Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:49:57Z : No. of bitstreams: 1 brenner_mpc_me_araca.pdf: 350193 bytes, checksum: 3a33f5c5edd18147c32800c3b76b95e8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia da reprodução aplicada rotineiramente no melhoramento genético da espécie bovina. No entanto, ainda não está determinado até que ponto sua utilização pode implicar na disseminação de patógenos, como por exemplo, do Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5), considerado um α-herpesvirus neuro- virulento, potencialmente patogênico em bovinos. Para avaliar o impacto da exposição de oócitos bovinos ao BoHV-5 este estudo avaliou as taxas de desenvolvimento dos embriões bovinos produzidos in vitro, a atividade mitocondrial, a ação antioxidante e a resposta ao estresse em dois grupos distintos; grupo controle e grupo expostos ao BoHV-5. A qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro, não foi afetada pela exposição ao BoHV- 5, a taxa de produção foi de 54,6 % no controle e 49,7% no exposto. O DNA viral correspondente ao gene US9 foi identificado em embriões bovinos no D7 após a fecundação in vitro e confirmado por reação imunofluorescência indireta. Os resultados revelaram diferenças (p<0,05) entre embrião do grupo de expostos e controle pelo MitoTracker Green FM, e pelo Jc-1. Não existiu diferença significativa nos índices de Hoechst 33342. Os embriões expostos produziram proteína antioxidante tipo 1 (AOP-1). Nenhum dos grupos produziram a proteína do choque térmico heat shock protein (Hsp 70.1). Ambos os grupos produziram a superóxido desmutase (SOD1), revelando atividade mitocondrial intensa, sem interferir na quantidade e qualidade dos embriões produzidos. Esses achados podem ajudar a entender a habilidade do α- herpesvirus em prevenir a apoptose / The in vitro production of embryos is a biotechnology of reproduction routinely applied in the improvement of the bovine specie. However, it is not yet determined the extent to which its use may result in the spread of pathogens, such as the bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), considered an α-herpesvirus neuro-virulent, potentially pathogenic in cattle. To assess the impact of exposure of bovine oocytes to BoHV-5 we studied the developmental rates of bovine in vitro produced, mitochondrial activity, antioxidant effects, stress response into two distinct groups, control group and group exposed to BoHV-5. The quality of bovine embryos produced in vitro was not affected by exposure to BoHV-5, the production rate was 54.6% in the control and 49.7% in the exposure. The viral DNA corresponding to the US9 gene was identified in the D7 bovine embryos after in vitro fertilization and confirmed by indirect immunofluorescence reaction. The results revealed differences (p <0.05) between embryo exposed group and control by MitoTracker Green FM, and the Jc-1. There was no significant difference in rates of Hoechst 33342. The exposed embryos produced antioxidant protein type 1 (AOP-1). None of them produced heat shock protein (Hsp 70.1). Both groups produced the superoxide dismutase (SOD1), revealing intense mitochondrial activity, without interfering in the quantity and quality of embryos produced. These findings may help understand the ability of α-herpesvirus in preventing apoptosis

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Cursi / Resumo: A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia da reprodução aplicada rotineiramente no melhoramento genético da espécie bovina. No entanto, ainda não está determinado até que ponto sua utilização pode implicar na disseminação de patógenos, como por exemplo, do Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5), considerado um α-herpesvirus neuro- virulento, potencialmente patogênico em bovinos. Para avaliar o impacto da exposição de oócitos bovinos ao BoHV-5 este estudo avaliou as taxas de desenvolvimento dos embriões bovinos produzidos in vitro, a atividade mitocondrial, a ação antioxidante e a resposta ao estresse em dois grupos distintos; grupo controle e grupo expostos ao BoHV-5. A qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro, não