Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-06T11:58:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 410924 bytes, checksum: de4370c4260d84bdd59fd21fbdd7f5a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T11:58:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 410924 bytes, checksum: de4370c4260d84bdd59fd21fbdd7f5a6 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Brasil é o maior produtor e exportador de café do mundo. O país, como o resto das regiões produtoras de café, sofre com a doença da ferrugem do cafeeiro. A ferrugem é causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix. Esta doença pode levar a quedas drásticas na produtividade quando não controlada. Esse patógeno apresenta altos níveis de variabilidade genética, o que resulta em aparecimento de novas raças fisiológicas e, consequentemente, a suplantação da resistência de variedades de café obtidas pelos programas de melhoramento genético. O mecanismo que causa essa variabilidade ainda não é conhecido, uma vez que o fungo tem reprodução assexuada e o estádio sexual não foi observado na natureza. Tem sido relatado que os genomas das ferrugens apresentam alta porcentagem de elementos repetitivos, incluido os elementos transponíveis (ET). Como a atividade de ET tem sido sugerida como uma fonte importante de geração de variabilidade, existe a possibilidade de que os ETs sejam um dos responsáveis pela grande variabilidade genética encontrada em H. vastatrix. Portanto, este estudo teve como objetivo identificar a presença, a frequência e a localização de LTR retrotransposons no genoma de H. vastatrix, bem como verificar a relação entre LTR retrotransposons e a variabilidade encontrada nesse patógeno. Foram identificados no genoma analisado 6.516 genes codificadores de proteínas e 1.109 retrotransposons do tipo LTR completos. Dos genes codificadores de proteínas, 65 estavam próximos de retrotransposons do tipo LTR. Observou-se que os retrotransposons LTR geralmente se inserem a 5.000 pb de um gene codificador de proteínas no genoma desse patógeno. Os resultados encontrados demonstraram que retrotransposons LTR inserem-se em regiões conservadas ricas em AT. Assim, os dados sugerem que a inserção dos retrotransposons LTR em H. vastatrix podem se direcionar com base na composição nucleotídica de uma região. Além disso, foram identificados retrotransposons próximos de regiões codificadoras, o que poderia contribuir para modulação da expressão gênica e, consequentente, afetar a variabilidade do patógeno. / Brazil is the biggest producer and exporter of coffee in the world. The country, as the rest of coffee growing regions, suffers with coffee rust disease. Rust, one of the earliest coffee diseases studied scientifically, is caused by the obligate biotrophic fungus Hemileia vastatrix. This disease is the most harmful that affects coffee trees, which may cause drastic drops in productivity if not controlled. The fungus infects coffee leaves penetrating through stomata and develops powdery orange pustules on the abaxial surface. The pathogen displays high levels of genetic variability leading to appearance of new physiological races and supplanting the resistance of coffee varieties obtained in breeding programs. The mechanism that causes such variability is yet not known, since it is accepted that the fungus relies on asexual reproduction and the sexual stage has not been observed in nature. The genome of H. vastatrix has been reported as one of the largest known rust genome. A very large fraction of the published rust genomes has shown a high percentage of repetitive elements, such as transposable elements (TEs). In this sense, TEs activity is suggested as an important source for generation of variability. Thus, there is a chance that the transposable DNA elements are responsible for increasing genetic variability of H. vastatrix. Therefore, this study aimed to identify presence, frequency and location of transposable elements, as well as verify the relationship between transposable elements and the high variability found on genome of H. vastatrix. We found 6,516 gene- coding proteins and 1,109 complete LTR retrotransposons in the genome. From these gene-coding proteins, 65 were close to LTR retrotransposons. The results suggested that LTR retrotransposon generally insert itself 5,000bp from a gene-coding protein. Also, LTR retrotransposons identified insert itself on AT-rich conserved regions. Thus, the found data suggest that insertion of LTR retrotransposons in H. vastatrix genome could be targeting its integration site based on nucleotide composition. Moreover, we identified LTR retrotransposons located close to coding regions, which could be contributing with gene expression modulation and hence affecting pathogen variability. / O autor não apresentou título em português.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-01-24T13:20:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1041271 bytes, checksum: e6cb275e1e3701318178f9c961a02320 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-24T13:20:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1041271 bytes, checksum: e6cb275e1e3701318178f9c961a02320 (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berkeley & Broome, é considerada a principal doença da cultura. O fungo está amplamente distribuído nas regiões produtoras de café, causando severos danos econômicos. Novas raças fisiológicas de H. vastatrix tem surgido, com frequência em todo mundo, infectando algumas cultivares de café lançadas comercialmente como resistentes à ferrugem. Dessa forma, a obtenção de cafeeiros resistentes tem sido um desafio devido ao alto potencial adaptativo do fungo e tem se tornado cada vez mais difícil a caracterização dos patótipos por meio da coleção de cafeeiros diferenciadores de raça. Além disso, as informações acerca da interação de cafeeiros com as raças existentes são escassas, embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado. Estudos genômicos estão ajudando no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de interação entre planta e patógeno e no desenvolvimento de técnicas moleculares para a identificação de isolados. Nosso objetivo foi caracterizar as raças de H. vastatrix encontradas nas principais regiões produtoras de café do Brasil, e estudar as proteínas candidatas a efetoras