hübner) no Brasil tem sido baseado principalmente no controle químico. O uso de inseticidas de grupos químicos mais recentes, tais como diamidas e espinosinas, tem sido crescente no controle de H. armigera e de outros lepidópteros-praga que ocorrem em diferentes sistemas de produção de cultivos. Para a implementação de estratégias proativas de manejo da resistência de insetos, os objetivos da presente pesquisa foram (i) caracterizar as linhas-básicas de suscetibilidade a inseticidas diamidas (chlorantraniliprole, cyantraniliprole e flubendiamide) e espinosinas (spinosad e spinetoram) em populações de H. armigera do Brasil; (ii) estimar a frequência inicial de alelo que confere resistência a chlorantraniliprole e spinosad; e (iii) caracterizar o padrão de herança da resistência de H. armigera a flubendiamide e a resistência cruzada com outras diamidas. Inicialmente foram realizadas a caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade a inseticidas diamidas e espinosinas em sete populações de H. armigera coletadas na safra 2013/2014. Foram verificadas baixas variações na suscetibilidade a inseticidas diamidas (< 5 vezes) e espinosinas (&asymp; 2 vezes) entre as populações testadas, baseada na DL50. A frequência inicial do alelo que confere resistência de H. armigera a chlorantraniprole, estimada pelo método F2 screen, foi de 0,00694 (IC95%, 0,00018 - 0,02561) em 2014 a 0,04348 (IC95%, 0,01216 - 0,09347) em 2015. Para spinosad, a frequência foi de 0,02632 (IC95% 0,01149 - 0,04706) em populações de H. armigera coletadas na safra 2014/2015. Posteriormente, foram conduzidos o monitoramento da suscetibilidade com bioensaios de doses diagnósticas (DL99) de cada inseticida em populações de H. armigera coletadas no período de 2013 a 2017. Foram observadas reduções significativas na suscetibilidade a inseticidas diamidas em populações de H. armigera no decorrer das safras agrícolas, com sobrevivências de lagartas de 0% (em 2013) até 22% (em 2017). Não foram observadas diferenças significativas na suscetibilidade a inseticidas espinosinas em populações de H. armigera no decorrer das safras agrícolas de 2013 a 2016. Contudo, foram verificadas reduções significativas na suscetibilidade das populações avaliadas na safra 2016/2017, com sobrevivência de até 20% na dose diagnóstica de spinosad. A razão de resistência da linhagem de H. armigera resistente a flubendiamide foi &asymp; 1770 vezes. Foram verificadas a presença de baixa resistência cruzada entre flubendiamide e outras diamidas (chlorantraniliprole e cyantraniliprole). Baseado nos cruzamentos recíprocos entre as linhagens suscetível e resistente a flubendiamide, o padrão de herança da resistência de H. armigera a flubendiamide é autossômico e incompletamente dominante. Retrocruzamentos da progênie dos cruzamentos recíprocos com a linhagem suscetível revelou que a resistência de H. armigera a flubendiamide é monogênica. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam o alto risco de evolução da resistência e a necessidade de implementação de estratégias de manejo da resistência a inseticidas diamidas e espinosinas em H. armigera no Brasil. / The management of Helicoverpa armigera (Hübner) in Brazil has been based mainly on chemical control. The use of insecticides from relatively new chemical groups, such as diamides and spinosyns, has increased to control H. armigera and other lepidopteran-pests occurring in different cropping production systems. For implementing a proactive insect resistance management, the objectives of this research were: (i) to characterize the baseline susceptibility to diamide (chlorantraniliprole, cyantraniliprole and flubendiamide) and sypnosyn (spinosad and spinetoram) insecticides in H. armigera populations from Brazil; (ii) to estimate the initial frequency of resistance allele to chlorantraniliprole and spinosad; and (iii) to characterize the inheritance of resistance of H. armigera to flubendiamide and the cross-resistance to other diamides. Initially, the baseline susceptibility to diamide and spinosyn insecticides was characterized in seven H. armigera populations collected in 2013/2014 growing season. Low variability in the susceptibility to diamide (< 5-fold) and sypinosyn (&asymp; 2-fold) insecticides was detected among H. armigera populations, based on LD50. The initial frequency of resistance allele of H. armigera to chlorantraniliprole, estimated by F2 screen method, was 0.00694 (CI95%, 0.00018 - 0.02561) in 2014 to 0.04348 (CI95%, 0.01216 - 0.09347) in 2015. To spinosad, the frequency was 0.02632 (CI95% 0.01149 - 0.04706) in H. armigera populations collected in 2014/2015. Then, insecticide susceptibility monitoring was conducted with diagnostic dose (LD99) bioassays of each insecticide in H. armigera populations collected from 2013 to 2017. A significant reduction in the susceptibility to diamide insecticides was detected throughout growing seasons, with larval survival from 0% (in 2013) up to 22% (in 2017). There were no significant differences in the susceptibility to spinosyn insecticides in H. armigera populations collected from 2013 to 2016. However, a significant reduction in the susceptibility was detected in populations from 2016/2017 growing season, with larval survival up to 20% at the diagnostic dose of spinosad. The resistance ratio of flubendiamide-resistant strain of H. armigera was &asymp; 1,770-fold. A low cross-resistance was detected between flubendiamide and other diamides (chlorantraniliprole and cyantraniliprole). Based on reciprocal crosses between susceptible and flubendiamide-resistant strains, the inheritance of H. armigera resistance to flubendiamide is autosomal and incompletely dominant. Backcrosses of the progenies from reciprocal crosses to the susceptible strain revealed that the resistance of H. armigera to flubendiamide is monogenic. The results obtained herein showed the high risk of resistance evolution and the need of implementation of resistance management strategies to diamide and spinosyn insecticides in H. armigera in Brazil.

