Fish and crayfish are widely used as biological monitors of environmental levels of anthropogenic pollutants. The present thesis is a contribution to the assessment of the toxicity and effects of long-term effect of triazines on the different developmental stages of common carp (Cyprinus carpio L.) and adult red swamp crayfish (Procambarus clarkii). The carp was selected as a model fish due to its economic importance, e.g. carp farming contributes about 90% to total fish production in the Czech Republic. Crayfish are easily identified species representing given locality, they are widespread, and they provide a sufficient amount of tissue for individual biochemical and chemical analyses. The results of these studies provide further data on chronic exposure to triazines for consideration in risk assessment. We selected three active substances of triazine herbicides which are the most frequently detected in surface waters such as prometryne, simazine and terbutryn. The findings contribute to knowledge of the toxic potential of triazine herbicides to carp and crayfish at environmentally relevant concentrations in Czech rivers. There is a scarcity of information regarding the toxicity of triazines on freshwater organisms. During the tests we monitored several parameters: behaviour, mortality, biometric, haematological, biochemical blood, histopathology, oxidative stress and antioxidants. The data obtained from all tests performed during my thesis are very valuable for assessment and evaluation of long-term effects xenobiotics on aquatic organisms, especially fish and crayfish. In the future, I would extend the focus of my research for study of possible synergic or amplifying effect of mixtures triazines with other xenobiotics which are often found in the aquatic environment. This approach is recently accented as the aquatic environment is polluted by mixtures of different compounds. Therefore, more research is needed in order to clarify the more detailed effects of xenobiotics on non-target aquatic organisms.

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Les développements continus en micro-spectroscopie vibrationnelle IR et en analyse numérique de données multidimensionnelles ont permis récemment l'émergence de l'histologie spectrale. A l'échelle tissulaire et sur une base biomoléculaire, cette nouvelle approche représente un outil prometteur pour une meilleure analyse et caractérisation de différents états physiopathologiques, et potentiellement une aide au diagnostic clinique. Dans ce travail, en utilisant un modèle tissulaire de côlon normal chez la Souris et chez l’Homme, nous avons apporté des améliorations à la chaîne de traitements des données afin d'automatiser et d'optimiser cette histologie spectrale.En effet, dans un premier temps, le développement d’une double application hiérarchique d'indices de validité a permis de déterminer le nombre optimal de classes nécessaire à une caractérisation complète des structures histologiques. Dans un second temps, cette méthode a été généralisée à l'échelle interindividuelle par couplage d'un prétraitement par EMSC (Extended Multiplicative Signal Correction) et d'une classification non-supervisée k-Means; ce couplage étant appliqué conjointement à toutes les images spectrales IR. Enfin, compte tenu de l'essor des métaheuristiques et de leur capacité à résoudre des problèmes complexes d'optimisation numérique, nous avons transposé un algorithme mémétique aux données spectrales IR. Ce nouvel algorithme se compose d'un algorithme génétique et d'un raffinement par classification non-supervisée k-Means. Comparé aux méthodes classiques de clustering, cet algorithme mémétique appliqué aux images spectrales IR, a permis de réaliser une classification non-supervisée optimale et indépendante de l'initialisation. / Recent developments in IR vibrational microspectroscopy and numerical multidimensional analysis have led to the emergence of spectral histology. At the tissue level, this new approach represents an attractive tool for a better analysis and characterization of pathophysiological states and for diagnostic challenges. Here, using normal murine and human colon tissues, data processing steps have been improved for automating and optimizing this spectral histology. First, the development of a hierarchical double application of validity indices permitted to determine the optimal number of clusters that correctly identified the different colon histological components. Second, this method has been improved to perform spectral histology at the inter-individual level. For this, EMSC (Extended Multiplicative Signal Correction) preprocessing has been successfully combined to k-Means clustering. Finally, given the ability of metaheuristics to solve complex optimization problems, a memetic algorithm has been developed for IR spectral data clustering. This algorithm is composed of a genetic algorithm and a k-Means clustering refinement. Compared with conventional clustering methods, our memetic algorithm allowed to generate an optimal and initialization-independent clustering.