preditas para H. vastatrix que possam contribuir para patogenicidade nas diferentes raças do fungo. Foram utilizados 56 isolados monopustular coletados de diferentes espécies de café, Coffea canephora, C. arabica e Híbrido de Timor (C. canephora x C. arabica) e multiplicados em cafeeiro suscetível C. arabica variedade Caturra. Cada isolado foi inoculado em cafeeiros que compõe a série diferenciadora de raças, com três repetições. O DNA dos 56 isolados monopustulares foram extraídos para os estudos genômico. Foram utilizadas 47 combinações de primer para amplificar genes de candidatos a efetores. Sete genes foram amplificados, sequenciados e tiveram sua expressão validada em cafeeiros resistente e suscetível. As sequências obtidas foram alinhadas para os 46 isolados, usando o programa DNA Baser. Estudo de domínio conservado foram realizados no programa Pfam e a categorização das proteínas no Blast2GO. O alinhamento das sequências de nucleotídeos, proteínas e agrupamento dos isolados foi feito no programa Clustalw e as diferença de nucleotídeo foi analisada no Weblogo. Os dados obtidos foram usados para o estudo de diversidade. Por meio da inoculação na série diferenciada, foram identificadas sete raças, sendo cinco já descritas no Brasil e duas pela primeira vez (raça XXIX e XXX). Não foi possível caracterizar 15 combinações dos genes de virulência, sendo assim consideradas novas raças. A análise da coleção de isolados permitiu inferir a presença de pelo menos seis novos genes na série diferenciadora, o que possibilitou diferenciar dois isolados descritos como raças III. Na análise genômica, os 47 genes candidatos a efetores estudados se mostraram conservados em todos os isolados e estão ligados a 15 processos biológicos do desenvolvimento do fungo. Foram identificados 14 domínios nas proteínas provenientes desses genes. Para os sete genes sequenciados nos diferentes isolados, observou-se diferença na sequência dos nucleotídeos e presença de indivíduos heterozigoto e homozigoto. Com análise de diversidade foi possível discriminar os indivíduos, sendo o isolado Hv-09 o mais divergente. As informações geradas nesta pesquisa poderão ampliar o entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes que estão envolvidos no processo infeccioso auxiliará o entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo. / Coffee rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix Berkeley & Broome, is considered the main disease of the crop. The fungus is widely distributed in the coffee producing regions, causing severe economic damage. New physiological races of H. vastatrix have arisen, often all over the world, infecting some commercially released coffee cultivars as resistant to rust. Thus, obtaining resistant coffee trees has been a challenge due to the high adaptive potential of the fungus and it has become increasingly difficult to characterize the pathotypes through the collection of coffee races. In addition, information on the interaction of coffee trees with the existing races is scarce, although the infectious process of H. vastatrix is well studied. Genomic studies are helping to understand the molecular mechanisms involved in the process of interaction between plant and pathogen and in the development of molecular techniques for the identification of isolates. Our objective was to characterize the H. vastatrix race found in the main coffee producing regions of Brazil and to study the effector candidate proteins predicted for H. vastatrix that may contribute to pathogenicity in the different fungus races. Fifty six monopustular isolates collected from different coffee species, Coffea canephora, C. arabica and Hybrid of Timor (C. canephora x C. arabica) were used and multiplied in susceptible coffee C. arabica variety Caturra. Each isolate was inoculated in coffee plants that make up the differentiating series of races, with three replicates. The DNA of the 56 monopustular isolates were extracted for genomic studies. We used 47 primer combinations to amplify effector candidate genes. Seven genes were amplified, sequenced and had their validated expression in resistant and susceptible coffee trees. The sequences obtained were aligned for the 46 isolates using the DNA Baser program. A conserved domain study was performed on the Pfam program and the protein categorization in Blast2GO. The alignment of the nucleotide sequences, proteins and clustering of the isolates was done in the Clustalw program and the nucleotide differences were analyzed in Weblogo. The data obtained were used for the study of diversity. Through inoculation in the differentiated series, seven races were identified, five of which were already described in Brazil and two for the first time (races XXIX and XXX). It was not possible to characterize 15 combinations of the virulence genes, thus being considered new races. The analysis of the collection of isolates allowed to infer the presence of at least six new genes in the differentiator series, which made it possible to differentiate two isolates described as breeds III. In genomic analysis, the 47 candidate effector genes studied have been conserved in all isolates and are linked to 15 biological processes of fungus development. 14 domains were identified in proteins from these genes. For the seven genes sequenced in the different isolates, we observed a difference in nucleotide sequence and presence of heterozygous and homozygous individuals. With diversity analysis it was possible to discriminate individuals, being the Hv-09 isolate the most divergent. The information generated in this research may broaden the understanding of the interaction between H. vastatrix and the coffee tree. The knowledge of the genes that are involved in the infectious process will help the understanding of the molecular mechanisms that lead to the supplanting of resistance by new races of the fungus.