Carcinomatose péritonéale est un terme utilisé pour désigner la dissémination métastatique généralisée du cancer dans la cavité péritonéale. Il se caractérise par l’accumulation de liquide appelé « ascite » et est considéré comme étant au stade terminal du cancer, car il est difficile à traiter. L'ascite accumulée dans la PC comprend des cellules tumorales, cytokines et cellules immunitaires. Les cellules cancéreuses expriment des protéines spécifiques qui les aident à supprimer les cellules immunitaires et à survivre, appelées points de contrôle immunitaires. Des points de contrôle immunitaires sont présents pour réguler le système immunitaire et sont cruciaux contre la tolérance de soi. PD-1 / PD-L1 et CTLA-4 sont des voies de contrôle immunitaire bien établies adaptées au cancer pour échapper à l'immunité. Récemment, HLA-G a été reconnu comme un point de contrôle et il a été constaté que la survie globale était diminuée dans plusieurs types de cancers solides.Au cours de ma thèse, nous avons évalué l'expression de HLA-G dans la carcinomatose ovarienne. Nous avons constaté que les cellules cancéreuses dans l'ascite de presque tous les patients atteints de carcinomatose ovarienne exprimaient HLA-G. De plus, des taux croissants de sHLA-G1 et de HLA-G5 ont été trouvés dans les ascites. Cette présence de sHLA-G s'est révélée être corrélée positivement avec les Tregs et en corrélation négative avec les cellules T cytotoxiques (CD8) et les cellules NK. De plus, nous avons constaté que les ascites peuvent induire l’expression de HLA-G dans des «Hospicells» via des cytokines inflammatoires. Parmi les cytokines inflammatoires, le TGF-β et IL-1β ont une importance capitale dans l’induction de HLA-G. En outre, nous avons constaté que IL-1β implique la voie NF-κB. Dans une cohorte distincte de carcinomatose péritonéale, composée de patients atteints de PC d'origine différente, nous avons constaté que le groupe de cellules cancéreuses dans l'ascite avait une expression génique hétérogène de PD-L1, CTLA-4 et HLA- G. En outre, nous avons constaté que tous les patients présentaient des taux solubles de HLA-G et PD-L1 dans leur ascite. Cependant, seulement 5 patients présentaient des taux de CTLA-4 solubles dans leur ascite. De plus, nous avons trouvé une très forte corrélation positive entre le niveau de gène de PD-L1 et de CTLA-4, alors qu'aucune corrélation n'a été trouvée pour HLA-G avec PD-11 et CTLA-4 suggérant que HLA-G agit indépendamment des deux points de contrôle immunitaires. En outre, nous avons évalué l'expression de ces points de contrôle immunitaires par des nodules de cancer présents sur la membrane péritonéale. Nous avons trouvé une faible expression de HLA-G et PD-L1, mais la moitié des échantillons étaient fortement positifs pour sHLA-G. Nous avons également constaté que le sHLA-G pouvait être absorbé par l'ascite par la couche mésothéliale. Cette sHLA-G absorbée peut fournir un environnement immunosuppresseur pour la fixation des grappes de cellules cancéreuses à la membrane péritonéale. In vitro, nous avons constaté que l'ascite peut exercer une action immunosuppressive et retarder la lyse des cellules cancéreuses par les cellules immunitaires.De plus, nous avons constaté que la différenciation des cellules cancéreuses se traduit par une augmentation des propriétés immunosuppressives par une expression accrue de HLA-G ou PD-L1. En outre, l'expression de HLA-G et PD-L1 dépend de la phase du cycle cellulaire. Les cellules cancéreuses, si elles sont bloquées dans les cellules mitotiques, expriment des niveaux élevés de HLA-G et de PD-L1, tandis qu'une expression plus faible a été observée en phase G1. Par conséquent, nous suggérons d’éviter l’utilisation d’inhibiteurs de la mitose car ils pourraient augmenter la suppression immunitaire du cancer. De plus, le Ki-67 étant directement lié à l'index mitotique, nous suggérons de développer une échelle de Ki-67 pour évaluer le profil d'immunosuppresseur des patients