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Dans notre étude, la biosurveillance de la lagune de Tunis a été réalisée durant une année enemployant une approche combinant les analyses chimiques et biologiques et en utilisant lapalourde Ruditapes decussatus comme espèce bioindicatrice. Cette approche a permis demettre en évidence la forte contamination de la lagune de Tunis par les métaux traces et leshydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs). La variation saisonnière des niveaux debioaccumulation de ces contaminant par la palourde s’avère être fortement associée auxchangements des paramètres physico-chimiques du milieu et aux processus physiologiques del’animal. L’étude de la réponse biologique basée sur l’utilisation d’une batterie debiomarqueurs d’exposition et d’effet situés à différents niveaux de l’organisation biologique :moléculaire (l’expression de cinq gènes d’intérêt), biochimique (les activités benzo(a)pyrènehydroxylase, glutathion S-transférase, acétylcholinestérase, catalase et taux demalondialdéhyde) et tissulaire (altérations histopathologiques), a permis de mettre enévidence une modulation des processus de défense contre les perturbations induites par lapollution et l’identification des altérations histopathologiques (structurales) au niveau desbranchies et de la glande digestive impliquant un impact sévère des contaminants sur l’état desanté de la palourde. L’étude des interactions spatio-temporelles entre les facteurs abiotiqueset biotiques a permis d’identifier la température et la reproduction comme paramètresprincipaux affectant la réponse biochimique de défense et d’effet. L’analyse en composanteprincipale (ACP), regroupant tous les paramètres analysés pendant le printemps, nous apermis d’identifié le site Z2 comme le site le plus affecté par la pollution. Dans un secondtemps, le benzo(a)pyrène (BaP), déjà identifié dans la lagune de Tunis, a été employé dansdes conditions contrôlées au laboratoire afin de caractériser les réponses moléculaires etbiochimiques chez les bivalves (Ruditapes philippinarum et Crassostrea gigas) face à desexpositions subaiguës et aiguës à ce contaminant. Cette étude nous a permis d’identifier unemodulation des biomarqueurs biochimiques de métabolisation, de stress oxydant et deneurotoxicité et de l’expression des gènes impliqués dans les processus de métabolisation, derespiration mitochondriale, de défense antioxydante, de reproduction et de défenseimmunitaire. L’analyse de l’altération de l’ADN a révélé un pouvoir génotoxique précoce etélevé du BaP chez les deux bivalves. / Firstly, biomonitoring of Tunis lagoon was conducted during one year using an approach combining chemicals and biological analyses and the bioindicator species Ruditapesdecussatus. This approach high lighted the high contamination of the Tunis lagoon by tracemetals and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Seasonal variation of contaminant bioaccumulation levels in clam was found to be strongly associated with physico chemical changes in surrounding environment and physiological processes in organism. Biological responses investigated through a battery of exposure and effect biomarkers located at differentlevels of biological organisation: molecular (expression of five genes), biochemical(benzo(a)pyrene hydroxylase, glutathione S-transferase, acetylcholinesterase and catalase activities and malondialdehyde concentration) and tissular (histopathological damages),demonstrated a defense process modulation by pollution and showed histopathological alterations in gills and digestive gland involving severe impact of contaminants on health stateof clam. The study of spatio temporal interactions between abiotic and biotic factors identified temperature and reproduction as main parameters affecting defense and effect biochemical response. The principal component analysis (PCA), using all analyzed parameters during thespring, allowed to identify site Z2 as the most affected by pollution. Secondly,benzo(a)pyrene (BaP), already identified in Tunis lagoon, was used in controlled conditions at the laboratory in order to characterize the molecular and biochemical responses in bivalves(Ruditapes philippinarum and Crassostrea gigas) facing a subacute and acute exposures tothis contaminant. This study showed a modulation of biochemical biomarkers of metabolism,oxidative stress and neurotoxicity and expression of genes involved in process of metabolisation, mitochondrial respiration, antioxidant defense, reproduction and immune defense. The analysis of DNA damages revealed a high and early genotoxicity effect of BaPin both bivalves.