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-18Bitstream added on 2014-06-13T20:45:46Z : No. of bitstreams: 1 tozzi_fro_dr_botfca.pdf: 12408119 bytes, checksum: ae3d91b6007ad3064d0e253ea2ee969a (MD5) / O dióxido de carbono é um dos principais gases de efeito estufa e há previsões de que a concentração na atmosfera irá dobrar até o final do século. O aumento da concentração de CO2 do ar contribui, sobretudo, para o aumento da temperatura global e, além disso, o gás exerce efeito direto sobre as plantas. Com o objetivo de estudar o efeito do aumento da concentração de CO2 sobre o cafeeiro e sobre a ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix), plantas foram cultivadas a campo, em estufas de topo aberto com e sem adição de CO2 em quatro experimentos. Os tratamentos foram constituídos dos níveis de CO2 ambiente (433 ppm) e, aproximadamente 508 ppm. Foram inoculadas mudas de cafeeiros das cultivares Catuaí (suscetível à ferrugem) e Obatã (resistente), nas quais foram avaliados os parâmetros de severidade e incidência da doença. A severidade foi menor no tratamento com maior concentração de CO2 para a cultivar Catuaí, indicando diminuição da doença em função do aumento do CO2. Para a cultivar Obatã, o aumento do gás não teve efeito na doença. Por outro lado, ambas as cultivares apresentaram incremento no diâmetro do caule e altura de plantas no tratamento com adição de CO2 / Carbon dioxide is a major greenhouse gas and there are predictions that its atmosphere concentration will double by the end of the century. CO2 air concentration increase contributes, mainly, to global temperature rise, moreover the gas exerts a direct effect on agriculture. In order to study the effect of air CO2 increased concentration on coffee and coffee leaf rust (Hemileia vastatrix) development, plants were grown, under field conditions, in open top chambers in four experiments. The treatments consisted of ambient CO2 levels (433 ppm) and approximately 508 ppm. Cultivar Catuaí (susceptible to rust) and Obatã (resistant) coffee seedlings were inoculated and evaluated through disease severity and incidence parameters. Severity was lower at higher CO2 for Catuaí, indicating decreased disease due to increased CO2. Elevated gas concentration had no effect on disease for cultivar Obatã. Moreover, both cultivars showed an increase, stem diameter and plant height at CO2 addition treatment

Orientador: Raquel Ghini / Banca: Oliveira Guerreiro Filho / Banca: Emerson Alves da Silva / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Regiane Cristina Oliveira de F. Bueno / Resumo: O dióxido de carbono é um dos principais gases de efeito estufa e há previsões de que a concentração na atmosfera irá dobrar até o final do século. O aumento da concentração de CO2 do ar contribui, sobretudo, para o aumento da temperatura global e, além disso, o gás exerce efeito direto sobre as plantas. Com o objetivo de estudar o efeito do aumento da concentração de CO2 sobre o cafeeiro e sobre a ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix), plantas foram cultivadas a campo, em estufas de topo aberto com e sem adição de CO2 em quatro experimentos. Os tratamentos foram constituídos dos níveis de CO2 ambiente (433 ppm) e, aproximadamente 508 ppm. Foram inoculadas mudas de cafeeiros das cultivares Catuaí (suscetível à ferrugem) e Obatã (resistente), nas quais foram avaliados os parâmetros de severidade e incidência da doença. A severidade foi menor no tratamento com maior concentração de CO2 para a cultivar Catuaí, indicando diminuição da doença em função do aumento do CO2. Para a cultivar Obatã, o aumento do gás não teve efeito na doença. Por outro lado, ambas as cultivares apresentaram incremento no diâmetro do caule e altura de plantas no tratamento com adição de CO2 / Abstract: Carbon dioxide is a major greenhouse gas and there are predictions that its atmosphere concentration will double by the end of the century. CO2 air concentration increase contributes, mainly, to global temperature rise, moreover the gas exerts a direct effect on agriculture. In order to study the effect of air CO2 increased concentration on coffee and coffee leaf rust (Hemileia vastatrix) development, plants were grown, under field conditions, in open top chambers in four experiments. The treatments consisted of ambient CO2 levels (433 ppm) and approximately 508 ppm. Cultivar Catuaí (susceptible to rust) and Obatã (resistant) coffee seedlings were inoculated and evaluated through disease severity and incidence parameters. Severity was lower at higher CO2 for Catuaí, indicating decreased disease due to increased CO2. Elevated gas concentration had no effect on disease for cultivar Obatã. Moreover, both cultivars showed an increase, stem diameter and plant height at CO2 addition treatment / Doutor

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-11-16T17:29:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 536096 bytes, checksum: ef28acbd4ebc8e3f4d2b3939b50658fb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-16T17:29:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 536096 bytes, checksum: ef28acbd4ebc8e3f4d2b3939b50658fb (MD5) Previous issue date: 2018-07-17 / A ferrugem do cafeeiro causada pelo fungo Hemileia vastatrix vem causando grandes perdas na cafeicultura ao longo dos anos. O controle químico envolvendo fungicidas sistêmicos e protetores tem sido uma ferramenta importante, visando controle eficiente e evitando o surgimento de mutantes resistentes, na população do fungo aos fungicidas sistêmicos. Dentro os produtos mais utilizados, destacam-se os fungicidas cúpricos, preventivamente por sua eficiência, na inibição da germinação dos esporos; quando a incidência atinge 5 %, nos anos de alta carga de frutos pendentes nas plantas, torna-se necessário a utilização de fungicidas sistêmicos. A ocorrência de chuva tem efeito direto no sucesso do controle, pois pode alterar a dinâmica dos fungicidas na superfície foliar. Neste trabalho foi avaliado os efeitos e ocorrências de chuvas após aplicação de fungicidas sistêmicos e protetores, em folhas de cafeeiro, no controle da ferrugem. Foram realizados dois experimentos em casa de vegetação, onde as folhas destacadas de Coffea arabica var. Caturra foram submetidas a uma chuva de 30 mm. No primeiro teste avaliou-se fungicidas sistêmicos (epoxiconazole + piraclostrobina), hidróxido de cobre, sulfato de zinco e ácido bórico, misturados e sozinhos, utilizando a dose comercial. As folhas foram atomizadas e em seguida submetidas a chuva. No primeiro experimento aguardou-se 30 minutos para a aplicação da chuva. Os melhores resultados foram aqueles que continham (epoxiconazole + piraclostrobina) + hidróxido de cobre, onde a severidade foi praticamente zero Independiente do tempo de chuva