Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-18Bitstream added on 2014-06-13T18:50:10Z : No. of bitstreams: 1 levada_pm_me_botfm.pdf: 689725 bytes, checksum: c63e816ca9e037b70a0ce24e2abf22a3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Empresa Privada / Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo / A identificação dos diferentes genótipos e subtipos do VHC tem sido útil para o entendimento da evolução da doença e da epidemiologia do vírus em relação a fatores de risco. Atualmente, os métodos de genotipagem assim como a região do genoma viral a ser utilizada constituem temas de discussão. O presente trabalho teve por objetivo comparar a metodologia de hibridização reversa (kit comercial INNO-LiPAÒ v1.0) ao seqüenciamento direto das regiões 5´UTR, NS5B e core do genoma do VHC. Foram utilizadas 92 amostras de plasma de pacientes do Ambulatório de Hepatites da Disciplina de Gastroenterologia Clínica da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP). Dentre as 92 amostras constituintes deste trabalho, 64 foram selecionadas aleatoriamente e 28 foram escolhidas segundo a genotipagem prévia realizada com o kit INNO-LiPAÒ v.1.0. Dentre estas 28 amostras escolhidas, 10 foram genotipadas como 1a/1b, 2 como 2, 2 como 5, 7 apenas como 1 e 7 foram inconclusivas para a genotipagem com o kit comercial. A genotipagem por seqüenciamento direto foi efetuada seguindo as etapas de: extração do RNA viral, transcrição reversa, amplificação das regiões 5´UTR, NS5B e 5´UTR-core por Nested-PCR, reação de marcação fluorescente e eletroforese em aparelho automático ABI 377 (Applied Biosystems). Todas as amostras puderam ser amplificadas para a região 5´UTR e 62 para NS5B. Para as 30 amostras que não puderam ser amplificadas para NS5B foi realizada a amplificação da região 5’UTR-core que se mostrou eficiente na amplificação de 28 (93%) das amostras. A análise de seqüência permitiu uma maior precisão na classificação viral. O seqüenciamento direto foi eficaz na solução de 100% dos resultados inconclusivos pela metodologia de hibridização reversa. Assim como já reportado na literatura o kit comercial INNO-LiPAÒ v.1.0 produziu resultados errôneos com... / The HCV genotypes and subtypes identification has been useful to understand the disease evolution and viral epidemiological regarding risk factors. Recently, the genotyping methods and viral genomic region used in viral typing have been very discussed in scientific community. The goal of this study was to compare the reverse hybridization methodology and sequencing of the HCV genomic regions 5´UTR, NS5B and core. Ninety-two plasma sample with viral RNA detected from patients assisted in the Department of Internal Medicine – Gastroenterology Division, Botucatu Medical School, University of São Paulo State - UNESP were used in this study. From these 92 samples, 64 were randomly selected and 28 choose according genotyping result by reverse hybridization. The genotyping by reverse hybridization were performed with INNO-LiPAÒ v.1.0, according manufacturer's instructions. To genotyping by sequencing viral RNA isolated from plasma samples was used as a source for RT-PCR amplification and automatic sequencing in ABI 377 sequencer (Applied Biosystems). All samples were amplified to 5’UTR genomic region and 62 to NS5B. From 30 samples that showed insucess in NS5B amplification, 28 (93%) were amplified to 5’UTR-core region with efficiency. The genotyping by sequencing allowed more precision in viral classification. The sequencing showed efficient in the resolution of the 100% of cases inconclusive by reverse hybridization. The genotyping by INNOLiPA Ò v.1.0 showed wrong results in relation of viral subtyping, corroborating previous results of the scientific literature. The sequencing also demonstrated at least a change of viral genotype when compared with INNO-LiPAÒ v.1.0, result that could influence the therapeutic decision, turning questionable the INNO-LiPAÒ v.1.0 efficiency to determine the viral genotypes, too.