In this study, hydrolytic enzymes from sunn pest (Eurygaster integriceps) and cotton bollworm (Helicoverpa armigera) midguts were identified and characterized in terms of their optimum pH, Km and Vmax values. Hydrolytic activities were also tested for inhibition by several protease and alpha-amylase inhibitors which can be used for the development of insect resistant plants through transgenic technologies. For sunn pest midgut, a low proteolytic activity, belonging mostly to trypsin-like and leucine aminopeptidase-like proteases, and a very high alpha-amylase activity was found in sunn pest midgut, reflecting its high carbohydrate diet. Proteolytic activities could not be inhibited by natural protease inhibitors (SBTI and aprotinin) but inhibited significantly by a general serine protease inhibitor PMSF and metalloprotease inhibitors CdCl2 and CuCl2. alpha-Amylase activity of sunn pest midgut is resistant to inhibition by bean alpha-amylase inhibitor, but inhibited by chickpea, wheat and maize alpha-amylase inhibitors by 26 %, 37 % and 40 %, respectively. For cotton bollworm midgut, a very high proteolytic activity, belonging to serine and metalloprotease type, was detected. alpha-Amylase activity was lower compared to sunn pest midgut, but there were higher and diverse type of proteases, might be reflecting its wide range of host preference. Proteolytic activity was significantly inhibited by both natural protease inhibitors (SBTI and aprotinin). It was also inhibited by several synthetic protease inhibitors (PMSF, E-64, TPCK, CdCl2, CuCl2, Chymostatin). alpha-Amylase activity was inhibited by 60 % by wheat alpha-amylase inhibitor, while maize, chickpea and bean alpha-amylase inhibitors had no effect on cotton bollworm midgut alpha-amylase activity.

Global large-scale adoption of Bt transgenic crops has provided effective management of key insect pests and have greatly reduced insecticide use. However, some field populations of several insect species have evolved resistance to Bt crops in the field, which threatens the continuing success of Bt crops. The cotton bollworm (Helicoverpa zea) is among the first pest reported to have field-evolved resistance to Cry1Ac and Cry2Ab, but the underlying mechanisms remain largely unknown. To determine the current resistance status of the field populations of H. zea and to elucidate the mechanisms of Bt resistance in this pest, I conducted a series of experiments including bioassays of field populations as well as biochemical and molecular comparisons of midgut proteases and putative Cry1Ac receptors between Cry1Ac-susceptible and -resistant strains. Diet incorporation bioassays of six field populations of H. zea collected from Tifton, Georgia USA in 2008 and 2009 indicated that, comparing to LAB-S, a susceptible laboratory strain, all six field populations were significantly resistant to Cry1Ac toxin and one of three field strains was significantly resistant to Cry2Ab toxin. Across the five populations, survival on leaf-discs producing Cry1Ac was positively correlated to the lethal concentration that kills 50% of the population (LC₅₀) for Cry1Ac from diet bioassays. These results support previous findings of field-evolved resistance to Bt crops in H. zea and suggest an overall increase in resistance to Cry1Ac from 2002 to 2009.One of the six field population, which was designed as GA and had 55-fold resistance to Cry1Ac, was further selected with Cry1Ac in the laboratory to generate a more resistant strain, which was designated as GA-R and had 560-fold resistance to Cry1Ac. Total protease activity of the midgut extracts from GA-R and GA strains is significantly lower than that from the susceptible laboratory strain LAB-S. Among the proteases contributing to the total activity, trypsin-like and chymotrypsin-like activities of GA-R and GA midgut extracts are significantly lower than that from the susceptible strain, while no difference in elastase-like activity is evident. Decreased proteolytic activity was correlated to the decreased Cry1Ac activation rate of midgut extracts of the GA-R and GA strains. Cytotoxicity assays with H. zea midgut cells show that the product of Cry1Ac protoxin digested with GA-R and GA midgut extracts has significantly lower cytotoxicity when compared with that digested with the susceptible strain midgut extracts. Transcriptional analysis of a limited number of protease genes did not identify specific proteases involved in the decline in Cry1Ac activation in GA-R and GA. These results indicate that the decreased Cry1Ac activation rate by midgut proteases is involved in the field originated Cry1Ac resistance in the H. zea GA-R and GA strains. I also compared the cDNA sequences and expression levels of the putative Cry1Ac receptors cadherin, aminopeptidase 1 (APN1), alkaline phosphatase 2 (ALP2) and ATP-binding cassette subfamily C member 2 (ABCC2) in LAB-S and GA-R. No indels (insertions and deletions) were found in the cDNA sequences of the resistant alleles of the four receptors, relative to those of the susceptible alleles. While there were no amino acid point mutations in the resistant alleles of ALP2 and ABCC2, we found 2 and 14 consistent amino acid point mutations in the resistant alleles of cadherin and APN1, respectively. However, neither cadherin nor APN1 point mutations were genetically linked to Cry1Ac resistance in GA-R. Quantitative RT-PCR analysis revealed no differences in the transcripts of the four receptors between the two strains. Taken together, these results indicate that the four receptors are not involved in Cry1Ac resistance in the GA-R strain of H. zea.