L’étude des effets des radionucléides et des métaux sur les organismes vivants est nécessaire pour évaluer leur toxicité et leur risque écologique. Notre approche a visé dans un premier temps à étudier les impacts du cadmium (Cd) et de l’Uranium (U) sur différents niveaux biologiques de l’écrevisse Procambarus clarkii après exposition aigue et chronique. Nous avons évalué leurs impacts sur les mitochondries, les réponses face à un stress oxydant, les structures histologiques et la survie. Nous avons tenté de lier ces effets entre eux et à la bioaccumulation dans les branchies et l’hépatopancréas. Nous avons aussi essayé de différencier la chimio- et la radiotoxicité de l’U en exposant des écrevisses soit à l’U appauvri soit au 233U (présentant une activité spécifique plus élevée) au travers des mêmes critères d’effets. Nous avons démontré que le gène mt codant pour la métallothionéine était toujours surexprimé en présence du Cd. De ce fait, il semble être un bon biomarqueur de toxicité du Cd chez P. clarkii. Nous avons mis en évidence que les deux métaux affectent les mitochondries grâce au suivi des niveaux d’expressions des gènes mitochondriaux (12s, atp6 et cox1), et que leur mécanismes d’action ne semblent pas être toujours les mêmes. Nous avons aussi prouvé que l’U génère plus de stress oxydant que le Cd grâce à la comparaison des niveaux d’expressions de gènes qui codent pour des antioxidants (sod(Mn) et mt) et des réponses enzymatiques de la superoxyde dismutase, la catalase, la glutathion peroxydase et la glutathion S transférase. Toutefois, les symptômes des atteintes histo-pathologiques semblent être les mêmes pour les deux métaux. En comparant leurs effets sur la survie des écrevisses, nous avons conclu que le Cd était plus toxique que le radioélément. D’autre part, nous avons démontré que les effets toxiques de l’U aux concentrations rencontrées dans l’environnement, sont plus liés à la chimiotoxicité qu’à la radiotoxicité de cet élément. Nous avons démontré que, les réponses moléculaires varient en fonction de l’intensité et la durée du stress chimique imposé aux organismes. Nous avons proposé d’utiliser les expressions de l’ensemble des gènes étudiés en tant que biomarqueurs de toxicité de l’U plutôt que les activités enzymatiques à cause de leur sensibilité. Ce travail de thèse propose des mécanismes d’actions de l’U basé surtout sur les réponses moléculaires et confirme la nécessité d’approfondir l’étude du profil écotoxicologique de ce radioélément. / The study of the effects of radionuclides and metals on organisms is necessary for the evaluation of their toxicity and their ecological threats. We first aimed to study the impacts of cadmium (Cd) and Uranium (U) on different biological levels of the crayfish Procambarus clarkii after acute and chronic exposures. We evaluated their impacts on mitochondria, oxidative stress responses, on histological structures, and the survival rates. We tried to connect these effects between them and to the bioaccumulation in the gills and the hepatopancreas. We also tried to discriminate the chemo and the radiotoxicity of U by exposing crayfish to either depleted or enriched U (233U: presenting a higher specific activity) using the same criteria of effects. We demonstrated that the gene mt encoding for the metallothionein was always over-expressed in the presence of Cd. Therefore, it seems to be a good biomarker of Cd toxicity in P. clarkii. The follow up of mitochondrial genes expressions (12s, atp6 and cox1), showed that both metals affect mitochondria and that their mechanisms of action do not seem to be always the same. We also observed that U generates more oxidative stress than Cd when comparing the expression levels of genes encoding for antioxidants (sod (Mn) and mt) and the enzymatic activities of superoxide dismutase, the catalase, the glutathione peroxidase and the glutathione S transferase. However, the symptoms of histo-pathological damages after Cd and U contamination were similar in both conditions. After comparing the survival rates of the crayfish, we concluded that Cd was more toxic than the radioelement. Moreover, we demonstrated that the toxic effect of U on P. clarkii exposed to a low environmental concentration is mainly due to its chemotoxicity rather than to its radiotoxicity. We established that, the molecular answers vary according to the intensity and the duration of the chemical stress applied to the organisms. We suggested the use of the expressions of all the studied genes as biomarkers of toxicity of U rather than the enzymatic activities because of their sensitivity. This work proposes mechanisms of actions of U based especially on the molecular responses and confirms the necessity of studying the ecotoxicological profile of this radioelement.