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-19Bitstream added on 2014-08-13T18:00:23Z : No. of bitstreams: 1 000760134.pdf: 1725206 bytes, checksum: 222454d9746b364842305efbfe5f9a10 (MD5) / A Organização Mundial de Saúde (OMS) define como idoso todo indivíduo com mais de 60 anos de idade. Atualmente no Brasil os idosos são aproximadamente 15 milhões de pessoas e apesar de viverem mais, apresentam maiores condições crônicas devido ao declínio da maioria das funções orgânicas, inclusive do sistema imunológico, aumentando a susceptibilidade e a maior incidência de doenças infecciosas. As hepatites virais tem distribuição mundial e são doenças infecciosas que apresentam características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais distintas. Há uma estimativa de que 350 milhões de pessoas sejam portadores crônicos do vírus da hepatite B (VHB) ao redor do mundo e, embora menos prevalente que a hepatite B, o vírus da hepatite C (VHC) é a causa mais comum de hepatite crônica com cerca de 180 milhões de indivíduos infectados. Embora os conhecimentos a respeito da patogênese, curso e tratamento das hepatites virais crônicas tenham avançado nos últimos anos, há ainda pouco conhecimento sobre seu curso e tratamento na população idosa, especialmente no Brasil, justificando a relevância deste estudo, cujo objetivo geral é avaliar a prevalência de hepatites virais crônicas B e C na população idosa residente no município de Botucatu-SP. Foi realizado com 1029 idosos cadastrados na UNIMED, nas Unidades Básicas de Saúde, Unidades de Saúde da Família, participantes de Centros de Convivência de Terceira Idade e residentes em instituições de longa permanência. Os voluntários, após assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), foram submetidas a testes sorológicos para detecção do Anti-HBs, AgHbs e Anti HBc IgG, onde foram coletados 5ml de sangue através de punção venosa com seringa e agulha descartáveis. Para detecção do anti-VHC foram realizados testes sorológicos digitais (HCV Rapid Test Bioeasy®). A mediana de idade encontrada foi de 71 anos (65:78). A prevalência de ... / The World Health Organization (WHO) defines as elderly any person aged over 60 years old. Currently in Brazil the elderly are approximately 15 million people and although they live longer have more chronic conditions due to decline in most physiological functions, including immune system, increasing susceptibility and a higher incidence of infectious diseases. Viral hepatitis has a worldwide distribution and are infectious diseases that present epidemiological, clinical and laboratory differences. It is estimated that 350 million people are chronic carriers of hepatitis B virus (HBV) worldwide and, although less prevalent than hepatitis B, hepatitis C virus (HCV) is the most common cause of chronic hepatitis with about 180 million infected individuals. While the knowledge about the pathogenesis, course and treatment of chronic viral hepatitis have advanced in recent years, there is still little knowledge about their course and treatment in the elderly population, especially in Brazil, justifying the relevance of this study, whose general objective is to evaluate the prevalence of chronic viral hepatitis B and C in the elderly population living in Botucatu-SP. Was held with 1029 elderly enrolled in Basic Health Units, the Family Health Units, participants of Social Centers for Seniors and residents of long-term institutions. The volunteers, after having signed an informed consent (IC), were submitted for serological tests for the detection of anti-HBs, HBsAg and Anti HBc IgG, where 5 ml of blood were collected by venipuncture with syringe and disposable needle. For detection of anti-HCV digital serological tests were done (HCV Rapid Test Bioeasy®). Mean age was 72.01 years (± 8.19 years). The prevalence of HBsAg positive with elderly was 0,58% and of these, all showed results for HBeAg negative characterizing inactive chronic disease. For the Anti-HCV, prevalence was 1,94%, data in agreement with ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-14Bitstream added on 2014-06-13T18:31:21Z : No. of bitstreams: 1 yamasaki_lht_me_sjrp.pdf: 6194517 bytes, checksum: 350d37acd1e46ef2885eecc1354a317c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) é considerada um grande problema de saúde pública, desde a sua descoberta em 1989. Entretanto a terapia mais utilizada atualmente, baseada