cancéreux. / Peritoneal carcinomatosis (PC) is a term used for widespread metastatic dissemination of cancer to the peritoneal cavity. It is characterized by the accumulation of fluid called “ascites” and is considered a terminal stage of cancer, as it is hard to treat. The overall survival rate for untreated patients is six-months. However, owing to modern techniques like HIPEC, the survival rate can be increased up to five years. The ascites accumulated in PC, consists of tumor cells, cytokines and immune cells. Cancer cells express specific proteins to suppress immune cells activity and their attack, known as immune checkpoints. PD-1/PD-L1 and CTLA-4 are well established immune checkpoint pathways adapted by cancer in evading immunity. Recently, HLA-G has been recognized as an immune checkpoint and has been found to decrease overall survival in several types of solid cancers. We evaluated the expression of HLA-G in ascites from ovarian carcinomatosis. We found that HLA-G is expressed by cancer cells in ascites from all of the patients(n=16) with ovarian carcinomatosis. Moreover, increased levels of sHLA-G1 and HLA-G5 were found in ascites. This presence of sHLA-G isoforms was found to be positively correlated with Tregs and negatively correlated with cytotoxic T-cells (CD8) and NK-cells suggesting the role of HLA-G in immune suppression. Further, we found that ascites can induce the expression of HLA-G in “Hospicells” via inflammatory cytokines. Among the inflammatory cytokines, TGF-β and IL-1β are of crucial importance in HLA-G induction with IL-1β being more potent compared to TGF-β. Further, we found that IL-1β induces HLA-G expression through NF-κB pathway.In a separate cohort of peritoneal carcinomatosis(n=27), consisting of patients with cancer from a different origin, we found that cancer cell cluster in ascites (n=23) had a heterogeneous gene expression of PD-L1, CTLA-4 and HLA-G. Further, we found that all of the patients presented soluble levels of HLA-G in their ascites. However, one patient was negative for soluble PD-L1 and only 5 patients presented soluble CTLA-4 levels in their ascites. This heterogeneity explains why some of the patients respond to immune therapy while others don’t. This also suggests the need for prescreening patients before immune therapy. Moreover, we found a very strong positive correlation (rs=0.793) between gene level of PD-L1 and CTLA-4, while no correlation was found for HLA-G with PD-L1 and CTLA-4 suggesting that HLA-G acts independently of both the immune checkpoints. Also, we evaluated the expression of these immune checkpoints by cells in peritoneal tissue (n=20). We found low expression of HLA-G and PD-L1, but the majority of the samples were found strongly positive for sHLA-G presence. This sHLA-G can provide an immune-suppressive environment for the attachment of the cancer cell clusters to the peritoneal membrane to form cancer nodule. Additionally, we developed an in-vitro cytotoxicity assay to show that the ascites can provide the immune-suppressive action by interfering with immune cell interaction and delaying the lysis of cancer cells by the immune cells.In parallel, we found that the differentiation of the cancer cells results in increased expression of immune checkpoints like HLA-G or PD-L1. This may render these cells more immune resistant and can protect against immune attack. However, in-vivo mice model is needed to study the oncogenic potential of these differentiated cells. Further, we report that the expression of HLA-G and PD-L1 is dependent on the cell cycle phase. The cancer cells, if blocked in mitotic phase express high levels of HLA-G and PD-L1, while lowest expression was observed in G1-phase. Therefore, we suggest avoiding the use of mitotic inhibitors as it may increase the immune suppression of cancer. Moreover, as Ki-67 is directly related to the mitotic index, we suggest developing a Ki-67 scale to evaluate the immune-suppressive profile of cancer patients.