foi afetada pela exposição ao BoHV- 5, a taxa de produção foi de 54,6 % no controle e 49,7% no exposto. O DNA viral correspondente ao gene US9 foi identificado em embriões bovinos no D7 após a fecundação in vitro e confirmado por reação imunofluorescência indireta. Os resultados revelaram diferenças (p<0,05) entre embrião do grupo de expostos e controle pelo MitoTracker Green FM, e pelo Jc-1. Não existiu diferença significativa nos índices de Hoechst 33342. Os embriões expostos produziram proteína antioxidante tipo 1 (AOP-1). Nenhum dos grupos produziram a proteína do choque térmico heat shock protein (Hsp 70.1). Ambos os grupos produziram a superóxido desmutase (SOD1), revelando atividade mitocondrial intensa, sem interferir na quantidade e qualidade dos embriões produzidos. Esses achados podem ajudar a entender a habilidade do α- herpesvirus em prevenir a apoptose / Abstract: The in vitro production of embryos is a biotechnology of reproduction routinely applied in the improvement of the bovine specie. However, it is not yet determined the extent to which its use may result in the spread of pathogens, such as the bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), considered an α-herpesvirus neuro-virulent, potentially pathogenic in cattle. To assess the impact of exposure of bovine oocytes to BoHV-5 we studied the developmental rates of bovine in vitro produced, mitochondrial activity, antioxidant effects, stress response into two distinct groups, control group and group exposed to BoHV-5. The quality of bovine embryos produced in vitro was not affected by exposure to BoHV-5, the production rate was 54.6% in the control and 49.7% in the exposure. The viral DNA corresponding to the US9 gene was identified in the D7 bovine embryos after in vitro fertilization and confirmed by indirect immunofluorescence reaction. The results revealed differences (p <0.05) between embryo exposed group and control by MitoTracker Green FM, and the Jc-1. There was no significant difference in rates of Hoechst 33342. The exposed embryos produced antioxidant protein type 1 (AOP-1). None of them produced heat shock protein (Hsp 70.1). Both groups produced the superoxide dismutase (SOD1), revealing intense mitochondrial activity, without interfering in the quantity and quality of embryos produced. These findings may help understand the ability of α-herpesvirus in preventing apoptosis / Mestre

No presente estudo, buscou-se avaliar quais seriam as cepas de herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) seriam mais adequadas para uso como vírus de confrontação em testes de soroneurtralização (SN). Oitocentas e dez amostras de soros de duas regiões geograficamente distintas foram avaliadas à SN frente a seis diferentes cepas virais, incluindo tipos e subtipos diversos (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO95/97). A maior sensibilidade foi revelada pelo somatório de soropositivos identificados com as seis cepas utilizadas no estudo. Uma combinação de quatro vírus (BoHV-1.1: LA e EVI123/98, BoHV-5a: EVI88/95 e BoHV-5b: A663) foi capaz de detectar 99,1% das amostras soropositivas. Estes quatro vírus foram selecionados para serem utilizados em um levantamento soroepidemiológico com o intuito de estimar a prevalência das infecções causadas pelos BoHV-1 e BoHV-5 no Estado do Rio Grande do Sul. Para tanto, soros de 2200 fêmeas bovinas adultas (>24 meses), representativos da população bovina do Rio Grande do Sul, foram submetidos à SN frente às quatro cepas virais escolhidas. om esta combinação, a soroprevalência média das infecções por BoHV-1 e BoHV-5 encontrada foi de 29,2%. Além disso, analisando outros fatores que pudessem influenciar a prevalência das infecções, foram considerados fatores de risco o tipo de exploração corte, a ausência da prática de ordenha, o contato dos bovinos com ovinos/caprinos e animais silvestres, a venda de animais de reprodução, o uso de piquetes de parto/pós-parto, o uso de assistência veterinária privada e a criação de animais de raças européias de corte. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que, para que a SN seja capaz de detectar animais soropositivos ao BoHV-1 e BoHV-5 com a máxima sensibilidade, o teste deve ser realizado com várias amostras de BoHV-1 e BoHV-5, não necessariamente de tipos ou subtipos diferentes, pois amostras do mesmo tipo de vírus apresentarrm diferentes sensibilidades. Além disso, as amostras de confrontação podem variar de acordo com a região geográfica de origem dos soros. Os resultados obtidos nesse levantamento revelam que anticorpos anti-BoHV-1 e anti-BoHV-5 encontram-se amplamente distribuidos nos rebanhos gaúchos. No entanto, não foi possível determinar a prevalência tipo-específica destas infecções com os testes realizados. Assim, a proporção de animais que estão infectados com o BoHV-1 ou com o BoHV-5 (ou ambos) na região examinada permanece desconhecida. / In this study a search was carried out to determine which of a number of available strains/isolates of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) would be more suitable for use as challenge virus in serum neutralization (SN) tests. Eight hundred and ten bovine serum samples collected from two geographically distinct regions were evaluated in SN tests against six BoHVs of different types and subtypes (BoHV-1.1: EVI123/98 and Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 and BoHV-5c: ISO95/97). The highest sensitivity was achieved when the SN-positive sera obtained with the six different viruses were added. A combination of four viruses (BoHV-1.1 LA, and EVI123/98, BoHV-5a EVI88/95 and BoHV-5b A663), was able to detect 99.1% of the seropositive samples. These four viruses were selected to carry out a seroepidemiological survey to estimate BoHV-1 and BoHV-5 prevalence in the state of Rio Grande do Sul. In order to achieve that, sera from 2,200 bovine female cows (>24 months-old), representative of the bovine population of Rio Grande do Sul state were tested on SN tests against the four selected viruses. With such combination, seroprevalence of BoHV-1 and BoHV-5 infections was 29.2%. After examining potential factors that might affect the prevalence of such infections, the following were considered as significant risk factors: the type of exploitation (beef cattle > dairy), use of milking procedures, concomitant presence of sheep, goats or wild animals in farm; sale of animals for reproductive purposes; use of pre and postparturition paddocks; use of private veterinary assistance and farming of European beef breeds. The results obtained here indicate that for the SN test to provide the highest sensitivity in detecting BoHV-1 and BoHV-5 seroposivive animals, it must be performed against a number of BoHV-1 and BoHV-5 strains, though not necessarily of different types and subtypes as viruses within a same subtype may display different sensitivities. Besides, challenge viruses may vary for geographically distinct areas. The serological survey performed with four distinct bovine herpesviruses reveal that antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 are widely distributed among cattle flocks in Rio Grande do Sul. However, it was not possible to determine type-specific prevalence with the tests performed. Thus, the proportion of cattle actually infected with either BoHV-1 or BoHV-5 (or both) in the examined region remains undetermined.

No presente estudo, buscou-se avaliar quais seriam as cepas de herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) seriam mais adequadas para uso como vírus de confrontação em testes de soroneurtralização (SN). Oitocentas e dez amostras de soros de duas regiões geograficamente distintas foram avaliadas à SN frente a seis diferentes cepas virais, incluindo tipos e subtipos diversos (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO95/97). A maior sensibilidade foi revelada pelo somatório de soropositivos identificados com as seis cepas utilizadas no estudo. Uma combinação de quatro vírus (BoHV-1.1: LA e EVI123/98, BoHV-5a: EVI88/95 e BoHV-5b: A663) foi capaz de detectar 99,1% das amostras soropositivas. Estes quatro vírus foram selecionados para serem utilizados em um levantamento soroepidemiológico com o intuito de estimar a prevalência