no uso de Peginterferon, tem sucesso em aproximadamente 50% dos pacientes com o genótipo 1. Embora os mecanismos envolvidos nesta resistência viral ainda não sejam esclarecidos, sugere-se que fatores virais e do hospedeiro participam deste. A proteína não-estrutural 5A (NS5A) está envolvida em diversos processos celulares e é um componente essencial para o HCV. Entretanto, sua estrutura e função ainda não foram bem elucidadas. A partir destes fatos, os objetivos do presente estudo foram elaborar um modelo teórico da NS5A e investigar as propriedades estruturais e funcionais in silico. Foram analisadas 345 sequências da proteína NS5A do HCV de 23 pacientes infectados com o genótipo 1 ou 3. As composições de aminoácidos e de estrutura secundária demonstraram que há diferença entre os genótipos, podendo indicar que há diferenças nas interações proteína-proteína entre os genótipos, o que pode estar relacionado com a diferença da taxa de resistência ao tratamento. A análise funcional foi realizada com o ProtFun, que sugeriu que a NS5A estaria envolvida nas funções celulares de metabolismo intermediário central, tradução, crescimento, tranporte, ligação e hormônio. Estas funções variaram entre os domínios, suportando a hipótese de que a NS5A é uma proteína multifuncional. A análise pelo PROSITE indicou vários sítios de glicosilação, fosforilação e miristoilação, que são altamente conservados e podem ter função importante na estabilização da estrutura e função, sendo assim possíveis alvos de novos antivirais. Alguns deles estão em regiões relacionadas com a resposta ao tratamento. Outro... / Hepatitis C virus (HCV) infects almost 3% of people worldwide and it is considered the main cause of liver chronic diseases and transplants. Until today, there is no effective vaccine and the current most used therapy, based on Peginterferon, is successful only in 50% of patients infected by genotype 1. Although the outcomes of this treatment resistance are unclear, it is suggested host and virus factors may participate in this mechanism. Non-structural 5A (NS5A) protein is involved in several cellular and virus processes and it is a critical component of HCV. However, its structure and function are still uncertain. Regarding these facts, the present study attachments were to elaborate a model of the NS5A protein and to investigate NS5A structural and functional features, using in silico tools. It was analyzed 345 sequences of HCV NS5A protein from 23 patients infected by genotypes 1 or 3. Residues and secondary structure composition of all sequences demonstrated that there are differences between genotypes. It may indicate that there are differences in interactions between genotypes, which could be related with the distinct average of treatment resistance. In addition, among those that varied between genotypes, there were amino acids in regions that studies suggested as related with virus persistence. Functional analysis was performed with ProtFun. It suggested that NS5A is involved with central intermediary metabolism, translation, growth, transport, ligation and hormone functions in the cell. These functions vary between the domains, strengthening the hypothesis that NS5A is a multifunctional protein. Prosite motif search indicated that there are many glicosilation, fosforilation and myristoilation sites, which are highly conserved and may play an important role in structural stabilization and... (Complete abstract click electronic access below)

Orientadores: Fernando Lopes Gonçales Junior, Neiva Sellan Lopes Lopes Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T09:07:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Corghi_DanielaBrambila_M.pdf: 459057 bytes, checksum: 1b987bc8d3a81c9e46ae85afcfc30e75 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A hepatite pelo vírus C (HVC) é uma doença amplamente disseminada e de curso geralmente insidioso. Considera-se que 50 a 80% dos indivíduos com HVC aguda evoluirão para cronicidade. Cerca de 50% vão necessitar tratamento específico com algum tipo de interferon combinado, ou não, à ribavirina. O principal objetivo do tratamento da HVC crônica é obter-se uma resposta virológica sustentada (RVS). O interesse