Introdução: O polimorfismo de inserção/deleção de 14 pb no éxon 8 do gene HLA-G é uma variante funcional com propriedades anti-inflamatórias, que tem sido associada a melhores respostas à monoterapia ou ao tratamento combinado com metrotexato (MTX) em pacientes com artrite reumatóide (AR). Objetivo: Determinar se o polimorfismo de 14 pb do gene HLA-G está associado com maior suscetibilidade à doença, com características clínicas e como fator preditivo da resposta à terapia em pacientes portadores de AR tratados com uma estratégia de tratamento intensivo com MTX. Métodos: Uma coorte prospectiva composta de 309 pacientes consecutivos foi estabelecida entre Junho de 2007 e Dezembro de 2009. Controles caucasianos saudáveis da mesma área geográfica e antecedentes étnicos foram selecionados. Um subgrupo de 188 pacientes com AR anteriormente não submetidos a decisões terapêuticas baseadas em escores de atividade da doença e sem critérios de doença em remissão pelo CDAI (>2.8) foram incluídos na análise de resposta clínica ao MTX (baseada em estratégia intensiva) e seguidos por um período de 14 meses (±5.29). Pacientes e controles foram genotipados para o polimorfismo de 14 pb por PCR com primers específicos para o éxon 8 do gene HLA-G. Uma análise multivariada foi realizada para investigar o efeito da homozigose para a deleção no polimorfismo 14bp do HLA-G sobre as mudanças no DAS28. Resultados: Entre os 309 pacientes com AR (média de idade 60.6 ±12.4 anos), não foram observadas diferenças nas freqüências alélicas em relação às características clínicas, incluindo escores de atividade e funcionais. Também não foram observadas diferenças significativas nas freqüências genotípicas e alélicas entre pacientes com AR e controles. Na análise de resposta clínica do subgrupo de 188 pacientes, medianas e médias dos escores de atividade da doença melhoraram ao final do estudo (DAS28: 5.0 vs. 4.2, p<0.001; respectivamente). A média de incremento da dose de MTX comparado ao baseline foi respectivamente 14.7 mg ±4.8 vs. 17.4 mg ± 4.7 (p<0.001). Em análise multivariada, o modelo foi significativamente associado às mudanças no DAS28 (R2ajustado=0.353; p<0.001) ou seja os fatores clínicos incluídos na análise explicaram 35% da variação do DAS28. O modelo apontou os fatores estatisticamente significativos na predição de resposta: valor do DAS28 basal (R2 semi parcial =0.261; p<0.001), gênero (R2 semi parcial = 0.034; p=0.003) e a interação entre a homozigose da deleção para 14 pb e o uso do MTX (R2semi-parcial = 0.017; p=0.031) como fatores preditivos independentes de resposta. Na análise estratificada pela presença de homozigose para a deleção ou outros genótipos, houve uma tendência para maior variação no DAS28 nos pacientes que utilizaram MTX no subgrupo -/-14-bp HLA-G (-1.4±0.3 vs. -0.4±0.5; p=0,071), o que não foi observado entre outros genótipos (-1,1 ±0,2 vs. -1,3 ±0,4; p=0,496). Conclusão: A ocorrência de homozigose para deleção de 14 pb no gene HLA-G foi independentemente associada com melhor resposta ao MTX em uma coorte prospectiva de pacientes com AR. Os achados trazem à luz um promissor marcador genético que precisa ser replicado em coortes independentes maiores. Maior número de estudos são necessários para que se possa identificar perfis genéticos capazes de selecionar individualmente os pacientes mais propensos a respostas ótimas ao MTX. / Background: 14-bp insertion/deletion in exon 8 of the HLA-G gene is a potentially functional polymorphism that has been implicated in the response to MTX monotherapy or combination in rheumatoid arthritis (RA) patients. Objectives: We sought to determine whether the 14-bp insertion/deletion polymorphism in exon 8 of the HLA-G gene is associated with susceptibility to RA, clinical features, or response to MTX therapy. Methods: We determined the HLA-G 14-bp insertion/deletion polymorphism genotypes in a prospective cohort of 309 consecutive RA patients and 294 healthy controls, and looked for associations between genotype and clinical features of RA. Multivariate analyses were performed to investigate the effect of homozygosity for the -14/-14 bp genotype on changes in DAS28 in response to MTX therapy in a subgroup of 188 RA patients. Results: Among the 309 RA patients, no correlations were observed between allele or genotype frequencies of the HLA-G gene polymorphism and clinical features, including disease activity scores and functional scores. No significant differences were observed in the genotype and allele frequencies between RA patients and controls. In the subgroup evaluated for clinical response to MTX, we observed a decrease in mean DAS28 over the course of the study. Furthermore, a better response to MTX treatment, measured by adjusted mean of DAS28 change, was observed in those patients with the HLA-G -14/-14-bp genotype, which was not observed among other genotypes. Conclusion: Homozygosity for the 14 bp deletion polymorphism within exon 8 of the HLA-G gene was associated with a better response to MTX in a prospective cohort of patients with RA. This is a promising genetic marker for predicting response to MTX therapy in RA.