La fibrillation atriale (FA) est l'arythmie cardiaque soutenue la plus fréquente chez les adultes. Elle est associée à une augmentation du risque d'accident vasculaire cérébral, d'insuffisance cardiaque et de la mortalité. Un mécanisme de torsades auriculaires a été décrit chez des patients atteints du syndrome du QT long congénital (SQTL). Malgré une littérature très riche sur le sujet, les mécanismes impliqués dans la genèse et le maintien de ces arythmies restent mal connus et constituent un obstacle dans le diagnostic et la prise en charge de ces maladies. Dans la première partie de ce travail, nous avons abordé l'histologie et la distribution des connexines (Cxs) chez deux groupes de patients avec et sans FA par une approche de microscopie confocale. Nous avons ainsi décrit d'une part un réseau entre fibroblastes et myocytes communiquant via les Cx 40 et 43 et d'autre part la présence de myofibroblastes, d'une forte fibrose et d'un remodelage des Cx 40 et 43 dans le tissu de patients FA. Par ailleurs, pour identifier de nouvelles mutations impliquées dans ces arythmies, nous avons étudié une cohorte de 60 patients atteints de FA. Les recherches génétiques et l'étude fonctionnelle nous ont permis d'associer 5 nouvelles mutations: P41S et M207V (PITX2), G277E (Cx 40) A253V (Cx 43) et P1034H (KCNH2) à la FA. Celles-ci semblent jouer un rôle clé dans la constitution du substrat arythmogène. Enfin, dans la dernière partie, nous avons exploré l'impact électrophysiologique d'un variant de KCNH2, R148W, trouvé tout d'abord chez un enfant décédé de mort subite pendant le sommeil, puis chez plusieurs membres de la famille, dont certains présentent un intervalle QT allongé. Ce variant, exprimé dans les ovocytes de Xénope et étudié en voltage-clamp, réduit le courant de 29% et pourrait alors prédisposer à la survenue de torsades de pointes et expliquer en partie l'allongement du QTc. Outre les nouveaux variants géniques découverts, ce travail est le premier à associer un gain de fonction du facteur de croissance PITX2c en relation avec la FA. Le remodelage histologique des Cx et les variants nucléotidiques touchant les gènes GJA1, GJA5, PITX2 et KCNH2 pourraient ainsi participer à l'étiologie de la FA et du QT long / Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained arrhythmia in adults. It is associated with an increased risk of stroke, heart failure and mortality. A mechanism of atrial torsades has been described in patients with congenital long QT syndrome (LQTS). Despite the already existing body of literature, the mechanisms involved in the genesis and maintenance of these arrhythmias remain poorly understood and constitute an obstacle in diagnosis and management of these diseases. In the first part of this work, we discussed the histology of connexins (Cxs) and their distribution in two groups of patients (with and without FA), by confocal microscopy approach. We have described a network of fibroblasts and myocytes communicating across Cx 40 and 43 and the presence of myofibroblasts, of a strong fibrosis and of a remodeling of Cx 40 and 43 distribution in the tissue of AF patients. In addition, to identify new mutations involved in these arrhythmias, we studied a cohort of 60 patients with AF. Genetic investigations and functional study enabled us to associate five novel mutations with AF: M207V and P41S (PITX2), G277E (Cx 40) A253V (Cx 43) and P1034H (KCNH2). These mutations likely play a key role in the formation of the arrhythmogenic substrate. Finally, we explored the electrophysiological impact of a KCNH2 variant, R148W, initially found in a child who died suddenly during sleep and subsequently disclosed in several family members, some with a long QT interval. When expressed in Xenopus oocytes and studied in voltage-clamp, this variant reduces the current by 29%, which might predispose to torsades de pointes and partly explain the QTc prolongation. In addition to these newly discovered gene variants, this work is the first to report a gain-of-function mutation of the transcription factor PITX2c in AF. Histological remodeling of Cxs and the nucleotide variants affecting GJA1, GJA5, PITX2 and KCNH2 might thus participate in the etiology of AF and LQTS