após pulverização dos tratamentos. Concluiu-se que a aplicação destes fungicidas, mesmo após serem submetidos a chuva, teve controle eficiente da doença. No segundo experimento foi avaliado o oxicloreto de cobre adicionado adjuvantes. Com ocorrência de chuva de 30 mm após os tempos zero, 30, 120 e 480 minutos, depois da pulverização. Os tratamentos mais eficientes foram onde houve a mistura de oxicloreto de cobre 3,0 kg há -1 + OM a 0,75%, demostrando maior retenção na superfície da folha e maior controle da doença. Os menos eficientes foram aqueles que tinham oxicloreto de cobre + PAFE a 0,10% e 0,20%. Conclui-se que o uso de adjuvantes, pode favorecer a tenacidade e eficiência dos produtos, tendo em consideração a formulação do fungicida. / Coffee rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix, has been causing significant yield losses of coffee crop over the years. Chemical control involving systemic curative and protective fungicides have been considered important tools, aiming the effective control and avoiding the emergence of resistant mutants in the fungal population to systemic fungicides. Among the most commonly used products, copper fungicides are prominent due to their preventative and efficient mode of action in inhibiting spore germination; when the incidence reaches 5% in the years of high pending fruits’ load, the use of systemic fungicides becomes necessary. In addition, rain has a direct impact on the management success due to the removal of deposits of products on the leaf surface. Thus, the objective of this study was to evaluate the retention time of systemic and protective fungicide residues on coffee leaves submitted to rain, aiming the control of rust. Two experiments were carried out, in which leaves of Coffea arabica var. Caturra were subjected to a 30-mm rainfall treatment. The first assay employed systemic fungicides (epoxiconazole + pyraclostrobin), copper hydroxide, zinc sulfate, and boric acid, mixed and alone, using the commercial dose. The leaves were atomized and then exposed to precipitation regime. In the first experiment, we allowed 30 minutes before the rainfall application. The best results were those containing (epoxiconazole + pyraclostrobin) + copper hydroxide, in which the severity was practically zero. Therefore, the application of these fungicides, even after being submitted to rain, showed effective control over the disease. Copper oxychloride added to the OM and PAFE was used in the second trial. 30-mm rainfall was applied after the times zero, 30, 120, and 480 minutes, respectively after spraying. The most efficient treatments were the mixture of copper oxychloride + OM at 0.75 %, showing greater retention at the leaf surface and greater control of the disease. The least efficient were those having copper oxychloride + 0.10% and 0.20% PAFE. To conclude, the use of mineral oil adjuvant may favor the tenacity and efficiency of the product, taking into account the formulation of the fungicide. / Currículo lattes e agência de fomento não encontrada.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 611413 bytes, checksum: d8119b46b042a6c0388e233d2daa1dcc (MD5) Previous issue date: 2010-02-23 / Looking for promising microorganisms for the control of coffee leaf rust, caused by Hemileia vastatrix, were isolated phylloplane residents from coffee leaves healthy by simply washing the sheet or by using ultrasound, with subsequent dilution. Were also selected bacteria capable of forming endospores, yielding a total of 217 isolates. After isolation were carried out four tests for selection of these organisms as biocontrol agents of rust. The first test conducted was the germination of urediniospores of H. vastatrix on glass slide, comparing the germination in distilled water and germination when a drop of each of the isolates obtained was deposited, from this experiment we selected 33 isolates with an inhibitory effect on germination. Subsequently, isolates were tested on leaf discs, as its capacity to suppress disease progression. The 33 isolates were sprayed on leaves of coffee plants at three different times in relation to inoculation with H. vastatrix (24 hours before, simultaneously and 24 hours later). Four isolates were considered capable of reducing the severity of the disease in the conditions of the experiment. These four isolates were tested on detached leaves to confirm the results, again observing reductions in disease severity compared to control, which contained only distilled water. The last experiment was conducted in green-house, comparing the four isolates with the controls (sprayed only with distilled water and with the systemic fungicide epoxiconazol). The four isolates provided the level of disease control similar to that obtained by the use of fungicide (approximately 100%). The identification based on fatty acid profile of the isolates identified UFV 025, UFV UFV 033 and 080 as Bacillus cereus, isolate UFV and 070 as Bacillus sphaericus. With the results of the experiments we can conclude that resident bacteria in the phylloplane of coffee can be isolated and selected as potential biocontrol agents of rust. / Procurando-se microorganismos promissores para o controle da ferrugem do cafeeiro, causada por Hemileia vastatrix, foram isolados residentes do filoplano de folhas de café sadias por simples lavagem de folha ou por utilização de ultra-som, com posterior diluição. Também foram selecionadas bactérias capazes de formar endósporos, obtendo-se um total de 217 isolados. Após o isolamento foram realizados quatro ensaios para seleção destes organismos como agentes de biocontrole da ferrugem. O primeiro ensaio realizado foi de germinação de urediniósporos de H. vastatrix em lâmina de vidro, comparando-se a germinação em água destilada e a germinação quando foi depositada uma gota de cada um dos isolados obtidos, deste experimento foram selecionados 33 isolados com efeito inibitório na germinação. Posteriormente os isolados foram testados, em discos de folhas, quanto a sua capacidade em suprimir o avanço da doença. Os 33 isolados foram atomizados em folhas de cafeeiro em três diferentes tempos em relação à inoculação de H. vastatrix (24 horas antes, simultaneamente e 24 horas depois). Quatro isolados foram selecionados e considerados capazes de reduzir a severidade da doença nas condições do experimento. Esses quatro isolados foram testados em folhas destacadas para confirmação dos resultados, novamente observando-se redução na intensidade da doença em relação à testemunha, que continha apenas água destilada. O último experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, comparando-se os quatro isolados com as testemunhas (pulverização apenas com água destilada e com o fungicida sistêmico epoxiconazol). Os quatro isolados proporcionaram o nível de controle da doença similar ao obtido pelo uso do fungicida (aproximadamente 100%). A identificação baseada no perfil de ácidos graxos identificou os isolados UFV 025, UFV 033 e UFV 080 como Bacillus cereus, e o isolado UFV 070 como Bacillus sphaericus. Com os resultados dos experimentos podemos concluir que bactérias residentes do filoplano de cafeeiro podem ser isoladas e selecionadas como potenciais agentes de biocontrole de ferrugem

Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T07:40:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Queiroz_TaniaMarciade_D.pdf: 1627218 bytes, checksum: 918b6b5965fc39fc4d4c34076a315249 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A ferrugem alaranjada, cujo agente causal é o fungo Hemileia vastatrix Berk & Br., tem sido um dos principais problemas da cultura do cafeeiro em todas as regiões do mundo. Esta doença pode causar prejuízos de até 50% da produção. O fungo ataca todas as variedades de café, porém Coffee canephora apresenta cultivares resistentes, enquanto a maioria dos cultivares comerciais dentro da espécie Coffea arabica é suscetível à doença. Nesse trabalho foi feita a identificação e a caracterização de genes expressos diferencialmente em C. arábica cultivar Icatu Vermelho ¿ IAC 4045 (resistente ao agente da ferrugem). Para isso, foi utilizada a técnica de display diferencial de mRNA. A comparação entre os padrões de cDNAs nos géis permitiu o isolamento de cDNAs com expressão diferencial nos intervalos de 1 hora e 24 horas após a inoculação com o fungo. Alguns desses cDNAs foram clonados e seqüenciados. As seqüências obtidas foram comparadas com seqüências disponíveis no banco de dados do Genoma Café, sendo que oito cDNAs tiveram sua expressão confirmada e apresentaram similaridade com uma anexina, uma proteína M do fotossistema II, uma pirofosfatase prótoninorgânica vacuolar, um Citocromo P450, uma proteinase carboxil-terminal, uma proteína heat shock - HSP70, uma quinase C e uma proteína FIS1. Além da análise da identificação de genes com expressão diferencial, foi feita também uma análise das diferenças metabólicas em folhas de C. arabica cv. Icatu Vermelho - IAC 4045 e Mundo Novo - IAC 501 inoculadas com H. vastatrix. A técnica utilizada nas análises foi DRIFTS (diffuse reflectance infrared Fourier transform spectrometry ou espectroscopia no infravermelho por reflectância difusa com transformada de Fourier). Foram observados picos de reflectância proeminentes em regiões de números de onda 1075 'CM POT. ¿1¿, 1375 'CM POT. ¿1¿, 1555 'CM POT. ¿1¿, 1520 'CM POT. ¿1¿, 1150 'CM POT. ¿1¿ e 1645 'CM POT. ¿1¿. A análise de componentes principais demonstrou que houve uma discriminação entre Icatu Vermelho e Mundo Novo 48 horas após a inoculação e o teste de Tukey mostrou que para as regiões 1555 'CM POT. ¿1¿, 1520 'CM POT. ¿1¿ e 1645 'CM POT. ¿1¿ houve uma diferença significativa entre os cultivares a 5% de probabilidade / Abstract: The orange rust, caused by fungus H. vastatrix Berk & Br., has been the major problem of the coffee culture in all regions of the world. This disease can cause 50% damage in the plantation. The fungus attack all the coffee varieties, but C. canephora present resistant cultivars while the majority of the comercial cultivars into C. arabica is susceptible to disease. This experiment has the purpose of the identification and characterization of the differentially expressed cDNAs in C. arabica cultivar Icatu Vermelho (resistant to rust fungus). For this has been utilized mRNA differential display technique. The comparation between cDNAs in the display gels allowed the cDNAs isolation with differential expression in the intervals of 1 hour and 24 hours after inoculation of leaves with fungus. Some cDNAs were cloned and sequenced. The sequences were compared in Coffee Genome data bank and eight cDNAs had the expression confirmed and present similarity with a annexin, photosystem II M protein, a vacuolar proton inorganic pyrophosphatase, a cytochrome P450 family, a carboxyl-terminal protease, a heat shock 70 kDa protein, and a FIS1 protein. Beyond differential expression of the genes analysis, we also analysed the metabolic differences in C. arabica cultivars Icatu Vermelho (IAC 4045) and Mundo Novo (IAC 501) leaves inoculated with H. vastatrix. The technique utilized was DRIFTS (diffuse reflectance infrared Fourier transform spectrometry). Principal Component Analysis demonstrate there were a discrimination between Icatu Vermelho and Mundo Novo 48 hours after inoculation and Tukey Test showed to the regions 1555 'CM POT. ¿1¿, 1520 'CM POT. ¿1¿, 1645 'CM POT. ¿1¿ there were significative difference between cultivars to 5% of probability / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Luiz Henrique Antunes Rodrigues, Carlos Alberto Alves Meira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Agrícola / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiGirolamoNeto_Cesare_M.pdf: 2582592 bytes, checksum: a61acb99a6b78882f0aef0e7408b48b5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A ferrugem (causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berk. e Br.) é a principal doença do cafeeiro. As perdas da produção causadas por esta doença podem chegar a 50%, caso nenhuma medida de controle seja adotada. O controle da ferrugem pode ser feito com fungicidas, entretanto métodos tradicionais de controle podem levar a aplicações desnecessárias, as quais são responsáveis por gerar gastos excessivos por parte do produtor, na compra e mão de obra para sua aplicação, além de causar impactos ambientais. Ferramentas como modelos de predição, ou alerta, podem ser utilizadas para antecipar quando uma doença de planta pode ocorrer, sendo que uma predição correta evita aplicações desnecessárias de fungicidas. Neste sentido, modelos de alerta para a ferrugem do cafeeiro foram construídos por