das infecções causadas pelos BoHV-1 e BoHV-5 no Estado do Rio Grande do Sul. Para tanto, soros de 2200 fêmeas bovinas adultas (>24 meses), representativos da população bovina do Rio Grande do Sul, foram submetidos à SN frente às quatro cepas virais escolhidas. om esta combinação, a soroprevalência média das infecções por BoHV-1 e BoHV-5 encontrada foi de 29,2%. Além disso, analisando outros fatores que pudessem influenciar a prevalência das infecções, foram considerados fatores de risco o tipo de exploração corte, a ausência da prática de ordenha, o contato dos bovinos com ovinos/caprinos e animais silvestres, a venda de animais de reprodução, o uso de piquetes de parto/pós-parto, o uso de assistência veterinária privada e a criação de animais de raças européias de corte. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que, para que a SN seja capaz de detectar animais soropositivos ao BoHV-1 e BoHV-5 com a máxima sensibilidade, o teste deve ser realizado com várias amostras de BoHV-1 e BoHV-5, não necessariamente de tipos ou subtipos diferentes, pois amostras do mesmo tipo de vírus apresentarrm diferentes sensibilidades. Além disso, as amostras de confrontação podem variar de acordo com a região geográfica de origem dos soros. Os resultados obtidos nesse levantamento revelam que anticorpos anti-BoHV-1 e anti-BoHV-5 encontram-se amplamente distribuidos nos rebanhos gaúchos. No entanto, não foi possível determinar a prevalência tipo-específica destas infecções com os testes realizados. Assim, a proporção de animais que estão infectados com o BoHV-1 ou com o BoHV-5 (ou ambos) na região examinada permanece desconhecida. / In this study a search was carried out to determine which of a number of available strains/isolates of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) would be more suitable for use as challenge virus in serum neutralization (SN) tests. Eight hundred and ten bovine serum samples collected from two geographically distinct regions were evaluated in SN tests against six BoHVs of different types and subtypes (BoHV-1.1: EVI123/98 and Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 and BoHV-5c: ISO95/97). The highest sensitivity was achieved when the SN-positive sera obtained with the six different viruses were added. A combination of four viruses (BoHV-1.1 LA, and EVI123/98, BoHV-5a EVI88/95 and BoHV-5b A663), was able to detect 99.1% of the seropositive samples. These four viruses were selected to carry out a seroepidemiological survey to estimate BoHV-1 and BoHV-5 prevalence in the state of Rio Grande do Sul. In order to achieve that, sera from 2,200 bovine female cows (>24 months-old), representative of the bovine population of Rio Grande do Sul state were tested on SN tests against the four selected viruses. With such combination, seroprevalence of BoHV-1 and BoHV-5 infections was 29.2%. After examining potential factors that might affect the prevalence of such infections, the following were considered as significant risk factors: the type of exploitation (beef cattle > dairy), use of milking procedures, concomitant presence of sheep, goats or wild animals in farm; sale of animals for reproductive purposes; use of pre and postparturition paddocks; use of private veterinary assistance and farming of European beef breeds. The results obtained here indicate that for the SN test to provide the highest sensitivity in detecting BoHV-1 and BoHV-5 seroposivive animals, it must be performed against a number of BoHV-1 and BoHV-5 strains, though not necessarily of different types and subtypes as viruses within a same subtype may display different sensitivities. Besides, challenge viruses may vary for geographically distinct areas. The serological survey performed with four distinct bovine herpesviruses reveal that antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 are widely distributed among cattle flocks in Rio Grande do Sul. However, it was not possible to determine type-specific prevalence with the tests performed. Thus, the proportion of cattle actually infected with either BoHV-1 or BoHV-5 (or both) in the examined region remains undetermined.