A Hepatite Autoimune (HAI) é uma doença inflamatória crônica oriunda de autoimunidade, ocasionando fibrose hepática. O objetivo desse estudo foi verificar possíveis inter-relações entre HLA-G, BAMBI e processos inflamatórios/fibrogênicos hepáticos na Hepatite Autoimune, tanto em biópsias de pacientes pré quanto póstratamento com imunossupressores. Foram selecionadas noventa e cinco biópsias de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto diagnosticados com HAI, associados ou não a depósitos de ferro no fígado. As biópsias foram submetidas à imuno-histoquímica para marcação das proteínas HLAG e BAMBI. As estatísticas foram determinadas pelos testes Mann-Whitney e correlação de Spearman. A expressão de HLA-G e de BAMBI se apresentou aumentados conforme o agravamento da inflamação e fibrose em pacientes pré- tratamento com boa ou má resposta ao tratamento. No entanto, a expressão de HLAG e de BAMBI foi reduzida nas biópsias pós-tratamento apenas nos pacientes bom respondedores (diminuição da fibrose). Não houve quaisquer relações entre as quantificações de HLA-G e BAMBI com o número de plasmócitos ou com depósitos de ferro no fígado tanto em pacientes pré quanto pós-tratamento. Os resultados sugerem que tanto HLA-G quanto BAMBI são imunorreguladores sensíveis à intensidade do processo inflamatório no fígado, tendo suas expressões aumentadas ou diminuídas de acordo com a demanda por substâncias que regulem compostos e células imunológicas na HAI. Sugerem também que o infiltrado plasmocitário não é regulado diretamente pelo HLA-G ou BAMBI, e que os depósitos de ferro no fígado não são capazes de influenciar nem o grau inflamatório, nem as expressões de HLAG e BAMBI. / Autoimmune Hepatitis (HAI) is a chronic inflammatory disease originating from autoimmunity, causing liver fibrosis. The objective of this study was to verify possible interrelations between HLA-G, BAMBI and inflammatory / fibrogenic hepatic processes in Autoimmune Hepatitis, both in pre and post-treatment immunosuppressive biopsies. Ninety-five biopsies of patients from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto diagnosed with HAI, associated or not with iron deposits in the liver, were selected. Biopsies were submitted to immunohistochemistry for the labeling of HLA-G and BAMBI proteins. The statistics were determined by the Mann-Whitney tests and Spearman\'s correlation. The expression of HLA-G and BAMBI was increased as worsening of inflammation and fibrosis in pre-treatment patients with good or poor response to treatment. However, the expression of HLA-G and BAMBI was reduced in post-treatment biopsies only in patients with good responders (decreased fibrosis). There were no relationships between the quantifications of HLA-G and BAMBI with the number of plasma cells or with liver iron deposits in both pre and post-treatment patients. The results suggest that both HLA-G and BAMBI are immunoregulators sensitive to the intensity of the inflammatory process in the liver, their expressions being increased or decreased according to the demand for substances that regulate immune cells and compounds in HAI. They also suggest that plasmacytic infiltrate is not directly regulated by HLA-G or BAMBI, and that the liver iron deposits are not capable of influencing either the inflammatory grade or the expressions of HLA-G and BAMBI.

A Hepatite Autoimune (HAI) é uma doença inflamatória crônica oriunda de autoimunidade, ocasionando fibrose hepática. O objetivo desse estudo foi verificar possíveis inter-relações entre HLA-G, BAMBI e processos inflamatórios/fibrogênicos hepáticos na Hepatite Autoimune, tanto em biópsias de pacientes pré quanto póstratamento com imunossupressores. Foram selecionadas noventa e cinco biópsias de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto diagnosticados com HAI, associados ou não a depósitos de ferro no fígado. As biópsias foram submetidas à imuno-histoquímica para marcação das proteínas HLAG e BAMBI. As estatísticas foram determinadas pelos testes Mann-Whitney e correlação de Spearman. A expressão de HLA-G e de BAMBI se apresentou aumentados conforme o agravamento da inflamação e fibrose em pacientes pré- tratamento com boa ou má resposta ao tratamento. No entanto, a expressão de HLAG e de BAMBI foi reduzida nas biópsias pós-tratamento apenas nos pacientes bom respondedores (diminuição da fibrose). Não houve quaisquer relações entre as quantificações de HLA-G e BAMBI com o número de plasmócitos ou com depósitos de ferro no fígado tanto em pacientes pré quanto pós-tratamento. Os