Evidências sobre a presença do sistema renina-angiotensina (SRA) na medula óssea e a possível participação da enzima conversora de angiotensina-I (ECA) na regulação hematopoética tem despertado o interesse da comunidade científica. Como a ECA também é um componente chave do sistema calicreína-cininas (SCC), é possível que elementos deste sistema, possam estar envolvidos no controle hematopoético. Assim, avaliamos a participação da ECA na regulação hematopoética de animais não modificados (WT) e nocautes dos receptores B1 de cininas (KOB1). Para isso, utilizamos técnicas de cultura de células de medula óssea, a saber: os ensaios clonogênicos em soft-ágar para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) e o sistema de cultura líquida de longa duração (CLLD). Os resultados mostraram a presença da ECA em células das CLLD e indicaram a participação da enzima na proliferação de progenitores hematopoéticos possivelmente através do controle dos níveis de AcSDKP, pois o tratamento com o tetrapeptídeo e com captopril, reduziu significativamente o número CFU-GM in vitro e in vivo. Quando adicionado às CLLD, o AcSDKP foi capaz de aumentar significativamente a expressão do mRNA da ECA, sugerindo que seus níveis possam controlar a expressão gênica desta enzima. Em relação aos animais KOB1, os resultados mostraram maior atividade da ECA, acompanhado de aumento não significativo da expressão gênica e protéica da enzima. O tratamento das CLLD de animais WT com agonistas de receptores de cininas, não alterou a expressão gênica e a atividade da ECA. Assim, nossos dados sugerem que a ECA participa da regulação hematopoética neste modelo. No entanto, novos estudos serão necessários para a elucidação dos mecanismos envolvidos na expressão e/ou controle da atividade da ECA pelos receptores de cininas. / Evidences on the presence of the renin angiotensin system in the bone marrow and the possible participation of the angiotensin-I converting enzyme (ACE) in the hematopoietic regulation have aroused interest of the scientific community. As the ACE also is a common element of the kallikrein-kinin system (KKS), it is possible that elements of KKS, can be involved in the hematopoietic control. Thus, we evaluated the participation of the ACE on the hematopoietic regulation of wild-type (WT) and kinin receptor B1 knockout mice (KOB1). For this, we use techniques of bone marrow cell culture, to know the clonogenic assays for granulocyte-macrophage (GM-CFU) and the long term bone marrow cultures (LTBMC). The results shown the presence of the ACE in cells from LTBMC and its possible participation on hematopoietic proliferation through the control of AcSDKP levels, therefore the treatment with AcSDKP and captopril, decreased significantly the GM-CFU number in vitro and in vivo. When added to the LTBMC, the AcSDKP increase significantly the expression of ACE mRNA, suggesting that its levels could control the gene expression of this enzyme. In relation to KOB1 mice, the results shown increase of the ACE activity and not significant increase of the gene and protein expression of the enzyme. The treatment of the LTBMC of WT mice with kinins receptors agonists, did not modify the gene expression and the ACE activity. Thus, our data suggesting that ACE participate of the hematopoietic regulation in this model. However, new studies will be necessary to understand the involved mechanisms in the expression and/or control of ACE activity by kinins receptors.

