Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A matriz energética mundial é baseada em fontes fósseis e renováveis. No Brasil, o bioetanol é gerado principalmente a partir da cana-de-açúcar. Resíduos agroindustriais (fontes celulósicas ou amiláceas) despontam como biomassas alternativas à cana-de-açúcar, para aumentar a competitividade deste combustível renovável frente aos de origem fóssil e também favorecer a sustentabilidade e a segurança alimentar e energética, pois são ricos em polissacarídeos não diretamente fermentescíveis, abundantes (problema ambiental) e apresentam baixo valor comercial. O farelo de mandioca é um exemplo de resíduo sólido gerado na produção de fécula (amido) e farinha de mandioca que ainda contém, em média, 75% de amido. Consequentemente, deve ser previamente hidrolisado e posteriormente fermentado por leveduras do gênero Saccharomyces para gerar etanol. O objetivo deste estudo foi produzir bioetanol a partir de hidrolisados enzimáticos de farelo de mandioca, usando levedura álcool resistente (AR). Primeiramente, a concentração de açúcares obtida a partir da hidrólise enzimática foi verificada através de um planejamento fatorial completo (24), com triplicata no ponto central, a fim de investigar a influência dos seguintes fatores na hidrólise: concentração de α-amilase (Termamyl 2X), tempo de liquefação, concentração de glucoamilase (AMG 300L) e o tempo sacarificação. A condição de hidrólise mais favorável foi a do ensaio com 0,517 mL de AMG/g amido, 0,270 mL de Termamyl/g amido, 1h de tempo de liquefação e 2h de tempo de sacarificação. O caldo resultante da condição escolhida alcançou altas concentrações de glicose (160 g/L). Os ensaios de fermentação alcoólica foram realizados em duplicata em biorreator de 3L, em regime de batelada, a 30C, 100 rpm e pH 5,5. Cerca de 3 g/L (massa seca) de uma linhagem de levedura álcool tolerante, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, crescida por 12h em meio YEDP (2% de glicose) foram usados como inóculo. O mosto consistiu de um litro de hidrolisado (160 g/L de glicose) fortificado com extrato de levedura (1%) e peptona de carne (1%), além da adição de um antiespumante (Tween 80) na concentração de 0,05% (m/v). Em 30 horas de fermentação, a média da concentração de etanol obtida foi de 65 g/L. A eficiência foi de 87,6% e o rendimento e a produtividade foram 0,448 e 2,16 g/L.h, respectivamente. Os resultados indicaram a aplicabilidade do farelo de mandioca como matéria-prima para a produção de bioetanol / The world energy matrix is based on fossil and renewable sources. In Brazil, bioethanol is generated mainly from sugarcane. Agro-industrial wastes (cellulosic or starchy sources) emerge as an alternative to sugarcane biomass, in order to increase this renewable fuel competitiveness against fossil ones, and also promote sustainability, food security and energy security, because they are rich in polysaccharides (not directly fermentable), abundant (environmental problem), and have low commercial value. The cassava bagasse is an example of a solid waste originated from starch and cassava flour industries, which still contains on average 75% of starch. Consequently, it should be hydrolyzed and then fermented by Saccharomyces yeasts in order to generate ethanol. This study aimed to produce bioethanol from enzymatic hydrolysate of cassava bagasse, using alcohol resistant (AR) yeast. At first, the concentration of sugars obtained from enzymatic hydrolysis was verified using a full factorial design (24) with triplicate at the center point to investigate the influence of α-amylase concentration (Termamyl 2X), liquefaction time, glucoamylase concentration (AMG 300L), and saccharification time. The best condition of hydrolysis was 0,270 mL of Termamyl/g starch, 1h of liquefaction, 0,517 mL of AMG/g starch, and 2h of saccharification. The resultant syrup of the chosen condition achieves high levels of glucose (160 g/L). Alcoholic fermentation assays were performed in duplicate in a 3L bioreactor under batch regime at 30C, 100 rpm and pH 5.5. About 3 g/L (dry weight) of an alcohol tolerant yeast strain, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, grown for 12 h in YEDP medium (2% glucose), were used as inoculum. The fermentation broth consisted of one liter of hydrolysate (160 g/L of glucose) supplemented with yeast extract (1%) and meat peptone (1%), plus the addition of an antifoam (Tween 80) in a concentration of 0.05% (w/v). At 30 hours of fermentation, the average ethanol concentration obtained was 65 g/L. The efficiency was 87.6% and the yield and the productivity were, respectively, 0.448 and 2.16 g/L.h. The results indicated the applicability of cassava bagasse as raw material for bioethanol production

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-14T19:04:53Z No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T14:24:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T14:24:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T14:24:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / This study addressed the use of solid residues from the process of cellulosic ethanol production using the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse for the production of cellulose nanocrystals (CNCs). Bagasse submitted to two types of pretreatments (steam explosion - SESB and hydrothermal - HSB) was hydrolyzed with two different enzymatic loads using a commercial enzymatic extract. The solid residues generated after the hydrolysis were purified with NaOH 5% (w/w) at 55 °C and H2O2 35% (v/v) followed by an acid hydrolysis at 45 °C with H2SO4 60% (w/w) and extraction of 30 min in order to obtain the CNCs. The samples of SESB and HSB presented cellulose contents of 61 and 54%, respectively. The conversion in the enzymatic hydrolysis step ranged from 25 to 55% for SESB and 33 to 59% for HSB, along with the increase of enzymatic loading. And besides the release of glucose into the liquid phase, it was also generated solid residues with significant quantity of cellulose to be used for CNCs production. Due to decreasing of the cellulose crystallinity indexes (CI%) of the residual