resultados sugerem que tanto HLA-G quanto BAMBI são imunorreguladores sensíveis à intensidade do processo inflamatório no fígado, tendo suas expressões aumentadas ou diminuídas de acordo com a demanda por substâncias que regulem compostos e células imunológicas na HAI. Sugerem também que o infiltrado plasmocitário não é regulado diretamente pelo HLA-G ou BAMBI, e que os depósitos de ferro no fígado não são capazes de influenciar nem o grau inflamatório, nem as expressões de HLAG e BAMBI. / Autoimmune Hepatitis (HAI) is a chronic inflammatory disease originating from autoimmunity, causing liver fibrosis. The objective of this study was to verify possible interrelations between HLA-G, BAMBI and inflammatory / fibrogenic hepatic processes in Autoimmune Hepatitis, both in pre and post-treatment immunosuppressive biopsies. Ninety-five biopsies of patients from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto diagnosed with HAI, associated or not with iron deposits in the liver, were selected. Biopsies were submitted to immunohistochemistry for the labeling of HLA-G and BAMBI proteins. The statistics were determined by the Mann-Whitney tests and Spearman\'s correlation. The expression of HLA-G and BAMBI was increased as worsening of inflammation and fibrosis in pre-treatment patients with good or poor response to treatment. However, the expression of HLA-G and BAMBI was reduced in post-treatment biopsies only in patients with good responders (decreased fibrosis). There were no relationships between the quantifications of HLA-G and BAMBI with the number of plasma cells or with liver iron deposits in both pre and post-treatment patients. The results suggest that both HLA-G and BAMBI are immunoregulators sensitive to the intensity of the inflammatory process in the liver, their expressions being increased or decreased according to the demand for substances that regulate immune cells and compounds in HAI. They also suggest that plasmacytic infiltrate is not directly regulated by HLA-G or BAMBI, and that the liver iron deposits are not capable of influencing either the inflammatory grade or the expressions of HLA-G and BAMBI.

Introdução: O polimorfismo de inserção/deleção de 14 pb no éxon 8 do gene HLA-G é uma variante funcional com propriedades anti-inflamatórias, que tem sido associada a melhores respostas à monoterapia ou ao tratamento combinado com metrotexato (MTX) em pacientes com artrite reumatóide (AR). Objetivo: Determinar se o polimorfismo de 14 pb do gene HLA-G está associado com maior suscetibilidade à doença, com características clínicas e como fator preditivo da resposta à terapia em pacientes portadores de AR tratados com uma estratégia de tratamento intensivo com MTX. Métodos: Uma coorte prospectiva composta de 309 pacientes consecutivos foi estabelecida entre Junho de 2007 e Dezembro de 2009. Controles caucasianos saudáveis da mesma área geográfica e antecedentes étnicos foram selecionados. Um subgrupo de 188 pacientes com AR anteriormente não submetidos a decisões terapêuticas baseadas em escores de atividade da doença e sem critérios de doença em remissão pelo CDAI (>2.8) foram incluídos na análise de resposta clínica ao MTX (baseada em estratégia intensiva) e seguidos por um período de 14 meses (±5.29). Pacientes e controles foram genotipados para o polimorfismo de 14 pb por PCR com primers específicos para o éxon 8 do gene HLA-G. Uma análise multivariada foi realizada para investigar o efeito da homozigose para a deleção no polimorfismo 14bp do HLA-G sobre as mudanças no DAS28. Resultados: Entre os 309 pacientes com AR (média de idade 60.6 ±12.4 anos), não foram observadas diferenças nas freqüências alélicas em relação às características clínicas, incluindo escores de atividade e funcionais. Também não foram observadas diferenças significativas nas freqüências genotípicas e alélicas entre pacientes com AR e controles. Na análise de resposta clínica do subgrupo de 188 pacientes, medianas e médias dos escores de atividade da doença melhoraram ao final do estudo (DAS28: 5.0 vs. 4.2, p<0.001; respectivamente). A média de incremento da dose de MTX comparado ao baseline foi respectivamente 14.7 mg ±4.8 vs. 17.4 mg ± 4.7 (p<0.001). Em análise multivariada, o modelo foi significativamente associado às mudanças no DAS28 (R2ajustado=0.353; p<0.001) ou seja os fatores clínicos incluídos na análise explicaram 35% da variação do DAS28. O modelo apontou os fatores estatisticamente significativos na predição de resposta: valor do DAS28 basal (R2 semi parcial =0.261; p<0.001), gênero (R2 