A desnutrição proteico-energética (DPE) provoca anemia e leucopenia decorrente da redução de precursores hematopoéticos e comprometimento da produção de mediadores indutores da hematopoese, bem como alterações estruturais e ultra-estruturais na matriz extracelular medular. A hematopoese ocorre em nichos medulares distintos - endosteal e perivascular - que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto-renovação da célula tronco hematopoética (CTH). As células tronco mesenquimais (CTM) tem um papel importante na formação destes nichos, através da sua diferenciação nos diversos tipos celulares que os compõe. Adicionalmente, a CTM pode modular a função de outras células, como a CTH e a célula endotelial (CE) medular, através da liberação de diversos fatores de crescimento e citocinas. As CE expressam proteínas que regulam a diferenciação e movimentação das CTH na MO. Há sinais que a CTM pode ser a precursora da CE medulares, pois in vitro a CTM pode se diferenciar em CE-like. Desta forma, a CTM é um ponto chave no estudo das alterações causadas pela DPE no nicho perivascular e sobre a regulação da hematopoese. Neste trabalho, investigamos se a DPE afeta a diferenciação in vitro da CTM medular em CE-like e avaliamos se essas células apresentam diferentes capacidades em produzir alguns mediadores regulatórios da hematopoese (CXCL-12, SCF, Ang-1, IL-11, GM-CSF e TFG-β), bem como possíveis alterações no perfil de expressão gênica de marcadores de função das CTM e CE-like. Utilizamos camundongos C57BL/6 machos, divididos em grupos Controle e Desnutrido, sendo que o grupo Controle recebeu ração normoprotéica (12% caseína) e o grupo Desnutrido recebeu ração hipoprotéica (2% caseína), ambos durante 5 semanas. Após este período, os animais foram eutanasiados, foi realizada a avaliação nutricional e hematológica, caracterizando a DPE. As CTM foram isoladas, caracterizadas e diferenciadas in vitro em CE-like, o que foi evidenciado pela maior expressão gênica de NT5E, FLT1, KDR, PECAM1 e VCAM1. Avaliamos a expressão dos genes CDH5, CSPG4, LEPR, NES, CSF1, CSF2, CSF3, MCAM, PROM1, ANGPT1, CXCL12, ENG, IGF1, IL3, IL11, KITL, TGFB1, WNT3A, WNT5A, ICAM1, PDGFB1 e VWF. Encontramos alterações causadas pela DPE na expressão gênica e quantificação de CXCL-12, SCF e Ang-1, os quais mostraram que as células avaliadas do grupo Desnutrido encontram-se em um estado \"pró-proliferativo\", em um esforço para restabelecer a hematopoese na DPE. Entretanto, foi observado neste trabalho e nos demais trabalhos do grupo que há hipoplasia medular na DPE e, portanto, pode-se inferir que as alterações hematopoéticas observadas na DPE não são ocasionadas por alterações na síntese de SCF, CXCL-12 ou Ang-1. / Protein-energy malnutrition (PEM) causes anemia and leukopenia as it reduces hematopoietic precursors, impairs the production of mediators that induce hematopoiesis and alters structural and ultrastructural changes in bone marrow (BM) extracellular matrix. Hematopoiesis occurs in distinct BM niches - endosteal and perivascular - which modulate the processes of differentiation, proliferation and self-renewal of hematopoietic stem cell (HSC). Mesenchymal stem cells (MSC) play an important role in the formation of these niches through their differentiation in several cell types that compose them. Additionally, MSC can modulate the function of other cells, such as HSC and endothelial cells (EC), through the release of several growth factors and cytokines. The EC express proteins that regulate the differentiation and migration of HSC in the BM. MSC seem to be the precursor of medullary EC because in vitro MSC can differentiate into EC-like cells. Thus, MSC are a key point in the study of changes caused by DPE on the perivascular niche and on the regulation of hematopoiesis. In this study, we investigated whether PEM would affect BM-MSC in vitro differentiation into EC-like cells and evaluated whether these cells would have distinct capacities of producing some regulatory mediators of hematopoiesis (CXCL- 12, SCF, Ang-1, IL-11, GM -CSF and TFG-β), as well as analyzed possible changes in the gene expression profile of MSC function and EC-like cells related markers. C57BL/6 mice were divided into Control and Malnourished groups, which received for 5 weeks, respectively, a normal protein diet (12% casein) and a low protein diet (2% casein). After this period, animals were euthanized, nutritional and hematological evaluations were performed, featuring the PEM. MSC were isolated, characterized and differentiated in vitro into EC-like cells, which were evidenced by increased gene expression of NT5E, FLT1, KDR, PECAM1 and VCAM1. The expression of CDH5, CSPG4, LEPR, NES, CSF1, CSF2, CSF3, MCAM, PROM1, ANGPT1, CXCL12, ENG, IGF1, IL3, IL11, KITL, TGFB1, Wnt3a, WNT5A, ICAM1, PDGFB1 and VWF genes was also evaluated. Changes caused by PEM on gene expression and quantification of CXCL-12, SCF and Ang-1 were found, indicating that tested cells from the Malnourished group were in a \"pro-proliferative\" state in an effort to restore hematopoiesis. However, our results are in accordance to the literature regarding bone marrow hypoplasia as a consequence of PEM. Therefore, we infer hematopoietic changes observed in this work are not related to changes in the synthesis of SCF, 12 CXCL-12 or Ang-1.