solid, a purification procedure was necessary, which raised the CI by about 30% for SESB residues and approximately 25% for HSB residues. The resulting CNCs presented proper physical and chemical characteristics, such as degradation temperature exceeding 230°C and crystallinity around 79% for both matrices. The CNCs obtained feature of needle with length between 193 and 246 nm and diameter of between 17 and 30 nm. These results indicate that CNCs produced from the residual streams of enzymatic route of cellulosic ethanol production from the sugarcane bagasse have the characteristics suitable for this type of product. Therefore, the use of these solids residues for new materials production, such as NCCs for use in different applications proved to be potentially promising for adding value to the bioenergy sector. / O presente estudo avaliou o emprego dos resíduos sólidos do processo de produção de etanol celulósico a partir da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de nanocristais de celulose (NCCs). Bagaço submetido a dois tipos de pré-tratamentos (explosão a vapor - BEX e hidrotérmico - BH) foi hidrolisado com duas diferentes cargas enzimáticas utilizando um extrato enzimático comercial. Os resíduos sólidos gerados após a hidrólise foram purificados com NaOH 5% (m/m) a 55oC e H2O2 35% (v/v) seguido de uma hidrólise ácida a 45oC com H2SO4 60% (m/m) e extração de 30 min, visando a obtenção dos NCCs. As amostras de BEX e BH apresentaram teores de 61 e 54% de celulose, respectivamente. A conversão na etapa de hidrólise enzimática variou de 25 a 55% para o BEX e de 33 a 59% para o BH, com o aumento da carga enzimática. Assim, além da liberação da glicose para a fase líquida, na etapa de hidrólise enzimática foi gerado um resíduo sólido com quantidade significativa de celulose para os processos subsequentes de obtenção de NCCs. Devido à diminuição dos índices de cristalinidade da celulose (IC%) dos sólidos residuais, foi necessário um procedimento de purificação que elevou o IC% em aproximadamente 30% para os resíduos do BEX e aproximadamente 25% para os resíduos do BH. A partir disso, os NCCs apresentaram características físico-químicas adequadas, como temperatura de degradação superior a 230°C e cristalinidade próxima de 79% para ambas as matrizes. Os NCCs obtidos apresentaram formato de agulha com comprimento entre 193 e 246 nm e diâmetro entre 17 e 30 nm. Esses resultados indicam que os NCCs produzidos a partir das correntes residuais da rota enzimática de produção de etanol celulósico a partir do bagaço de cana-de-açúcar possuem as características adequadas para esse tipo de produto. Portanto, a utilização desses resíduos sólidos para a produção de novos materiais, tais como os NCCs para aplicações em diversos setores industriais, mostrou-se potencialmente promissora para a agregação de valor ao setor de bioenergia.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA172.pdf: 630395 bytes, checksum: f43d3e3e988e19b889727b435ec35757 (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this study was to evaluate the use of soluble and insoluble fractions of protein hydrolysates of different waste sardines (Clupeidae), on the performance of juvenile catfish. We tested two types of muscle hydrolyzate, soluble fraction and insoluble assessed individually (WSF and FIM) and combined with each other (WSF + END), and two types of viscera hydrolyzed soluble fraction of natural guts and industrialized (FSVN FSVI E) . The experimental design was completely randomized with five treatments (type hydrolyzate) and five repetitions. The juveniles are kept in tanks of 30 liters with densidadel 8 fish per tank, to which were cultured for 56 days. The results were analyzed using parametric variance analysis (ANOVA) and subjected to the Duncan test (5% significance). The final best results, weight gain, feed conversion and protein efficiency ratio were obtained with the diet containing a combination of soluble and insoluble fractions of the hydrolyzate muscle, and the diet containing the soluble fraction of the hydrolyzate of industrial offal. A diet containing hydrolyzed soluble industrial viscera was also the most consumed by the animals. A diet containing hydrolyzed insoluble muscle was the one that gave the worst results consumption. The worst feed conversion was obtained for the diet containing the soluble hydrolyzed muscle. Survival, body composition and ammonia excretion did not differ between treatments. The best performance results are obtained using crude hydrolysates which combine the benefits of both fractions. The degree of hydrolysis has a direct effect on feed intake. Furthermore, it was shown that soluble hydrolysates can be used at high levels of inclusion, from which nutrients are adequately balanced diets / O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização das frações solúveis e insolúveis de hidrolisados proteicos de diferentes resíduos de sardinha (Sardinella sp.), sobre o desempenho de juvenis de jundiá. Foram testados dois tipos de hidrolisado de músculo, fração solúvel e insolúvel avaliadas individualmente (FSM e FIM) e combinadas entre si (FSM+FIM), e dois tipos de hidrolisado de vísceras, fração solúvel de vísceras natural e industrializada (FSVN E FSVI). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cinco tratamentos (tipos de hidrolisado) e cinco repetições. Os juvenis foram mantidos em aquários de 30 litros, com densidade de 8 peixes por aquário, ao qual foram cultivados por 56 dias. Os resultados foram analisados por meio de Análise de Variância Paramétrica (ANOVA), e submetidos ao teste de Duncan (5% de significância). Os melhores resultados de peso final, ganho de peso, conversão alimentar e taxa de eficiência proteica foram obtidas com a dieta contendo a combinação das frações solúveis e insolúveis do hidrolisado de músculo, e com a dieta contendo a fração solúvel do hidrolisado de vísceras industrial. A dieta contendo hidrolisado solúvel de vísceras industrial também foi a mais consumida pelos animais. A dieta contendo o hidrolisado insolúvel de músculo foi a que proporcionou os piores resultados de consumo. A pior conversão alimentar foi obtida para a dieta contendo o hidrolisado solúvel de músculo. A sobrevivência, a composição corporal e a excreção de amônia não diferiram entre os tratamentos. Os melhores resultados de desempenho são obtidos com hidrolisados brutos que combinam os benefícios das duas frações. O grau de hidrólise tem efeito direto sobre o consumo de ração. Além disso, foi demonstrado que os hidrolisados solúveis podem ser utilizados em níveis elevados de inclusão, desde que os nutrientes das dietas sejam adequadamente balanceados