No presente estudo, buscou-se avaliar quais seriam as cepas de herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) seriam mais adequadas para uso como vírus de confrontação em testes de soroneurtralização (SN). Oitocentas e dez amostras de soros de duas regiões geograficamente distintas foram avaliadas à SN frente a seis diferentes cepas virais, incluindo tipos e subtipos diversos (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO95/97). A maior sensibilidade foi revelada pelo somatório de soropositivos identificados com as seis cepas utilizadas no estudo. Uma combinação de quatro vírus (BoHV-1.1: LA e EVI123/98, BoHV-5a: EVI88/95 e BoHV-5b: A663) foi capaz de detectar 99,1% das amostras soropositivas. Estes quatro vírus foram selecionados para serem utilizados em um levantamento soroepidemiológico com o intuito de estimar a prevalência das infecções causadas pelos BoHV-1 e BoHV-5 no Estado do Rio Grande do Sul. Para tanto, soros de 2200 fêmeas bovinas adultas (>24 meses), representativos da população bovina do Rio Grande do Sul, foram submetidos à SN frente às quatro cepas virais escolhidas. om esta combinação, a soroprevalência média das infecções por BoHV-1 e BoHV-5 encontrada foi de 29,2%. Além disso, analisando outros fatores que pudessem influenciar a prevalência das infecções, foram considerados fatores de risco o tipo de exploração corte, a ausência da prática de ordenha, o contato dos bovinos com ovinos/caprinos e animais silvestres, a venda de animais de reprodução, o uso de piquetes de parto/pós-parto, o uso de assistência veterinária privada e a criação de animais de raças européias de corte. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que, para que a SN seja capaz de detectar animais soropositivos ao BoHV-1 e BoHV-5 com a máxima sensibilidade, o teste deve ser realizado com várias amostras de BoHV-1 e BoHV-5, não necessariamente de tipos ou subtipos diferentes, pois amostras do mesmo tipo de vírus apresentarrm diferentes sensibilidades. Além disso, as amostras de confrontação podem variar de acordo com a região geográfica de origem dos soros. Os resultados obtidos nesse levantamento revelam que anticorpos anti-BoHV-1 e anti-BoHV-5 encontram-se amplamente distribuidos nos rebanhos gaúchos. No entanto, não foi possível determinar a prevalência tipo-específica destas infecções com os testes realizados. Assim, a proporção de animais que estão infectados com o BoHV-1 ou com o BoHV-5 (ou ambos) na região examinada permanece desconhecida. / In this study a search was carried out to determine which of a number of available strains/isolates of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) would be more suitable for use as challenge virus in serum neutralization (SN) tests. Eight hundred and ten bovine serum samples collected from two geographically distinct regions were evaluated in SN tests against six BoHVs of different types and subtypes (BoHV-1.1: EVI123/98 and Los Angeles; BoHV-1.2a: SV265/96; BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 and BoHV-5c: ISO95/97). The highest sensitivity was achieved when the SN-positive sera obtained with the six different viruses were added. A combination of four viruses (BoHV-1.1 LA, and EVI123/98, BoHV-5a EVI88/95 and BoHV-5b A663), was able to detect 99.1% of the seropositive samples. These four viruses were selected to carry out a seroepidemiological survey to estimate BoHV-1 and BoHV-5 prevalence in the state of Rio Grande do Sul. In order to achieve that, sera from 2,200 bovine female cows (>24 months-old), representative of the bovine population of Rio Grande do Sul state were tested on SN tests against the four selected viruses. With such combination, seroprevalence of BoHV-1 and BoHV-5 infections was 29.2%. After examining potential factors that might affect the prevalence of such infections, the following were considered as significant risk factors: the type of exploitation (beef cattle > dairy), use of milking procedures, concomitant presence of sheep, goats or wild animals in farm; sale of animals for reproductive purposes; use of pre and postparturition paddocks; use of private veterinary assistance and farming of European beef breeds. The results obtained here indicate that for the SN test to provide the highest sensitivity in detecting BoHV-1 and BoHV-5 seroposivive animals, it must be performed against a number of BoHV-1 and BoHV-5 strains, though not necessarily of different types and subtypes as viruses within a same subtype may display different sensitivities. Besides, challenge viruses may vary for geographically distinct areas. The serological survey performed with four distinct bovine herpesviruses reveal that antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 are widely distributed among cattle flocks in Rio Grande do Sul. However, it was not possible to determine type-specific prevalence with the tests performed. Thus, the proportion of cattle actually infected with either BoHV-1 or BoHV-5 (or both) in the examined region remains undetermined.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) is a major etiologic agent of meningo-encephalitis in cattle and establishes lifelong latent infection in trigeminal ganglia and also in other areas of the brain. Colonization of deep areas of the brain with latent viral DNA may have important implications on the pathogenesis of BHV-5 neurological infection upon reactivation. In this study, we investigated the distribution of BHV-5 DNA in the brain of experimentally infected rabbits a laboratory model for BHV-5 infection - prior and subsequently to virus reactivation, using a nested PCR for the glycoprotein B gene. Eighteen rabbits inoculated intranasally with a Brazilian BHV-5 isolate were divided in two groups: group A rabbits (n=8) were euthanized 60 days post-inoculation (pi) for tissue collection; group B (n=7) were submitted to dexamethasone administration at day 60pi for reactivation of latent infection and euthanized for tissue collection 60 days later. To compare, we used two groups of BHV-1-infected rabbits (C, n=3 and D, n=3), each group being submitted to one of the above treatments, respectively. In group A rabbits, viral DNA was consistently detected in trigeminal ganglia (8/8), frequently in cerebellum (6/8), anterior cortex, pons medulla (3/8) and only occasionally in thalamus (2/8), ventro-lateral, dorsal and posterior cortices, midbrain (1/8). In rabbits previously submitted to virus reactivation, viral DNA showed a broader distribution, being detected more frequently besides the TG (7/7) - in ventro-lateral (6/7) and posterior cortices (5/7), pons-medulla and thalamus (4/7) and midbrain (3/7). In contrast, rabbits inoculated with BHV-1 harbored latent viral DNA in a few tissues in addition to TG and did not show significant changes in distribution of viral DNA post-reactivation. These results demonstrate that latency by BHV-5 DNA and not BHV-1 DNA may be established in several areas of the brain of experimentally infected rabbits. Further, dexamethasone-induced virus reactivation is followed by a wider distribution of latent viral DNA, probably due to virus dissemination from the original sites. Thus, it is reasonable to speculate that reactivation of latent infection from deep areas of the brain may contribute to the recrudescence of neurological disease frequently observed upon reactivation of latent BHV-5 infection. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) é um importante agente etiológico de meningoencefalite em bovinos e estabelece infecção latente em seus hospedeiros, principalmente nos gânglios dos nervos sensoriais. No entanto, a colonização de áreas profundas do cérebro com DNA viral pode ter implicações importantes na patogenia da infecção pelo BHV-5 após a reativação da infecção latente. Neste estudo, foi investigada a distribuição do DNA do BHV-5 no cérebro de coelhos infectados experimentalmente, antes e após a reativação da infecção latente, utilizando um nested-PCR para uma seqüência do gene da glicoproteína B. Dezoito coelhos infectados pela via intranasal com um isolado brasileiro de BHV-5 foram divididos em dois grupos: coelhos do grupo A (n=8) foram submetidos a eutanásia 60 dias pós inoculação (pi) para a coleta de tecidos; animais do grupo B (n=7) foram submetidos a administração de dexametasona no dia 60 pi. Para comparação foram utilizados dois grupos de coelhos inoculados com o BHV-1 (C, n=3 e D, n=3), cada grupo sendo submetido a um dos tratamentos acima, respectivamente. Nos animais do grupo A, o DNA viral foi consistentemente detectado no gânglio trigêmeo (8/8), freqüentemente no cerebelo (6/8), com menor freqüência na ponte e córtex anterior (3/8) e ocasionalmente no tálamo (2/8) e córtices ventro-lateral, dorso-lateral e posterior, pedúnculo cerebral e tálamo (1/8). Nos animais previamente submetidos à reativação, a distribuição do DNA viral foi mais ampla, sendo detectado mais consistentemente, além do TG (7/7), nos córtices ventro-lateral (6/7), e posterior (5/7), ponte e tálamo (4/7) e menos freqüentemente no pedúnculo cerebral (3/7). Em contrapartida, os animais inoculados com o BHV-1 apresentaram o DNA viral latente em poucos tecidos além do TG, e não apresentaram alterações importantes na distribuição do DNA viral após a reativação. Esses resultados demonstraram que o DNA latente do BHV-5 - e não o do BHV-1 - pode estar presente em várias áreas do cérebro de coelhos infectados experimentalmente. A reativação induzida por dexametasona resulta na reativação viral e provavelmente na colonização de áreas adicionais no cérebro. Com base nesses resultados pode-se especular que a reativação do DNA viral latente nestas regiões pode contribuir para a recrudescência de doença neurológica observada após a reativação da infecção latente pelo BHV-5.