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz / Tese ( doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T11:14:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_AlineLisie_D.pdf: 13996403 bytes, checksum: 20b3e94e609f9ce6fd4214680378bb52 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A Chlorella vulgaris (CV) é uma alga microscópica bastante rica em nutrientes. Além de alto valor nutritivo, a Chlorella tem demonstrado possuir importantes atividades terapêuticas. Vários trabalhos do nosso laboratório e outros demonstram os efeitos protetores desta alga contra infecções virais e bacterianas, tumores, entre outros. No presente trabalho avaliamos os efeitos do tratamento profilático/terapêutico com a dose de 50mg/Kg/dia de CV sobre a resposta imunohematopoética de animais normais e portadores de tumor ascítico de Ehrlich (TAE). O estudo dos mecanismos envolvidos na proteção produzida pela alga frente às alterações induzidas pelo TAE no sistema imuno-hematopoético, demonstrou aumentos significativos na atividade de células NK, na produção de citocinas com padrão Th1 (IL-2 e INF-g) e na liberação de TNF-a por células esplênicas, paralelamente a uma diminuição na produção de IL-10 (padrão Th2). Além disso, o tratamento com CV protegeu o hospedeiro da mielossupressão provocada pelo desenvolvimento tumoral, seja agindo diretamente na formação e manutenção do estroma medular, estimulando a atividade das células estromais, ou ainda estimulando a produção de citocinas reguladoras da hematopoese como a IL-6 e a IL-1a. Constatamos ainda que o tratamento com CV aumenta a atividade estimuladora de colônias (CSA) no soro de animais portadores de tumor e a capacidade proliferativa de células esplênicas. Outros resultados que merecem destaque são aqueles relacionados à ativação macrofágica. Nossos resultados demonstram que, em animais normais, o tratamento com CV promove aumento significativo nos níveis de TNF-a nos sobrenadantes das culturas de macrófagos peritoneais e esplênicos sem alterar a produção de IFN-g e IL-10. Além disso, o restabelecimento da produção normal de TNF-a, IFN-g e IL-10 por macrófagos peritoneais de animais portadores de TAE e reversão parcial dos efeitos produzidos pela presença do tumor na atividade dos macrófagos esplênicos, também foram observados. Outro efeito do CV sobre macrófagos peritoneais de animais portadores de TAE foi o estímulo da produção de H2O2 e NO2 -. Analisando nossos resultados podemos dizer que a CV além de possuir alto valor nutritivo, capacidade antioxidante e atividade anti-viral e antibacteriana, apresenta importante atividade imunomoduladora frente ao desenvolvimento tumoral, já que na presença do tumor o hospedeiro que vem recebendo Chlorella é capaz de reagir mais prontamente e com maior vigor na indução de mecanismos essenciais de defesa imunológica. Neste sentido, sugerimos que a alga Chlorella vulgaris pode ser um candidato a agente preventivo e complementar no tratamento do câncer. / Abstract: Chlorella vulgaris (CV) is a microscopic alga rich in nutrients. Besides the high nutritive value, this alga has shown important therapeutic properties. Many studies from our laboratory and others have shown the protective effects of CV against viral and bacterial infections, tumors, among others. In this work we evaluated the effects of the prophylactic/therapeutic treatment with a dose of 50 mg/Kg/day in normal and Ehrlich ascites tumor (EAT)-bearing mice. The study of the mechanisms involved in the protection produced by the CV against the EAT, induced alterations in the immune-hematopoietic system; demonstrating significant improvements in the NK cells activity, Th1 (IL-2 and INF-g) and TNF-a cytokines production by mononuclear spleen cells, concomitantly with the decrease of IL-10 (Th2) production. Moreover, treatment with CV protected the host of myelosuppression caused by tumor development, it is acting directly in the formation and maintenance of bone marrow stroma, by stimulating the activity of stromal cells, or stimulating the production of important hematopoiese regulatory cytokines like IL-6 and IL-1a. We are also certain that the treatment with CV increases the colony-stimulating activity (CSA) in the serum of tumor bearing mice and the proliferative capacity of spleen cells. Other results that deserve attention are those related to macrophage activation. Our results show that in normal mice, treatment with CV, promotes significant increase in the TNF-a levels in upernatants of the cultures of peritoneal and spleen