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The study of the enzymatic hydrolysis of the lactose has been of great importance, due to absence or lack of the enzyme present lactase in the process digestive human. The enzyme β-galactosidase is very used in the processing of milk products by being of low cost and enough studied all over the world. The use of this enzyme in the dairy products prevents the crystallization of the products and it provides to the intolerant people the lactose better life quality. The objective of this work was accomplish a comparative study of the hydrolysis of the cheese whey usig two different maufactures β-galactosidase Prozyn and Lactozym, respectively, Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces fragilis, of origin of yeasts. The tests of hydrolysis of the cheese whey were accomplished in a reactor with agitation control and temperature. The cheese whey concentration was of 60 g/L, temperatures of 43, 45 and 48°C, concentration of the enzyme of 4 g/L, pH 6,0 and 6,5 and agitation 300 rpm. Both enzymes obteined better result to 45 °C, however the enzyme Prozyn converts the lactose in smaller time. An analysis was accomplished to verify the concentration of total sugar of the cheese whey, 75%, to evaluate the hydrolysis, obtaining the glucose concentration in function of the time for each studied condition. The influence of the lactose concentration was verified in the enzyne, using lactose solution in erlenmeyer. The enzymatic activity was growing of the concentration 10 g/L up to 120 g/. The enzyatic stability in relation to the pH presented better result pH 6,5 for both enzymes Prozyn and Lactozym. The thermal stability of the free enzyme was certain for the time of half life. The enzyme Prozyn to temperature of 50°C it presented time of life 4,62 min and to 55°C was 2,77 min and enzyme Lactozym to the 50°C was 6,32 min and to 45°C was 115,52 min. In the determination of the enzymatic activity the method of the initial rates of the reaction of hydrolysis of the cheese whey was used. The obteined enzymatic activity was 75,03.10-3 mol/(genzyme.h) and 44,6.10-3 mol/(genzyme.h) for Prozyn and Lactozym, respectively. / O estudo da hidrólise enzimática da lactose tem sido de grande importância, devido a ausência ou carência da enzima lactase presente no processo digestivo humano. A enzima β-galactosidase é a mais utilizada no processamento de produtos lácteos por ser de baixo custo, eficiente e bastante estudada em todo o mundo. A utilização desta enzima nos laticínios previne a cristalização da lactose dos produtos e proporciona às pessoas intolerantes a lactose melhor qualidade de vida. O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo comparativo da hidrólise da lactose presente no soro de queijo, utilizando β- galactosidase originária das leveduras Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces fragilis adquiridas da Prozyn e Lactozym. Os ensaios de hidrólise do soro de queijo foram realizados em um reator com controle de agitação e temperatura. A concentração de soro foi de 60 g/L, temperaturas de 43, 45, 48 e 53°C, concentração da enzima de 4 g/L, pH 6,0 e 6,5 e agitação 300 e sem agitação mecânica. Ambas as enzimas forneceram melhor resultado à 45 °C, no entanto, a enzima Prozyn converte a lactose em menor tempo. O teor de lactose presente no soro de queijo com concentração 60 g/L foi de 75%. A concentração de glicose em função do tempo determinou a duração da hidrólise, onde a lactose foi quebrada pela enzima e resultou na formação de glicose e galactose em quantidade equimolar. Verificou-se a influência da concentração de lactose na enzima, utilizando solução de lactose na faixa de 10 a 120 g/L em solução tampão láctico pH 6,5 e temperatura 30°C. A atividade enzimática foi crescente da concentração 20 g/L até 100 g/L. A estabilidade enzimática em relação ao pH apresentou melhor resultado em pH 6,0 para a Prozyn e pH 6,5 para a Lactozym. A estabilidade térmica da enzima livre foi determinada pelo tempo de meia vida. A enzima Prozyn à 50°C, apresentou tempo de meia vida de 4,62 min e à 55°C, 2,77 min e a enzima Lactozym à 50°C, 6,30 min e à 45°C, 115,52 min. Na determinação da atividade enzimática utilizou-se o método das taxas iniciais da reação de hidrólise do soro. A atividade enzimática obtida foi 75,03.10-3 mol/(genz..h) e 44,6.10-3 mol/(genz..h) para Prozyn e Lactozym, respectivamente. / Mestre em Engenharia Química

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A matriz energética mundial é baseada em fontes fósseis e renováveis. No Brasil, o bioetanol é gerado principalmente a partir da cana-de-açúcar. Resíduos agroindustriais (fontes celulósicas ou amiláceas) despontam como biomassas alternativas à cana-de-açúcar, para aumentar a competitividade deste combustível renovável frente aos de origem fóssil e também favorecer a sustentabilidade e a segurança alimentar e energética, pois são ricos em polissacarídeos não diretamente fermentescíveis, abundantes (problema ambiental) e apresentam baixo valor comercial. O farelo de mandioca é um exemplo de resíduo sólido gerado na produção de fécula (amido) e farinha de mandioca que ainda contém, em média, 75% de amido. Consequentemente, deve ser previamente hidrolisado e posteriormente fermentado por leveduras do gênero Saccharomyces para gerar etanol. O objetivo deste estudo foi produzir bioetanol a partir de hidrolisados enzimáticos de farelo de mandioca, usando levedura álcool resistente (AR). Primeiramente, a concentração de açúcares obtida a partir da hidrólise enzimática foi verificada através de um planejamento fatorial completo (24), com triplicata no ponto central, a fim de investigar a influência dos seguintes fatores na hidrólise: concentração de α-amilase (Termamyl 2X), tempo de liquefação, concentração de glucoamilase (AMG 300L) e o tempo sacarificação. A condição de hidrólise mais favorável foi a do ensaio com 0,517 mL de AMG/g amido, 0,270 mL de Termamyl/g amido, 1h de tempo de liquefação e 2h de tempo de sacarificação. O caldo resultante da condição escolhida alcançou altas concentrações de glicose (160 g/L). Os ensaios de fermentação alcoólica foram realizados em duplicata em biorreator de 3L, em regime de batelada, a 30C, 100 rpm e pH 5,5. Cerca de 3 g/L (massa seca) de uma linhagem de levedura álcool tolerante, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, crescida por 12h em meio YEDP (2% de glicose) foram usados como inóculo. O mosto consistiu de um litro de hidrolisado (160 g/L de glicose) fortificado com extrato de levedura (1%) e peptona de carne (1%), além da adição de um antiespumante (Tween 80) na concentração de 0,05% (m/v). Em 30 horas de fermentação, a média da concentração de etanol obtida foi de 65 g/L. A eficiência foi de 87,6% e o rendimento e a produtividade foram 0,448 e 2,16 g/L.h, respectivamente. Os resultados indicaram a aplicabilidade do farelo de mandioca como matéria-prima para a produção de bioetanol / The world energy matrix is based on fossil and renewable sources. In Brazil, bioethanol is generated mainly from sugarcane. Agro-industrial wastes (cellulosic or starchy sources) emerge as an alternative to sugarcane biomass, in order to increase this renewable fuel competitiveness against fossil ones, and also promote sustainability, food security and energy security, because they are rich in polysaccharides (not directly fermentable), abundant (environmental problem), and have low commercial value. The cassava bagasse is an example of a solid waste originated from starch and cassava flour industries, which still contains on average 75% of starch. Consequently, it should be hydrolyzed and then fermented by Saccharomyces yeasts in order to generate ethanol. This study aimed to produce bioethanol from enzymatic hydrolysate of cassava bagasse, using alcohol resistant (AR) yeast. At first, the concentration of sugars obtained from enzymatic hydrolysis was verified using a full factorial design (24) with triplicate at the center point to investigate the influence of α-amylase concentration (Termamyl 2X), liquefaction time, glucoamylase concentration (AMG 300L), and saccharification time. The best condition of hydrolysis was 0,270 mL of Termamyl/g starch, 1h of liquefaction, 0,517 mL of AMG/g starch, and 2h of saccharification. The resultant syrup of the chosen condition achieves high levels of glucose (160 g/L). Alcoholic fermentation assays were performed in duplicate in a 3L bioreactor under batch regime at 30C, 100 rpm and pH 5.5. About 3 g/L (dry weight) of an alcohol tolerant yeast strain, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, grown for 12 h in YEDP medium (2% glucose), were used as inoculum. The fermentation broth consisted of one liter of hydrolysate (160 g/L of glucose) supplemented with yeast extract (1%) and meat peptone (1%), plus the addition of an antifoam (Tween 80) in a concentration of 0.05% (w/v). At 30 hours of fermentation, the average ethanol concentration obtained was 65 g/L. The efficiency was 87.6% and the yield and the productivity were, respectively, 0.448 and 2.16 g/L.h. The results indicated the applicability of cassava bagasse as raw material for bioethanol production

Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI. / Trichoderma harzianum is a fungus that has a considerable potential in biomass hydrolysis application due to its elevated cellulolytic activity. Cellulases from Trichoderma reesei have been widely used as model in studies of cellulose breakdown. However, cellulases from Trichoderma harzianum are less-studied enzymes which have not been characterized biophysically and biochemically as yet. CBHI, a cellobiohydrolase I, is the major cellulolytic enzyme produced by Trichoderma sp. and is currently one of the most investigated cellulases for biofuel applications. CBHI hydrolyzes crystalline cellulose to soluble cellobiose units, which turns it into a key enzyme for producing fermentable sugars from biomass. The aim of this work was to purify and characterize the CBHI of Trichoderma harzianum (ThCBHI). We established an efficient purification protocol of ThCBHI, from the homologous expression. The biochemical characterization of ThCBHI showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa, a pI of 5,23, and the optimum pH and temperature for its activity are 5,0 and 50 ºC, respectively. The effect of pH and temperature on secondary and tertiary structure and enzymatic activity of ThCBHI were analyzed by CD and Fluorescence spectroscopy and showed that they affect protein stability by two distinct mechanisms. Variations of pH modify protonation of the residues, affecting directly its activity, leading to structural destabilization only at extreme pH values, such as pH 9, 0. On the other hand, temperature has direct influence on mobility, fold and compactness of the folding enzyme, at temperatures above 60 ºC, there is loss of secondary and tertiary structure. When the assays were conducted in the presence of the cellobiose, a competitive inhibitor, thermal stability of ThCBHI was significantly increased to 61,5 to 65,9 ºC. Structural studies and molecular dynamics simulations showed that the flexibility of Tyr260, in comparison to the Tyr247 from the homologous T. reesei CBHI, is enhanced due to the short side chains of adjacent Val216 and Ala384 residues and creates an additional gap at the side face of the catalytic tunnel. In addition, CBHI of T. harzianum has a shortened loop at the entrance of the cellulose-binding tunnel, which has been described to interact with the substrate in T. reesei CBHI. These structural features might explain why T. harzianum enzyme displays higher kcat value and lower product inhibition on both glucosides and lactosides substrates in comparison to T. reesei CBHI.