semi parcial = 0.034; p=0.003) e a interação entre a homozigose da deleção para 14 pb e o uso do MTX (R2semi-parcial = 0.017; p=0.031) como fatores preditivos independentes de resposta. Na análise estratificada pela presença de homozigose para a deleção ou outros genótipos, houve uma tendência para maior variação no DAS28 nos pacientes que utilizaram MTX no subgrupo -/-14-bp HLA-G (-1.4±0.3 vs. -0.4±0.5; p=0,071), o que não foi observado entre outros genótipos (-1,1 ±0,2 vs. -1,3 ±0,4; p=0,496). Conclusão: A ocorrência de homozigose para deleção de 14 pb no gene HLA-G foi independentemente associada com melhor resposta ao MTX em uma coorte prospectiva de pacientes com AR. Os achados trazem à luz um promissor marcador genético que precisa ser replicado em coortes independentes maiores. Maior número de estudos são necessários para que se possa identificar perfis genéticos capazes de selecionar individualmente os pacientes mais propensos a respostas ótimas ao MTX. / Background: 14-bp insertion/deletion in exon 8 of the HLA-G gene is a potentially functional polymorphism that has been implicated in the response to MTX monotherapy or combination in rheumatoid arthritis (RA) patients. Objectives: We sought to determine whether the 14-bp insertion/deletion polymorphism in exon 8 of the HLA-G gene is associated with susceptibility to RA, clinical features, or response to MTX therapy. Methods: We determined the HLA-G 14-bp insertion/deletion polymorphism genotypes in a prospective cohort of 309 consecutive RA patients and 294 healthy controls, and looked for associations between genotype and clinical features of RA. Multivariate analyses were performed to investigate the effect of homozygosity for the -14/-14 bp genotype on changes in DAS28 in response to MTX therapy in a subgroup of 188 RA patients. Results: Among the 309 RA patients, no correlations were observed between allele or genotype frequencies of the HLA-G gene polymorphism and clinical features, including disease activity scores and functional scores. No significant differences were observed in the genotype and allele frequencies between RA patients and controls. In the subgroup evaluated for clinical response to MTX, we observed a decrease in mean DAS28 over the course of the study. Furthermore, a better response to MTX treatment, measured by adjusted mean of DAS28 change, was observed in those patients with the HLA-G -14/-14-bp genotype, which was not observed among other genotypes. Conclusion: Homozygosity for the 14 bp deletion polymorphism within exon 8 of the HLA-G gene was associated with a better response to MTX in a prospective cohort of patients with RA. This is a promising genetic marker for predicting response to MTX therapy in RA.

Introdução: O polimorfismo de inserção/deleção de 14 pb no éxon 8 do gene HLA-G é uma variante funcional com propriedades anti-inflamatórias, que tem sido associada a melhores respostas à monoterapia ou ao tratamento combinado com metrotexato (MTX) em pacientes com artrite reumatóide (AR). Objetivo: Determinar se o polimorfismo de 14 pb do gene HLA-G está associado com maior suscetibilidade à doença, com características clínicas e como fator preditivo da resposta à terapia em pacientes portadores de AR tratados com uma estratégia de tratamento intensivo com MTX. Métodos: Uma coorte prospectiva composta de 309 pacientes consecutivos foi estabelecida entre Junho de 2007 e Dezembro de 2009. Controles caucasianos saudáveis da mesma área geográfica e antecedentes étnicos foram selecionados. Um subgrupo de 188 pacientes com AR anteriormente não submetidos a decisões terapêuticas baseadas em escores de atividade da doença e sem critérios de doença em remissão pelo CDAI (>2.8) foram incluídos na análise de resposta clínica ao MTX (baseada em estratégia intensiva) e seguidos por um período de 14 meses (±5.29). Pacientes e controles foram genotipados para o polimorfismo de 14 pb por PCR com primers específicos para o éxon 8 do gene HLA-G. Uma análise multivariada foi realizada para investigar o efeito da homozigose para a deleção no polimorfismo 14bp do HLA-G sobre as mudanças no DAS28. Resultados: Entre os 309 pacientes com AR (média de idade 60.6 ±12.4 anos), não foram observadas diferenças nas freqüências alélicas em relação às características clínicas, incluindo escores de atividade e funcionais. Também não foram observadas diferenças significativas nas freqüências genotípicas e alélicas entre pacientes com AR e controles. Na análise de resposta clínica do subgrupo de 188 pacientes, medianas e médias dos