macrophages without altering the production of IFN-g and IL-10. Moreover, restoration of the normal production of TNF-a, IFN-g and IL-10 by peritoneal macrophages from animal carriers of EAT and partial reversal of the effects produced by the presence of tumor in the splenic macrophages activity were also observed. Another effect of CV on peritoneal macrophages of tumor bearing mice was the stimulation in the production of NO2 - and H2O2. Looking at our results we can say that the alga Chorella vulgaris in addition to its high nutritional value, antioxidant capacity and antiviral and antibacterial activities, it also presents important immunomodulatory activity against tumor development, since that in the presence of the tumor, the host that has received Chlorella is able to react more promptly and with greater force in the induction of essential mechanisms of immune defense. Accordingly, we suggest that the alga Chlorella vulgaris can be a candidate for the preventive and complementary treatment of cancer by strengthening the immune system. / Doutorado / Farmacologia

Evidências sobre a presença do sistema renina-angiotensina (SRA) na medula óssea e a possível participação da enzima conversora de angiotensina-I (ECA) na regulação hematopoética tem despertado o interesse da comunidade científica. Como a ECA também é um componente chave do sistema calicreína-cininas (SCC), é possível que elementos deste sistema, possam estar envolvidos no controle hematopoético. Assim, avaliamos a participação da ECA na regulação hematopoética de animais não modificados (WT) e nocautes dos receptores B1 de cininas (KOB1). Para isso, utilizamos técnicas de cultura de células de medula óssea, a saber: os ensaios clonogênicos em soft-ágar para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) e o sistema de cultura líquida de longa duração (CLLD). Os resultados mostraram a presença da ECA em células das CLLD e indicaram a participação da enzima na proliferação de progenitores hematopoéticos possivelmente através do controle dos níveis de AcSDKP, pois o tratamento com o tetrapeptídeo e com captopril, reduziu significativamente o número CFU-GM in vitro e in vivo. Quando adicionado às CLLD, o AcSDKP foi capaz de aumentar significativamente a expressão do mRNA da ECA, sugerindo que seus níveis possam controlar a expressão gênica desta enzima. Em relação aos animais KOB1, os resultados mostraram maior atividade da ECA, acompanhado de aumento não significativo da expressão gênica e protéica da enzima. O tratamento das CLLD de animais WT com agonistas de receptores de cininas, não alterou a expressão gênica e a atividade da ECA. Assim, nossos dados sugerem que a ECA participa da regulação hematopoética neste modelo. No entanto, novos estudos serão necessários para a elucidação dos mecanismos envolvidos na expressão e/ou controle da atividade da ECA pelos receptores de cininas. / Evidences on the presence of the renin angiotensin system in the bone marrow and the possible participation of the angiotensin-I converting enzyme (ACE) in the hematopoietic regulation have aroused interest of the scientific community. As the ACE also is a common element of the kallikrein-kinin system (KKS), it is possible that elements of KKS, can be involved in the hematopoietic control. Thus, we evaluated the participation of the ACE on the hematopoietic regulation of wild-type (WT) and kinin receptor B1 knockout mice (KOB1). For this, we use techniques of bone marrow cell culture, to know the clonogenic assays for granulocyte-macrophage (GM-CFU) and the long term bone marrow cultures (LTBMC). The results shown the presence of the ACE in cells from LTBMC and its possible participation on hematopoietic proliferation through the control of AcSDKP levels, therefore the treatment with AcSDKP and captopril, decreased significantly the GM-CFU number in vitro and in vivo. When added to the LTBMC, the AcSDKP increase significantly the expression of ACE mRNA, suggesting that its levels could control the gene expression of this enzyme. In relation to KOB1 mice, the results shown increase of the ACE activity and not significant increase of the gene and protein expression of the enzyme. The treatment of the LTBMC of WT mice with kinins receptors agonists, did not modify the gene expression and the ACE activity. Thus, our data suggesting that ACE participate of the hematopoietic regulation in this model. However, new studies will be necessary to understand the involved mechanisms in the expression and/or control of ACE activity by kinins receptors.