Coffea arabica var. Laurina (Bourbon pointu, BP) est un mutant naturel de C. arabica ‘Bourbon’ (B). La mutation laurina est récessive, monolocus, Mendélienne et ses effets pléiotropiques. Ces effets ont été étudiés sur le développement des graines et chez les plantules en histologie, morphologie et biochimie. La standardisation de la croissance en taille des graines était primordiale, notamment pour l'étude fine de la composition en polysaccharides pariétaux (PP). Les stades (st) de développement ont été reliés à l'âge des fruits et leur aspect histo-morphologique (st 1-2, 3, 4 : croissance ; st 5 à 7 : maturation). L'étude de la composition en PP a mis en évidence trois phases : φ 1 (st 1-2, 3), φ 2 (st 3, 4, première partie du 5), et φ 3 (deuxième partie du 5, st 6 et 7). La mutation affecte les φ 1 et 2, probablement par le biais du périsperme. Chez la plantule, la mutation affecte la longueur des hypocotyles exposés à la lumière en provoquant le semi-nanisme de BP par rapport à B par un nombre moindre de cellules. Les teneurs en ABA, auxine et cytokinines sont aussi touchées. La composition en PP et en acides chlorogéniques (CQA) n'est affectée ni par la mutation, ni par la lumière pendant la croissance des plantules (sauf pour les CQA ses racines). Un effet-organe est mis en évidence. La mutation réduit la teneur en caféine (CAF) et la différence variétale est présente à la lumière et à l'obscurité. Ces résultats permettent de mieux caractériser les effets pléiotropiques de la mutation laurina. Ils permettent une meilleure 1/ compréhension de l'évolution des PP de la graine au cours de son développement et 2/ connaissance des hormones, CAF, CQA et PP des plantules. / Coffea arabica var Laurina (Bourbon pointu, BP), is a natural mutant of C. arabica ‘Bourbon’ (B). The laurina mutation is recessive, monolocus and Mendelian, with pleiotropic effects. This work highlighted new effects of this mutation, with histological, morphological and biochemical approaches on seeds development and on seedlings. Simultaneous fitting of growth curves of B and BP and their standardization allow comparisons of these varieties and fine study of polysaccharide cell wall (PCW) composition over time. Thus, anatomic specificities, development stages (st) and fruit age were linked (growth: st 1-2 to 4; maturation: st 5 to 7). When taking in account the CWP evolution in time-course, three phases occurred: φ 1 (st 1-2, 3), φ 2 (st 3, 4 and the beginning of 5), and φ 3 (the end of 5, st 6, 7). The two first were affected by the mutation probably through maternal effect (perisperm). In seedlings, the hypocotyls semi-dwarfism in light growth condition is an effect of the mutation and was due to a lower cell number than in B. The phytohormones content was also affected (ABA, auxine, cytokinins). But, neither CWP composition nor chlorogenics acids (CQA) content were affected by the mutation, or growth condition (expected for CQA content in roots). The composition in CWP and CQA was different depending on organs. Finally, caffeine (CAF) content was affected by the mutation in light or darkness conditions. These results represent an important step in 1/ the characterization of the pleiotropic effects of the laurina mutation, 2/ the understanding of the CWP evolution in seed time course, and 3/ new knowledge on seedlings (hormone, CAF, CQA and CWP composition).

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To investigate and assess bone regeneration in sheep in combination with new implant materials classical histological staining methods as well as immunohistochemistry may provide additional information to standard radiographs or computer tomography. Available published data of bone defect regenerations in sheep often present none or sparely labeled histological images. Repeatedly, the exact location of the sample remains unclear, detail enlargements are missing and the labeling of different tissues or cells is absent. The aim of this article is to present an overview of sample preparation, staining methods and their benefits as well as a detailed histological description of bone regeneration in the sheep tibia. General histological staining methods like hematoxylin and eosin, Masson-Goldner trichrome, Movat’s pentachrome and alcian blue were used to define new bone formation within a sheep tibia critical size defect containing a polycaprolactone-co-lactide (PCL) scaffold implanted for 3 months (n = 4). Special attention was drawn to describe the bone healing patterns down to cell level. Additionally one histological quantification method and immunohistochemical staining methods are described.