escores de atividade da doença melhoraram ao final do estudo (DAS28: 5.0 vs. 4.2, p<0.001; respectivamente). A média de incremento da dose de MTX comparado ao baseline foi respectivamente 14.7 mg ±4.8 vs. 17.4 mg ± 4.7 (p<0.001). Em análise multivariada, o modelo foi significativamente associado às mudanças no DAS28 (R2ajustado=0.353; p<0.001) ou seja os fatores clínicos incluídos na análise explicaram 35% da variação do DAS28. O modelo apontou os fatores estatisticamente significativos na predição de resposta: valor do DAS28 basal (R2 semi parcial =0.261; p<0.001), gênero (R2 semi parcial = 0.034; p=0.003) e a interação entre a homozigose da deleção para 14 pb e o uso do MTX (R2semi-parcial = 0.017; p=0.031) como fatores preditivos independentes de resposta. Na análise estratificada pela presença de homozigose para a deleção ou outros genótipos, houve uma tendência para maior variação no DAS28 nos pacientes que utilizaram MTX no subgrupo -/-14-bp HLA-G (-1.4±0.3 vs. -0.4±0.5; p=0,071), o que não foi observado entre outros genótipos (-1,1 ±0,2 vs. -1,3 ±0,4; p=0,496). Conclusão: A ocorrência de homozigose para deleção de 14 pb no gene HLA-G foi independentemente associada com melhor resposta ao MTX em uma coorte prospectiva de pacientes com AR. Os achados trazem à luz um promissor marcador genético que precisa ser replicado em coortes independentes maiores. Maior número de estudos são necessários para que se possa identificar perfis genéticos capazes de selecionar individualmente os pacientes mais propensos a respostas ótimas ao MTX. / Background: 14-bp insertion/deletion in exon 8 of the HLA-G gene is a potentially functional polymorphism that has been implicated in the response to MTX monotherapy or combination in rheumatoid arthritis (RA) patients. Objectives: We sought to determine whether the 14-bp insertion/deletion polymorphism in exon 8 of the HLA-G gene is associated with susceptibility to RA, clinical features, or response to MTX therapy. Methods: We determined the HLA-G 14-bp insertion/deletion polymorphism genotypes in a prospective cohort of 309 consecutive RA patients and 294 healthy controls, and looked for associations between genotype and clinical features of RA. Multivariate analyses were performed to investigate the effect of homozygosity for the -14/-14 bp genotype on changes in DAS28 in response to MTX therapy in a subgroup of 188 RA patients. Results: Among the 309 RA patients, no correlations were observed between allele or genotype frequencies of the HLA-G gene polymorphism and clinical features, including disease activity scores and functional scores. No significant differences were observed in the genotype and allele frequencies between RA patients and controls. In the subgroup evaluated for clinical response to MTX, we observed a decrease in mean DAS28 over the course of the study. Furthermore, a better response to MTX treatment, measured by adjusted mean of DAS28 change, was observed in those patients with the HLA-G -14/-14-bp genotype, which was not observed among other genotypes. Conclusion: Homozygosity for the 14 bp deletion polymorphism within exon 8 of the HLA-G gene was associated with a better response to MTX in a prospective cohort of patients with RA. This is a promising genetic marker for predicting response to MTX therapy in RA.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CAROLINE STEGLICH RAMOS.pdf: 1233030 bytes, checksum: 0c294f9932ce70c185a878b013b4d356 (MD5) Previous issue date: 2012-02-07 / The breast cancer constitutes most common malignancy pathology among women where the knowledge of prognostic aspects suggest the clinical course of disease and patient survival. Detection of HLA-G has been described as prognostic factor for many cancers, this molecule, expresses in ectopic way in certain types of tumors, where induce the immunotolerance and, favors the tumoral immune escape. Thereby, this study aimed to evaluate the expression of the molecule HLA-G in infiltrating ductal breast carcinomas (CDI), as well as evaluate the polyphormism of the gene encoding HLA-G to determine possible correlation between these and the molecule expression. Thus, to meet these objectives, we evaluated the expression of HLA-G protein in forty-five patients with IDC by immunohistochemistry and also the insertion and deletion polymorphism of 14pb gene HLA-G in 80 samples of paraffin tumors, obtained from the Service of Anatomic Pathology at Araújo Jorge Hospital, and a group of 191 healthy people was used as control. All the statistical analyses were made using