outros autores, entretanto, após o seu desenvolvimento, estes modelos não foram avaliados com dados externos ao conjunto de treinamento. Estes modelos passaram por um processo de validação neste trabalho e o resultado mostrou um desempenho abaixo do esperado, evidenciando a necessidade de se criarem novos modelos de alerta, com poder de predição maior do que os existentes. O processo de descoberta de conhecimento em bases de dados foi realizado com o objetivo de gerar estes novos modelos de alerta, utilizando técnicas de mineração de dados como: redes neurais artificiais, máquinas de vetores suporte, florestas aleatórias e árvores de decisão. Dados meteorológicos e de espaçamento da lavoura foram às variáveis independentes do conjunto de dados. Os modelos de alerta foram desenvolvidos considerando taxa de progresso da ferrugem como atributo dependente, ou atributo meta, a qual consiste no aumento da incidência entre dois meses subsequentes. Este atributo foi de origem binária, seguindo os limites de 5 e 10 pontos percentuais - p.p. (classe '1' para taxas maiores ou iguais ao limite; classe '0', caso contrário). Foram desenvolvidos modelos de alerta para a cidade de Varginha e para a região Sul de Minas (com adição das cidades de Boa Esperança e Carmo de Minas), para dados entre 1998 e 2011. Os modelos são específicos para lavouras com alta carga pendente ou para lavouras com baixa carga, dado ao café ser uma cultura bianual. Os modelos para a cidade de Varginha obtiveram, no geral, melhor desempenho do que aqueles contendo dados das 3 cidades juntas. Para alta carga pendente de frutos, a taxa de acerto por validação cruzada, foi superior a 85%, considerando o alerta a partir de 5 p.p. Considerando o alerta a partir de 10 p.p., a taxa de acerto se aproximou dos 90%. Já para lavouras com baixa carga pendente, os modelos considerando o alerta a partir de 5 p.p. também chegaram a taxas de acerto próximas a 90%. Houve ainda equilíbrio entre outras medidas de desempenho importantes, como sensitividade, especificidade e confiabilidade positiva ou negativa em todos os modelos. Os modelos mais bem avaliados mostraram ter desempenho superior aos modelos desenvolvidos por outros autores e têm potencial para servir como apoio na tomada de decisão referente à adoção de medidas de controle da ferrugem do cafeeiro / Abstract: Coffee rust (infection by the fungus Hemileia vastatrix Berk. e Br.) can cause up to 50% of yield losses, in the case no protective measures are taken. This disease can be controlled through fungicide applications, however, traditional control methods can lead to unnecessary use of these products, which cause, not only economic losses for the producer, on buying and applying the fungicides, but also major environmental impacts. Tools like warning models can be used to predict when a plant disease may occur and a correct prediction might avoid unnecessary fungicide applications. According to this, some authors developed warning models for coffee rust, nevertheless, after their development, these models were not evaluated by a test set, besides the one used to create it. A Validation procedure was performed over these models, showing that their performance was way low than expected, highlighting the need for new warning models, with better performance than those previously developed. The Knowledge Discovery in Database process was performed intending to develop new warning models by using four data mining techniques: Neural Networks, Support Vector Machines, Random Forests and Decision Trees. Meteorological and crop spacing data were designed as the independent variables. The dependent variable was labeled as the monthly progress rate of coffee rust, which consists on the increase of the incidence levels between two months in a row. It was mapped as a binary attribute, following the limits of five and ten percentage points (p.p.), considering the increase of the infection rate (class '1' for progress rate over or equal the limit, or class '0' otherwise). Models were developed considering 13 years (1998 - 2011) of incoming data for the city of Varginha - Minas Gerais - Brazil and for the South Minas Gerais region (by adding data from two more cities, Boa Esperança and Carmo de Minas). The models developed are specific for high or low fruit loads. Warning models for Varginha obtained, usually, better performance than those developed with data from the three cities. For high fruit load, the accuracy by cross validation was higher than 85%, considering the warning over 5 p.p. Considering the warning over 10 p.p., the accuracy was close to 90%. For low fruit load, the models considering warning over 5 p.p. also obtained accuracy close to 90%. Other important performance measures, such as sensitivity (recall) and specificity, also obtained good values for all of these models. The warning models developed on this study obtained better performance than others previously developed, and have a great potential to be used in decision-making systems, providing further information regarding the correct use of fungicides on controlling the coffee rust / Mestrado / Planejamento e Desenvolvimento Rural Sustentável / Mestre em Engenharia Agrícola

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliverio Poltronieri Neves.pdf: 1073696 bytes, checksum: fb504bb0d3b8635401493089d7bb9ed5 (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / The rust management (Hemileia vastatrix Berk. Et Br), in the culture of conilon coffee (Coffea canephora Pierre ex Froenher) in northern of Espírito Santo has followed a practice of almost exclusive application of systemic fungicides group of triazoles in pre-fixed time. This managemt has contributed to the intensive use of fungicides may favor the emergence of strains of H. vastatrix resistant to systemic fungicides and the need for large number of applications and consequent loss of sustainability of the activity. The objective of this study was to assess the time of application of systemic fungicide to control rust in conilon coffee, based on the incidence and severity of disease. The experiments were conducted in a randomized block design with four blocks and eight treatments. Treatments were systemic fungicides applications when rust incidence reached values of 2.5% (T1), 5% (T2), 10% (T3), 15% (T4), 20% (T5) standard