A busca por novas tecnologias que visam à produção de biocombustíveis renováveis, especialmente bioetanol e outros biomateriais, tem se intensificado nos últimos anos. Há um interesse mundial crescente na limitação dos impactos ambientais e mudanças climáticas através da substituição de produtos petroquímicos por análogos ambientalmente corretos, a fim de alcançar uma economia mais sustentável. Além disso, as plataformas biorrefinarias lignocelulósicas necessárias para a produção de bioetanol representam uma oportunidade de estimular novos mercados para o setor agrícola e aumentar os empregos locais, contribuindo para o desenvolvimento das economias emergentes. No entanto, a maioria dos processos de conversão são baseados no conhecimento empírico, exigindo estudos mais aprofundados sobre os fatores envolvidos na hidrólise enzimática da celulose, tais como características biomassas, a otimização da etapa de pré-tratamento, bem como das atividades das enzimas e seus mecanismos de ação. Assim, com o objetivo de contribuir para a viabilização e implantação das tecnologias de produção do etanol lignocelulósico, na primeira parte deste trabalho de doutorado, foi realizada a purificação da β-glicosidase do fungo Aspergillus Níger (NaBgl1), principal enzima do coquetel comercial Novozymes 188, e sua caracterização bioquímica e biofísica. As análises de espalhamento de raios-x a baixo ângulo revelaram uma organização multidomínios desta enzima, com uma estrutura molecular de girino semelhante ao encontrado para as celulases. A sua estrutura é composta por um domínio catalítico N-terminal e um domínio fibronectina de tipo III (FnIII) na região C-terminal, conectados entre si por um longo linker com uma inserção de 100 resíduos de aminoácidos numa conformação estendida. Apesar desta estrutura molecular incomum, os ensaios de eletroforese capilar revelaram um perfil processividade característico de β-glucosidases, e os ensaios enzimáticos confirmaram, também, a ausência de atividade em substratos poliméricos. Nos ensaios adosrção com diferentes compostos poliméricos, a enzima β-glicosidase mostrou uma capacidade de adsorção elevada em lignina. Os mecanismos de ligação FnIII-lignina foram elucidados por simulações de dinâmica molecular, que confirmaram apresença de vários sítios de ligação à lignina no domínio FnIII da enzima. Como segunda parte da presente tese, diferentes biomassas, como bagaço de cana, resíduos de casca de eucalipto e gramíneas (Panicum maximum, Pennisetum purpureum e Brachiaria brizantha) foram submetidas a vários métodos de pré-tratamento (ácido diluído, alcalino, sulfito e água quente) em diferentes condições de tratamento e avaliadas quanto ao seu potencial para a produção de bioetanol. As biomassas in natura e pré-tratadas foram caracterizadas quanto à sua composição química por métodos cromatográficos, ressonância magnética nuclear e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier; o índice de cristalinidade das amostras foi determinado por método químico e difração de raios-x; as análises morfológicas foram realizadas por microscopia eletrônica de varredura; e os resultados da caracterização foram correlacionados com os perfis de sacarificação enzimática encontrados para cada uma delas. / The search for new technologies aimed at the production of renewable biofuels, specially bioethanol, and other biomaterials has intensified in recent years. There is an increasing world-wide interest in the limitation of environmental impact and climate change by replacing petrochemical products with environment-friendly analogues in order to move towards a sustainable economy. In turn, the lignocellulosic biorefining platforms required for ethanol production present an opportunity to stimulate new markets for the agriculture sector and increase domestic employment, contributing to the development of emerging economies. However, most of conversion processes are based on empirical knowledge, demanding thorough studies about the factors involved on enzymatic hydrolysis of cellulose, such as biomasses characteristics, optimization of pretreatment steps and enzymes activities and molecular action mechanisms. Aiming to contribute for the viability and establishment of lignocellulosic ethanol technologies, on the first part of the present thesis, we performed the purification of main Aspergillus niger β-glucosidase (AnBgl1) from the commercial cocktail Novozymes 188 and its biochemical and biophysical characterization. The small angle x-ray scattering analysis revealed a multidomain organization, with a tadpole-like molecular shape similar to that found for cellulases. Its structure is composed by a N-terminal catalytic domain and a fibronectin type III-like (FnIII) C-terminal domain, connected by a long linker with a 100 aminoacids residues insertion in a extended conformation. In spite of this uncommon molecular structure, capilar zone electrophoresis assays revealed a processivity profile characteristic of β-glucosidases and the enzymatic assays confirmed no-activity on polymeric substrates. On the pull-dowm assays with different polymeric compounds, the β-glucosidase showed a high adsorption ability to lignin. The FnIII-lignin binding mechanisms were elucidated by molecular dynamics simulations, confirming the multiple binding sites to lignin in the enzyme FnIII domain. As a second part of the present thesis, different biomasses such as sugarcane bagasse, eucalyptus bark residues and grasses (Panicum maximum, Pennisetum purpureum and Brachiaria brizantha) were submitted to several pretreatment methods (diluted acid, alkaline, sulfite and hot water) at various conditions and evaluated about their potential to bioethanol production. The raw and pretreated biomasses were characterized about their chemical composition by chromatographic methods, nuclear magnetic ressonance and Fourier transformed infrared spectroscopy; the crystallinity index was determined by chemical method and x-ray diffraction; morphological features were analysed by scanning electron microscopy; and the characterization results were correlated to their enzymatic saccharification profiles.