no estudo da hepatite C e alelos HLA classe II (loci DRB1 e DQB1) se deve ao fato de o Sistema HLA apresentar associação com várias patologias. Foram estudados 102 pacientes etnicamente miscigenados, não-aparentados, infectados pelo vírus da hepatite C (VHC), com anti-HIV e HBsAg negativos atendidos no Hospital das Clínicas da UNICAMP. Foi possível determinar o genótipo do VHC em 98 indivíduos e realizou-se a biópsia hepática em 83 pacientes. A genotipagem dos alelos HLA classe II (loci DRB1 e DQB1) foi realizada nos 102 pacientes pela técnica de PCR-SSP de baixa resolução. Os 102 pacientes foram tratados com IFN isolado ou associado à ribavirina ou PEG-IFN associado à ribavirina por 6 ou 12 meses de acordo com o genótipo do VHC. Destes 102, 51% dos pacientes apresentaram RVS ao tratamento. Correlacionando-se a presença dos alelos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 com o genótipo do VHC e resposta virológica observou-se associação entre menor porcentual de RVS com a presença dos alelos HLA-DQB1*03 e HLA-DQB1*06 em pacientes infectados pelo genótipo 3. Observou-se associação entre a presença do alelo HLA-DRB1*04 e maior freqüência de cirrose hepática nos pacientes com HVC crônica. Encontrou-se uma freqüência 2,7 vezes maior do alelo HLA-DRB1*07 nos indivíduos infectados pelo VHC do que na população geral. Observamos associação estatisticamente significante entre a presença do alelo HLA-DQB1*02 e infecção pelo VHC quando comparado ao grupo controle. Houve concomitância da presença dos alelos HLA-DRB1*13 e HLA-DQB1*02 nos pacientes que não apresentaram RVS. Não encontramos associação entre presença dos alelos HLA-DRB1 e HLA-DQB1 quando comparamos pacientes com RVS e pacientes sem RVS. Este trabalho permitiu estabelecer relações entre o Sistema HLA e a hepatite C em pacientes brasileiros / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) infection becomes chronic in most cases, with only 10-20% of those infected not developing persistent viraemia. The knowledge of host factors that influence the course of the disease is still limited. The immune response to HCV may be an important determinant of disease resolution and can be influence by a number of host factors. We investigated the distribution of HLA class II alleles in patients with chronic hepatitis C using a low-resolution PCR-sequence-specific-primer method to assess whether MHC class II alleles are associated with HCV infection and with their response to interferon therapy. One hundred and two unrelated white Brazilian patients with confirmed chronic HCV infection were included in this study. Fifty-two patients with sustained viral response after therapy (responder) and 50 patients without sustained viral response (non-responder) after completion of therapy were included in this study. The HLA-DRB1*07 allele was significantly more frequent in chronic hepatitis C patients than in controls. The higher frequencies of HLA-DRB1*13 and HLA-DQB1*02 in these patients were not significantly different after P correction. There was no significant difference between the phenotype frequencies of HLA-DRB1 and HLA-DQB1 alleles in responder with non-responder patients. We found that HLA-DRB1*07 is associated with chronic HCV infection / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T15:19:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_PatriciaRibeirode_D.pdf: 30024723 bytes, checksum: 2ccab093b151640dcfa12bf976450ad6 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A infecção crônica pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma das causas do desenvolvimento do câncer de fígado. O genoma do HBV codifica a onco-proteína HBx, uma proteína multi-funcional de 17 kDa que possui 10 resíduos de cisteína, e que está relacionada com a indução do câncer de fígado em camundongos transgênicos para HBx. Apesar de não ter uma função definida, sabe-se que a proteína HBx é um potente trans-ativador transcricional, ativando a transcrição de muitos promotores virais e celulares através de interações proteína-proteína, uma vez que HBx não interage diretamente com o DNA de fita dupla. Desta forma, HBx pode afetar a replicação e proliferação virais, e interferir nos processos celulares de