property (T6), the soil in March (T7) and untreated control (T8). Were assessed monthly incidence and severity of Hemileia vastatrix Berk. et Br .The monthly data evaluated about the incidence during the period of the experiment allowed calculating the Area Under Disease Progress Curve (AACPDInc.) and Maximum Intensity Disease (ymax). The incidence and severity at the end of the production cycle and AACPDInc. were subjected to analysis of variance and treatment means were compared by Tukey test at 5% using the program Assistat. Comparisons among the best controls between incidence and severity at the end of the production cycle and AACPDInc. were obtained with the application of foliar fungicide when the incidence was 2.5%, 5% and 10% and spray the soil in March. The data indicate that the incidence monitoring is a good criterion for application of systemic fungicide on crops conilon, however crops must have management strategies that enable intervention in times that the transit of people and machines in farming is hampered / O manejo da ferrugem (Hemileia vastatrix Berk. et Br.) na cultura do café conilon (Coffea canephora Pierre ex Froenher) no norte do Espírito Santo tem seguido uma prática de aplicação quase que exclusiva de fungicidas sistêmicos do grupo dos triazois em épocas pré-fixadas. Esse manejo tem contribuído para uso intensivo de fungicidas, podendo favorecer o surgimento de isolados de H. vastatrix resistentes aos fungicidas sistêmicos, e a necessidade de maior número de aplicações com consequente perda de sustentabilidade da atividade. O objetivo deste trabalho foi avaliar o melhor momento da aplicação de fungicida sistêmico no controle da ferrugem no café conilon, com base na incidência e severidade da doença. Os experimentos foram conduzidos em blocos casualizados, contendo quatro blocos com oito tratamentos. As aplicações ocorreram com fungicidas sistêmicos quando a incidência da ferrugem atingiu os valores de 2,5% (T1), 5% (T2), 10% (T3), 15% (T4), 20% (T5), calendário de aplicação (T6), via solo, em março (T7) e o testemunha sem aplicação (T8). Foram avaliadas, mensalmente, a incidência e severidade da ferrugem no café conilon. Os dados avaliados mensalmente de incidência, durante o período do experimento, permitiu calcular-se a Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPDInc.) e a Intensidade Máxima de Doença (ymax). A incidência e severidade no final do ciclo produtivo e a AACPDInc. foram submetidas à análise de variância e as médias dos tratamentos comparadas pelo teste de Tukey a 5 %, utilizando o programa Assistat. As comparações entre os melhores controles entre incidência e severidade no fim do ciclo produtivo e AACPDInc foram obtidos com a aplicação foliar do fungicida quando a incidência atingiu 2,5 %, 5 % e 10 % e pulverização, via solo, em março. Os dados obtidos indicam que o monitoramento da incidência é um bom critério para aplicação de fungicida sistêmico nas lavouras de conilon. Porém, as lavouras devem dispor de estratégias de manejo que possibilitem a intervenção em épocas em que o trânsito de máquinas e pessoas na lavoura é dificultado

Made available in DSpace on 2015-03-26T12:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1536759 bytes, checksum: edfc663b086d5a927204773326c9803e (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Coffee leaf rust, caused by the biotrophic fungus Hemileia vastatrix, is the main phytosanitary problem of the coffee plant. The disease may cause yield losses ranging from 35 to 50% if control measures are not implemented. During the interaction with the host plant, rust fungi secrete a variety of effector proteins that modify the structure and function of the host cell allowing the biotrophic interaction. Some of these effector proteins, known as avirulence proteins (Avr), are recognized by plant proteins encoded by resistance genes, which triggers a defense response against pathogen infection. At least nine dominant genes (SH1 to SH9) that confer resistance to coffee leaf rust have been genetically identified, but despite many years of research on this pathosystem, the complementary Avr genes of H. vastatrix have not yet been identified or characterized. One approach that can be used for this purpose is to conduct an transcriptome and bioinformatics analyses in order to identify candidate genes of H. vastatrix that fulfill a set of specific criteria common to effector proteins, and their validation by conducting functional assays for effector activities. Therefore, the objectives of this study were: (i) to identify genes of H. vastatrix that encode proteins secreted during the germination of urediniospores as well as during the biotrophic interaction with the coffee plant, (ii) to express the effector gene candidates from H. vastatrix in the yeast secretion trap system (YST) in order to obtain biological confirmation of the secretion prediction made by bioinformatics tools, (iii) to analyze the genomic structure of a select group of effector gene candidates, (iv) to perform expression analysis of the identified candidates during different stages of infection; and (v) to establish a protocol for transient expression of H. vastatrix secreted proteins in coffee leaves based on the Type III Secretion System of Pseudomonas syringae pv. garcae. Initially, the secretome of germinated urediniospores of H. vastatrix was characterized by constructing a cDNA library from mRNA isolated from urediniospores germinated in vitro during 16 hours. After analysis of the ESTs using bioinformatics tools, 146 ORFs that encode secreted proteins were selected. Annotation of these proteins showed that 20% of the secretome from germinated urediniospores consists of hydrolytic enzymes and that most (67%) of the identified secreted proteins have unknown function. From the latter group of sequences, 35 complete ORFs encoding proteins sharing features with effectors from filamentous fungi and named H. vastatrix effector candidates (HvECs) were selected for further analysed. The genomic sequences of 22 of these HvECs were characterized, confirming the ORFs predicted by bioinformatics. The secretion of eight selected HvECs was confirmed in yeast and their expression analysis revealed a differential expression, which possibly occurs in coordination with the morphological changes of the pathogen