Submitted by Raquel Vergara Gondran (raquelvergara38@yahoo.com.br) on 2016-04-27T01:06:48Z No. of bitstreams: 1 renata aline dos santos da fonseca - atividade antioxidante de peptdeos provenientes de hidrolisado proteico de bijupir rachycentron canadum.pdf: 1691827 bytes, checksum: e9a7f8b7b6d0b7f659f997831b433f42 (MD5) / Approved for entry into archive by Gilmar Barros (gilmargomesdebarros@gmail.com) on 2016-05-03T18:51:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 renata aline dos santos da fonseca - atividade antioxidante de peptdeos provenientes de hidrolisado proteico de bijupir rachycentron canadum.pdf: 1691827 bytes, checksum: e9a7f8b7b6d0b7f659f997831b433f42 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-03T18:51:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renata aline dos santos da fonseca - atividade antioxidante de peptdeos provenientes de hidrolisado proteico de bijupir rachycentron canadum.pdf: 1691827 bytes, checksum: e9a7f8b7b6d0b7f659f997831b433f42 (MD5) Previous issue date: 2014 / Algumas proteínas além das propriedades tecnológicas, funcionais e nutricionais apresentam atividade biológica, entre esta a antioxidante, associada a peptídeos bioativos liberados após hidrólise. Antioxidantes são utilizados em alimentos para retardar a peroxidação lipídica que gera compostos indesejáveis afetando a qualidade. Espécies reativas de oxigênio (ERO) presentes em organismos vivos podem danificar proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, levando ao desenvolvimento de várias doenças. Uma grande fonte de proteínas são os pescados, principalmente seus rejeitos do beneficiamento industrial, assim as proteínas do bijupirá (Rachycentron canadum), pescado de grande porte e facilmente adaptável ao cultivo em aquicultura, desponta como uma alternativa na obtenção de peptídeos com atividade antioxidante. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi obter peptídeos provenientes de hidrolisados proteicos do músculo e do resíduo do bijupirá com diferentes enzimas comerciais, ultrafiltrar em frações peptídicas, comparar o efeito antioxidante dos hidrolisados integrais e suas frações por métodos in vitro, avaliar a toxicidade e a inibição de ERO em células in vivo e aplicar os hidrolisados e frações peptídicas em sistemas alimentícios. Foram obtidos seis hidrolisados através da hidrólise do músculo e resíduo do bijupirá com Alcalase, Flavourzyme e Protamex, em que a última apresentou maior capacidade hidrolítica alcançando grau de hidrólise de 27,94% em 760 min para o músculo e 33,14% em 580 min para o resíduo. O teor de proteínas solúveis (tirosina) variou de acordo com substrato e enzima. A atividade antioxidante foi determinada através dos métodos do sequestro do DPPH, em que o músculo hidrolisado por Protamex apresentou maior efetividade (50 mg/mL) alcançando efeito sequestrante de 81,35%, seguido pelos hidrolisados de músculo e resíduo com Flavourzyme – 60,77 e 60,25%. O resíduo hidrolisado por Protamex apresentou-se como o mais promissor para o poder redutor e todos os hidrolisados apresentaram inibição da peroxidação lipídica do ácido linoleico por seis dias semelhante ou superior aos controles comerciais. A ultrafiltração forneceu frações de peptídeos maiores e menores que 3 kDa. As frações maiores que 3 kDa apresentaram maior quantidade de grupos sulfidrila, mas não foram capazes de sequestrar o DPPH, demonstraram maior potencial no poder redutor e aumentaram a inibição da peroxidação lipídica, chegando a mais de 80% frente ao branco. As frações menores que 3 kDa apresentaram capacidades menores ou semelhantes de sequestro do DPPH, poder redutor e na inibição da peroxidação do ácido linoleico quando comparados aos hidrolisados integrais. Foram selecionados os hidrolisados com Protamex (músculo e resíduo) menores que 3 kDa para avaliar seu efeito sobre células de hepatócitos de zebrafish, demonstrando não haver citotoxicidade nas concentrações estudadas (0,1 – 100 μg/mL), contudo não foram capazes de diminuir as ERO. A incorporação dos hidrolisados e suas frações em toucinho e carne bovina moída evidenciou que a maioria dos compostos reduziu o índice de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico alcançando mais de 80% frente ao branco. Portanto, através da hidrólise enzimática das proteínas do músculo e resíduo do bijupirá sob a atuação das enzimas Alcalase, Flavourzyme e Protamex foi possível obter hidrolisados e frações peptídicas antioxidantes com potencial para serem utilizados em alimentos. / Some proteins, in addition to their technological, functional and nutritional properties, present biological activity, being one of them, the antioxidant activity, associated to bioactive peptides released after the hydrolysis. The antioxidants are used in foods to slow the lipid peroxidation that generates undesirable compounds, affecting the quality. Reactive oxygen species (ROS) present in organisms can damage proteins, lipids and nucleic acids, leading to the development of various diseases. A great source of proteins is the fish, specially their industrial processing wastes. Therefore, the proteins from the cobia (Rachycentron canadum), a large fish that is easily adaptable to cultivation in aquaculture, emerges as an option to obtain peptides with antioxidant activity. Thus, the aim of this study was to obtain peptides from protein hydrolysates from the muscles and residues of cobia with different enzymes, ultrafiltrate in peptide fractions, compare the antioxidant effect between the whole hydrolysates and their peptides fractions using in vitro methods, measure the toxicity and the ROS inhibition in vivo cells and apply both hydrolysates and peptide fractions in food matrix. Six hydrolysates were obtained through the hydrolysis of the muscles and residues of the cobia with Alcalase, Flavourzyme and Protamex, wherein the last one presented greater hydrolytic capacity for the subtrates, reaching a degree of hydrolysis of 27.94% in 760 min for the muscle and 33.14% in 580 min for the residue. The content of soluble protein (tyrosine) varied depending on the substrate and the enzyme. The antioxidant activity was determined through the DPPH free radical scavenging assay, in which the muscle with Protamex showed itself more effective (50 mg/ml) reaching 81.35%, followed by the muscle and the residue with Flavourzyme – 60.77 and 60.25%. The residue, also hydrolyzed by Protamex, showed the best effect in the reducing power and, in the 6 days lipid peroxidation of the linoleic acid, in which all the hydrolysates presented the same or higher inhibition compared to the commercial controls. The ultrafiltration provided larger and smaller than 3 kDa fractions. The larger than 3 kDa fractions showed a higher amount of sulfhydryl groups, but were not capable to sequestrate the DPPH, also showed higher potential in the reducing power and increased the inhibition of the lipid peroxidation, achieving more than 80% comparing to the blank. The smaller than 3 kDa fractions results were similar or smaller in the DPPH sequestering, in the reducing power and in the lipid peroxidation of the linoleic acid when compared to the whole hydrolysates. Smaller than 3 kDa hydrolysates (muscle and residue) with Protamex were selected to measure its effect over zebrafish hepatocyte cells, demonstrating no cytotoxicity with the studied concentrations (0.1 - 100 μg/ml), however they were not capable to reduce the ROS. The incorporation of the hydrolysates and its fractions in bacon and ground beef showed that most of the composites reduced the tiobarbituric acid reactive substances index, achieving more than 80% in comparison to the blank. Therefore, through the enzymatic hydrolysis of proteins from muscles and residues of cobia, under the action of Alcalase, Flavourzyme and Protamex, it was possible to obtain antioxidant hydrolysates and peptide fractions with potential to be used in foods.