apoptose e carcinogênese. Neste trabalho, a proteína HBx foi expressa em E. coli, em fusão com a proteína GST ou com a cauda de poli-histidina, e utilizada em ensaios funcionais e estruturais. Através de ensaios de retardamento da mobilidade eletroforética e UV cross-linking, observou-se que a proteína HBx possui uma afinidade maior pelos oligonucleotídeos de RNA ricos em bases "A", "V" e "AV", com tamanho superior a 21-mer, e que os resíduos de cisteína não interferiram na ligação da HBx com o oligonucleotídeo de RNA AV-38. A ausência dos resíduos de eisteína da proteína HBx também não interferiu na ativação do promotor alvo para a proteína p53, em sistema de mono-híbrido em levedura, nem tampouco na interação in vitro da HBx com a proteína humana p53, o que foi confirmado através de um ensaio de co-precipitação. Em cultura de células HeLa, a proteína HBx causou um aumento do crescimento celular e uma leve uma estabilização dos mRNAs dos proto-oncogenes c-fos e c-myc, como mostraram os ensaios de cinética de degradação de mRNAs, e esta estabilização poderia contribuir para o fenótipo transformador da onco-proteína HBx. Os experimentos de dicroísmo circular e de fluorescência mostraram que a proteína HBx encontrava-se parcialmente estruturada em solução aquosa, mas apresentou uma tendência à estruturação sob determinadas condições experimentais, o que poderia ser uma conseqüência de uma provável flexibilidade conformacional inerente à proteína HBx. Vma estrutura flexível poderia explicar as interações observadas entre a HBx e uma variedade de proteínas celulares e ácidos nucléicos de fita simples, de modo que a proteína HBx poderia interferir nos processos de sinalização, transcrição, apoptose e nos mecanismos de reparo de DNA, que levariam ao desenvolvimento do câncer de fígado / Abstract: Chronic infection of the hepatitis B virus (HBV) is one of the causes leading to liver cancer. The HBV genome encodes the 17 kDa onco-protein HBx, a multi-functional protein that contains 10 cysteine residues and is related to induce liver cancer in transgenic mice. The exact function of HBx is still unknown. However, it has been shown that HBx is a potent trans-activator, which activates transcription of many cellular and viral promoters indirecdy through protein-protein interactions, although it does not bind to double-stranded DNA direcdy. Besides, the HBx protein can affect viral replication and proliferation, and it interferes with cellular apoptosis and carcinogenesis. In this work, the recombinant HBx protein was expressed in E. coli as a GST or 6xHis fusion protein, and used in functional and structural assays. By Electrophoretic Mobility Shift Assay and UV cross-linking assays, it was observed that the HBx protein was able to bind to the "A", "V" and "AV" rich RNA oligonucleotides, and that the cysteine residues of the HBx protein were not required for its binding to the AV-rich RNA oligonucleotide (AV-38). The lack of cysteine residues in the HBx protein did not interfere with the pS3 promoter activation in the yeast one-hybrid system, or neither in the in vitro interaction through a co-precipitation assay of the HBx and human p53 protein. In HeLa cells, the HBx protein increased the cellular growth and caused a slight c-fos and c-myc mRNA stabilization. This mRNA stabilization could contribute for the transforming character of the onco-protein HBx. Both the circular dichroism and fluorescence spectroscopic assays had shown that the HBx protein was partially structured in aqueous solution, but the protein presented a propensity to gain secondary structure under specific experimental conditions. The HBx inherent conformational flexibility might explain its interaction with a wide array of cellular proteins and single-stranded nucleic acids, in a way that the HBx protein interferes with signaling cellular processes, modulates transcription, apoptosis and DNA repair, and contributes to the development of the liver cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-15Bitstream added on 2014-06-13T21:03:48Z : No. of bitstreams: 1 provazzi_pjs_dr_sjrp.pdf: 1081709 bytes, checksum: 9a35b9ad50fc4eed266a481d830f02de (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus