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Caractérisation d'aptamères par électrophorèse capillaire couplée au séquençage haut-débit Illumina / Characterization of aptamers by capillary electrophoresis coupled to the hight throughput sequencing Illumina

Ric, Audrey Marie Amélie 29 September 2017 (has links)
Les aptamères sont des oligomères d'ADN ou d'ARN simple brin qui, en se repliant sous forme de structures tridimensionnelles peuvent avoir des interactions fortes et spécifiques envers un certain nombre de cibles. L'objectif de cette thèse a été de compléter les études existantes sur l'utilisation de l'électrophorèse capillaire (CE) et les aptamères afin de mettre au point une méthode de sélection d'aptamères par CE couplée à la fluorescence induite par laser et le séquençage haut-débit Illumina. Dans un premier temps, nous avons mis au point une méthode de détection et de séparation par électrophorèse capillaire couplée à la double détection UV-LEDIF d'une banque d'ADN en interaction avec une cible : la thrombine. C'est un modèle déjà étudié pour lequel deux aptamères ont fait l'objet de publications. Nous avons utilisé l'aptamère T29 dans le cadre de notre étude car c'est celui qui présente la meilleure affinité. L'électrophorèse capillaire est un puissant outil analytique qui facilite l'efficacité de sélection des aptamères et précise la détermination des paramètres d'interactions. Nous avons ainsi pu déterminer la constante d'affinité KD par CE-UV-LEDIF sur le modèle de base : la thrombine. Par ailleurs, nous montrons également comment l'utilisation du tampon Tris peut dégrader un ADN simple brin en électrophorèse capillaire et nous proposons comme alternative l'utilisation d'un tampon sodium phosphate dibasique qui évite ce phénomène de dégradation. Enfin, nous expliquons la difficulté d'amplification par qPCR et PCR d'un aptamère comme le T29 ayant une structure en G-quadruplex. Nous avons montré que le séquençage haut-débit Illumina nous a permis de trouver une corrélation entre le nombre de molécules séquencées et le nombre de séquences obtenues. L'analyse des séquences obtenues montre une quantité importante (20%) de séquences de T29 qui ne correspondent pas à la séquence de cet aptamère. Cela prouve que les étapes de PCR et de séquençage haut débit pour la détection de G-quadruplex peuvent induire un biais dans l'identification de ces molécules. / Aptamers are oligomers of small single-stranded DNA or RNA which can have strong and specific interactions with some targets when they fold into three-dimensional structures. The objective of this thesis was to complete existing studies on the use of capillary electrophoresis in order to develop a method for the selection of aptamers by CE coupled to laser induced fluorescence and Illumina high-throughput sequencing. In a first step, we developed a method of detection and separation by capillary electrophoresis coupled with the double detection UV-LEDIF of a DNA library interacting with a target: thrombin. It is a model already studied and for which two aptamers have been published. We used aptamer T29 as part of our study because it has the best affinity. Capillary Electrophoresis is a powerful analytical tool that facilitates the selection efficiency of aptamers and specifies the determination of the interaction parameters. We thus were able to determine the affinity constant KD by CE-UV-LEDIF on the basic model: thrombin. Moreover, we also show how the use of Tris buffer can degrade single-stranded DNA during capillary electrophoresis and we propose as an alternative the use of a dibasic sodium phosphate buffer which avoids the phenomenon of degradation. Finally, we explain the difficulty of amplification by qPCR and PCR of an aptamer such as T29 with a G-quadruplex structure. We showed that the Illumina high-throughput sequencing allowed us to find a correlation between the number of sequenced molecules and the number of sequences obtained. Analysis of the sequences obtained shows a significant amount (20%) of T29 sequences which do not correspond to the sequence of this aptamer. This shows that the PCR and high-throughput sequencing steps for the detection of G-quadruplex can induce bias in the identification of these molecules.
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Solutions d'amélioration des études de métagénomique ciblée / Solutions to improve targeted metagenomics studies

Siegwald, Léa 23 March 2017 (has links)
La métagénomique ciblée, étude de la composition et de la diversité des communautés microbiennes présentes dans différents échantillon biologiques sur la base d'un marqueur génomique, a connu un véritable essor lors de cette dernière décennie grâce à l'arrivée du séquençage haut-débit. Faisant appel à des outils de biologie moléculaire et de bioinformatique, elle a été à l’origine de substantiels progrès dans les domaines de l’évolution et de la diversité microbienne. Cependant, de nouvelles problématiques sont apparues avec le séquençage haut-débit : la génération exponentielle de données soulève des problèmes d'analyse bioinformatique, qui doit être adaptée aux plans d'expérience et aux questions biologiques associées. Cette thèse propose des solutions d'amélioration des études de métagénomique ciblée par le développement d'outils et de méthodes innovantes, apportant une meilleure compréhension des biais d'analyse inhérents à de telles études, et une meilleure conception des plans d'expérience. Tout d'abord, une expertise du pipeline d'analyse utilisé en production sur la plate-forme PEGASE-biosciences a été menée. Cette évaluation a révélé la nécessité de mettre en place une méthode d'évaluation formelle de pipelines d'analyses de données de métagénomique ciblée, qui a été développée sur la base de données simulées et réelles, et de métriques d'évaluation adaptées. Cette méthode a été utilisée sur plusieurs pipelines d'analyse couramment utilisés par la communauté, tout comme sur de nouvelles approches d'analyse jamais utilisées dans un tel contexte. Cette évaluation a permis de mieux comprendre les biais du plan d'expérience qui peuvent affecter les résultats et les conclusions biologiques associées. Un de ces biais majeurs est le choix des amorces d'amplification de la cible ; un logiciel de design d'amorces adaptées au plan d'expérience a été spécifiquement développé pour minimiser ce biais. Enfin, des recommandations de montage de plan d'expérience et d'analyse ont été émises afin d'améliorer la robustesse des études de métagénomique ciblée. / Targeted metagenomics is the study of the composition of microbial communities in diverse biological samples, based on the sequencing of a genomic locus. This application has boomed over the last decade thanks to the democratisation of high-throughput sequencing, and has allowed substantial progress in the study of microbial evolution and diversity. However, new problems have emerged with high-throughput sequencing : the exponential generation of data must be properly analyzed with bioinformatics tools fitted to the experimental designs and associated biological questions. This dissertation provides solutions to improve targeted metagenomics studies, by the development of new tools and methods allowing a better understanding of analytical biases, and a better design of experiments. Firstly, an expert assessment of the analytical pipeline used on the PEGASE-biosciences plateform has been performed. This assessment revealed the need of a formal evaluation method of analytical pipelines used for targeted metagenomics analyses. This method has been developed with simulated and real datasets, and adequate evaluation metrics. It has been used on several analytical pipelines commonly used by the scientific community, as well as on new analytical methods which have never been used in such a context before. This evaluation allowed to better understand experimental design biases, which can affect the results and biological conclusions. One of those major biases is the design of amplification primers to target the genomic locus of interest. A primer design software, adaptable to different experimental designs, has been specifically developed to minimize this bias. Finally, analytical guidelines and experimental design recommendations have been formulated to improve targeted metagenomics studies.

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