Orientadores: Rubens Maciel Filho, Aline Carvalho da Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T07:08:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomez-Rueda_SandraMarcela_M.pdf: 7950373 bytes, checksum: c7f5e37417de9cac03256c3918348b65 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Neste trabalho foi estudada a produção de açúcares fermentescíveis a partir de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com os ácidos sulfúrico (H2SO4) e fosfórico (H3PO4) diluídos e deslignificado com hidróxido de sódio (NaOH). Planejamentos fatoriais 23 foram realizados para avaliar a influência do tempo de pré-tratamento (h), temperatura (°C) e concentração de H2SO4 ou H3PO4. Depois do pré-tratamento ácido, o bagaço foi deslignificado por 1h a 100°C com 1%p/v. Os resultados mostraram que ambos pré-tratamentos podem levar a altos rendimentos de glicose na hidrólise enzimática. Os melhores resultados para o ácido fosfórico foram obtidos quando o bagaço foi pré-tratado a 140°C, 120 min e 0,5%p/v H3PO4. Após deslignificação com NaOH e hidrólise enzimática com 15 FPU/g de bagaço pré-tratado e 7,5 CBU/g de bagaço pré-tratado houve liberação de 367 mg de glicose/g bagaço sem pré-tratar, que corresponde a um rendimento de 88%. Quando o ácido sulfúrico foi usado, os melhores resultados foram obtidos para pré-tratamentos a 100°C por 15 min e com 0,5%p/v de H2SO4. Após deslignificação e hidrólise enzimática nas mesmas condições usadas para o bagaço pré-tratado com ácido fosfórico, o bagaço apresentou liberação de 380,6 mg de glicose/g bagaço sem pré-tratar, que corresponde a rendimento de 92%. Devido aos bons resultados obtidos usando ácido fosfórico sendo este pré-tratamento menos estudado do que o pré-tratamento com ácido sulfúrico, o pré-tratamento com este ácido foi escolhido para a etapa posterior. Nesta etapa foram feitos ensaios para determinar a influência das concentrações das enzimas celulase e ?-glicosidase no rendimento de glicose. O bagaço foi pré-tratado com ácido fosfórico diluído nas melhores condições determinadas, deslignificado com NaOH e hidrolisado com concentrações de celulase e ?-glicosidase variando segundo um planejamento composto central. Trabalhando-se com concentrações de celulase de 30 FPU/g e de ?-glicosidade de 25 CBU/g foi possível obter rendimento de 97,1%. Rendimento de 95,10% apenas um pouco mais baixo, foi obtido com 25,85 FPU/g de celulase e 7,33 CBU/g de ?-glicosidade / Abstract: In this work the production of fermentable sugars from sugar cane bagasse pretreated with diluted sulfuric acid and phosphoric acid and delignified with NaOH was estudied. 23 Factorial designs were performed to evaluate the influence of pretreatment time (h), temperature (°C) and acid concentration (H2SO4 or H3PO4). After pretreatment bagasse was delignified for 1 hour at 100 ° C with 1% p/v NaOH. The results have shown that both pre-treatments can lead to high glucose yields at enzymatic hydrolysis. The best results for the pretreatment with phosphoric acid was when bagasse was pretreated at 140 ° C, 120 min and 0.5% p/v H3PO4. After delignification with NaOH and enzymatic hydrolysis with 15 FPU/g of cellulase and 7,5 CBU/g of ?-glicosidase, 367 mg glucose/g untreated bagasse were released, corresponding to a 88% yield. When sulfuric acid was used, the best results were obtained for pretreatment at 100°C, for 15 min and with 0,5%p/v of H2SO4. After delignification and hydrolysis at the same conditions used in the phosporic acid pretreatment, glucose release was of 380,6 mg glucose/g non pretreated bagasse, corresponding to a 92% yield. Due to the good results obtained using phosphoric acid and because pretreatment with this acid is less studied than with sulfuric acid, it was chosen for the posterior stages of the study. In this stage experimental assays were performed to determine the influence of cellulase and ?-glucosidase loads on glucose yield at hydrolysis. Bagasse was pretreated with diluted phosphoric acid at the best conditions, delignified with NaOH and hydrolysed with cellulase and ?-glucosidase loads varying according to a central composite factorial design. Yield of 97.17% was obtained with 30 FPU/g of cellulase and 25 CBU/g of ?- glucosidase. Yield of 95.10%, only a little lower, was obtained with 25.85 FPU/g of cellulase and 7.33 CBU/g of ?