during the early stages of infection. The secretome of H. vastatrix during a compatible plant-rust interaction was also characterized by a combination of Sanger sequencing and 454 pyrosequencing. This integrated approach allowed the massive sequencing of a substantial number of sequence tags (ESTs) of genes expressed at four different times during the biotrophic interaction: 48 hours, 72 hours, 9 days and 12 days after inoculation of coffee leaves with H. vastatrix. After bioinformatics analyses of these ESTs, 75 HvECs were selected and an expression analyses based on RT- PCR confirmed the fungal origin for 62 of them. 22 of these HvECs are preferentially expressed during the interaction of the fungus with the coffee plant and show distinct patterns of expression along the progress of infection. Using the pEDV system and the Type III Secretion System of P. syringae pv. garcae it was established a protocol to express transiently secreted proteins from H. vastatrix in coffee leaves established. Transient expression of HvEC-016 inside the cytoplasm of coffee plants carrying the rust resistant gene SH1, triggered a plant defense response indicating that there may have occurred a recognition of the HvEC-016 effector protein mediated by the R protein encoded by SH1. The catalog of effector gene candidates for H. vastatrix expressed during both urediniospore germination and the interaction with the coffee plant and the transient assay established in this study is an important plataform to identify additional avirulence genes from Hemileia vastatrix. / A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é o principal problema fitossanitário da cafeicultura, podendo ocasionar perdas da ordem de 35 a 50% da produção se não forem implantadas medidas de controle. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugens secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento da interação biotrófica. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas de avirulência (Avr), são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia uma resposta de defesa da planta contra a infecção pelo patógeno. Já foram identificados geneticamente pelo menos nove genes dominantes (SH1 a SH9) que conferem resistência à ferrugem do cafeeiro, no entanto, apesar de muitos anos de pesquisa neste patossistema, os genes Avr complementares de H. vastatrix ainda não foram identificados ou caracterizados. Uma abordagem que pode ser realizada com esta finalidade é a análise do transcriptôma e de bioinformática para identificar genes candidatos de H. vastatrix que cumpram uma lista de critérios específicos em banco de dados de sequências, seguida da validação por meio de ensaios funcionais para atividades de efetores. Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram: (i) identificar genes de H. vastatrix que codificam proteínas secretadas, expressas durante a germinação dos urediniósporos e também durante a fase biotrófica da interação com o cafeeiro; (ii) expressar genes candidatos a efetores de H. vastatrix, utilizando o sistema armadilha de secreção em levedura YST (Yeast Secretion Trap) para confirmação biológica da predição de secreção realizada por ferramentas de bioinformática; (iii) analisar a estrutura genômica dos genes candidatos a efetores selecionados; (iv) efetuar a análise da expressão temporal dos genes identificados durante as diferentes fases da patogênese; (v) estabelecer um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, com base no Sistema de Secreção Tipo III de Pseudomonas syringae pv. garcae. Inicialmente, caracterizou-se o secretoma de urediniósporos germinados de H. vastatrix por meio da construção de uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA isolado de urediniósporos germinados in vitro por 16 horas. Após análises das sequências por ferramentas de bioinformática, foram selecionadas 146 ORFs que codificam proteínas secretadas. Durante a anotação dessas sequências constatou-se que 20% do secretoma de urediniósporos germinados são constituídos por enzimas hidrolíticas e que a maioria (67%) das proteínas secretadas identificadas possui função desconhecida. A partir dessas sequências foram selecionadas 35 ORFs completas que codificam proteínas com características comuns aos efetores de fungos filamentosos, denominados genes candidatos a efetores de H. vastatrix (HvECs H. vastatrix effector candidates). Desses, 22 HvECs tiveram suas sequências genômicas caracterizadas, confirmando as ORFs preditas por bioinformática. A secreção de oito HvECs selecionados foi comprovada em levedura, e sua expressão diferenciada, que possivelmente ocorre com as mudanças morfológicas do desenvolvimento do patógeno nos estágios inicias de infecção, foi comprovada por meio RT-qPCR. Posteriormente, caracterizou-se o secretoma de H. vastatrix expresso durante uma interação compatível com o cafeeiro, por meio da combinação de sequenciamento Sanger e pirossequenciamento 454. Esta abordagem integrada permitiu o sequenciamento massivo de um substancial número de etiquetas de sequências expressas (ESTs) em folhas de café infectadas com H. vastatrix, amostradas em quatro tempos diferentes durante a fase biotrófica da interação: 48 horas, 72 horas, 9 dias e 12 dias após a inoculação. Após análises de bioinformática foram selecionados 75 genes e as análises de RT-PCR confirmaram a origem fúngica de 62 genes HvECs. Desses, 22 HvECs são preferencialmente expressos durante a interação com o cafeeiro, apresentando padrões distintos de expressão durante a fase biotrófica da interação. Adicionalmente, desenvolveu-se um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, por meio do sistema pEDV e do Sistema de Secreção Tipo III de P. syrigae pv. garcae. A expressão transiente do gene HvEC-016 no citoplasma de cafeeiros resistentes à ferrugem, portadores do gene SH1, desencadeou uma resposta de defesa das plantas, indicando que pode ter ocorrido o reconhecimento da proteína efetora HvEC-016 mediada pela proteína R codificada pelo gene SH1. Esse sistema de expressão transiente e o catálogo de genes candidatos a efetores de H. vastatrix expressos tanto durante a germinação dos urediniósporos como na interação com o cafeeiro, disponibilizados por esse estudo, constituem uma importante plataforma para a identificação de outros genes de avirulência de Hemileia vastatrix.