-glucosidase / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Miriam Dupas Hubinger, Kil Jin Park / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kurozawa_LouiseEmy_D.pdf: 5914882 bytes, checksum: 7e1a4c293be8f9545ad96ca03041527f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo o estudo dos processos de hidrólise enzimática e secagem por spray dryer para obtenção de hidrolisado proteico de peito de frango em pó. Este foi realizado em três etapas. Na primeira fase, fez-se um estudo da cinética e a seleção da melhor condição de hidrólise enzimática de peito de frango, utilizando a enzima comercial AlcalaseÒ 2.4L. Um delineamento composto central rotacional (DCCR), totalizando 17 ensaios, foi realizado com o intuito de avaliar o efeito das variáveis: temperatura (43 a 77°C), razão enzima:substrato (0,8 a 4,2% p/p) e pH (7,16 a 8,84) na cinética de hidrólise enzimática de peito de frango e nas respostas: grau de hidrólise (GH) e recuperação de proteína (RP). A hidrólise enzimática foi otimizada de modo a obter maiores valores de GH e RP, sendo que a condição escolhida foi: 52,5°C, 4,2% p/p e pH de 8,0, na qual o hidrolisado apresentou um GH de 31% e uma RP de 91%. Na condição otimizada do processo, foi realizada a caracterização do hidrolisado proteico em termos de composição química, perfil eletroforético e composição total de aminoácidos. Na segunda etapa do projeto, foi avaliado o efeito da concentração (0 a 30%, p/p) e do tipo de agente carreador (maltodextrina 10DE e goma arábica) nas características físico-químicas, de sorção de água e na temperatura de transição vítrea Tg do hidrolisado proteico de frango em pó. Os experimentos para obtenção do produto em pó foram conduzidos em um atomizador de bancada que operou com um fluxo de ar comprimido de 0,6 m3/h, vazão volumétrica do ar de secagem de 19 m3/h, temperatura do ar de 180°C e vazão mássica na alimentação de 0,2 kg/h. A adição de diferentes agentes carreadores e em diferentes concentrações resultou em produtos com características distintas quanto à umidade, densidade, tamanho de partícula e morfologia. A Tg do hidrolisado proteico em pó aumentou com a concentração de agente carreador, melhorando a estabilidade do produto. Na etapa final, a influência das condições operacionais do spray dryer sobre o desempenho do equipamento e sobre as propriedades físico-químicas e a atividade antioxidante do produto em pó foi avaliada através de um delineamento composto central rotacional. As variáveis independentes foram temperatura do ar de entrada (120 a 200°C) e vazão mássica da alimentação (0,1 a 0,38 kg/h). O desempenho operacional do spray dryer foi avaliado através do rendimento, temperatura do ar de saída, eficiência térmica do processo e produtividade, obtidos através de um balanço de massa e de energia no secador. As propriedades físico-químicas do produto em pó foram caracterizadas quanto à umidade, teor de proteína, diâmetro médio das partículas, densidade volumétrica e morfologia / Abstract: The present work had as aim to study the processes of enzymatic hydrolysis and spray drying to obtain a protein hydrolysate of chicken breast meat powder. This work was divided into three sections. In the first part, enzymatic kinetics and selection of the best condition of enzymatic hydrolysis, using the commercial enzyme AlcalaseÒ 2.4L, were evaluated. A central composite rotatable design (CCRD) with three variables was used to estimate the influence of the independent variables: temperature (43 to 77°C), enzyme: substrate ratio (0.8 to 4.2% w/w) and pH (7.16 to 8.84) on the kinetics reaction and on the responses: degree of hydrolysis (DH) and protein recovery (PR). Using response surface methodology, the enzymatic hydrolysis was optimized to obtain the maximum DH and PR. The optimum conditions determined were the following: 52.5°C, 4.2% (w/w) enzyme:substrate ratio and a pH value of 8.0. Under these conditions a degree of hydrolysis of 31% and protein recovery of 91% were obtained. A characterization of the protein hydrolysate obtained using the optimized process conditions was carried out, evaluating the chemical composition, electrophoretic profile and amino acid composition. In the second part of this work, the effect of concentration (0 to 30% w/w) and type of carrier agent (maltodextrin 10DE and gum Arabic) on the physico-chemical properties, water sorption and glass transition temperature of spray dried chicken breast protein hydrolysate. The spray drying process was performed using a laboratory spray dryer. The equipment was operated with air compressed volumetric flow rate of 0.6 m3/h, air volumetric flow rate of 19 m3/h, inlet air temperature of 180°C and feed flow rate of 0.2 kg/h. The following properties: moisture content, bulk density, particle distribution and mean diameter; and the morphology, were affected by the addition of maltodextrin or gum Arabic. With respect to powder stability, the glass transition temperature increased with increasing carrier agent concentration. And the last part of the work, the influence of operational conditions of spray dryer on the equipment performance, physico-chemical properties and antioxidant activity of spray dried protein hydrolysate was evaluated by a central composite rotatable design. The independent variables were inlet air temperature (120 to 200°C) and feed flow rate (0.1 to 0.38 Tkg/h). The spray dryer performance was analyzed by process yield, outlet air temperature, thermal efficiency and dryer productivity, obtained by mass and heat transfer. The physicochemical properties of powders were characterized in respect to moisture and protein content, particle distribution and mean diameter, bulk density and morphology / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutor em Engenharia de Alimentos