the programs GraphPad Instat version 5.01 and Genepop version 2.0. Our results showed that the group of patients were inbalance in Hardy-Weinberg (p=0,01), due to the excess of heterozygotes (p=0,0007), there is not statistically significant difference in the allelic frequencies in locus HLA-G, when compared the group of patients with the control group, however, there were difference in the genotypics frequencies when comparing the same groups (p=0,012), being the genotypic frequency deletion/insertion significantly higher in the group of patients. Also, the expression of HLA-G was observed in 62% of the samples analyzed by immunohistochemistry and this expression was observed an mostly in tumor cells and also by intra-tumoral inflammatory infiltrate (p=0,03). The analysis showed that the expression of HLA-G was significantly higher in patients that had shorter survival (log rank = 0,03), after 5 years of follow up and still there was also a correlation between the expression of HLA-G and increased incidence of lymph node metastases (p=0,01). Thus, the results suggest that the HLA-G expression in patients with CDI may be associate to poor clinical evolution, with the reduced survival. / O câncer de mama constitui-se na patologia maligna mais comum entre as mulheres onde o conhecimento dos aspectos prognósticos sugerem o curso clínico da doença e a sobrevida dos pacientes. A detecção da molécula HLA-G tem sido descrita como fator prognóstico para inúmeras neoplasias, esta molécula, expressa de maneira ectópica em certos tipos de tumores, onde induz a imunotolerância e favorece o escape imunológico tumoral. Desse modo, esse estudo objetivou avaliar a expressão da molécula HLA-G em carcinomas ductais infiltrantes da mama (CDI), bem como, avaliar polimorfismo do gene codificador de HLA-G para determinar possível correlação entre estes e a expressão da molécula. Assim, para cumprir tais objetivos, avaliou-se a expressão da proteína HLA-G em quarenta e cinco pacientes com CDI por imunoistoquímica, e ainda, o polimorfismo de deleção e inserção de 14pb do gene HLAG, em 80 amostras de tumores parafinados, obtidas junto ao Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Araújo Jorge e um grupo composto por 191 indivíduos saudáveis foi utilizado como controle. Todas as análises estatísticas foram feitas utilizando os programas GraphPad Instat versão 5.01 e Genepop versão 2.0. Os resultados mostraram que o grupo de pacientes encontrava-se em desequilíbrio de Hardy-Weinberg (p= 0,01), devido ao excesso de heterozigotos (p= 0,0007), não havendo diferença estatisticamente significante nas freqüências alélicas no loco HLA-G quando comparado o grupo de pacientes com o grupo controle, no entanto, houve diferença nas freqüências genotípicas ao comparar os mesmos grupos (p= 0,012), sendo a freqüência do genótipo deleção/inserção significantemente maior no grupo de pacientes. Também foi observada a expressão de HLA-G em 62% das amostras totais analisadas por imunoistoquímica e essa expressão foi apresentada principalmente, em células tumorais havendo, no entanto, também expressão pelas células do infiltrado inflamatório intratumoral (p= 0,03). As analises mostram que a expressão de HLA-G foi significantemente maior em pacientes que tiveram menor sobrevida (log rank= 0,03), após 5 anos de seguimento clínico e ainda houve correlação entre a expressão de HLA-G e aumento naincidência de metástases em linfonodos (p= 0,01). Com isso, os resultados sugerem que a expressão de HLA-G em pacientes com CDI pode estar associada à pior evolução clínica dos mesmos havendo redução na taxa de sobrevida.

The human leukocyte antigen-G (HLA-G has been considered to be an important tolerogeneic molecule playing an essential role in maternal-fetal tolerance, which constitutes the perfect example of successful physiological immunotolerance of semi-allografts. In this context, we investigated the putative role of this molecule in the allogeneic hematopoietic cell transplantation setting. The percentage of HLA-G+ cells in peripheral blood of healthy donors and allo-transplanted patients was evaluated by flow cytometry. Their immunoregulatory and immunotolerogeneic properties were investigated in in vitro immunostimulatory and immunosuppression assays. Immunohistochemical analysis for HLA-G expression was performed in skin biopsies from allo-transplanted patients and correlated with the occurrence of graft-versus-host disease. We identified a CD14+ HLA-Gpos population with an HLA-DRlow phenotype and decreased in vitro immunostimulatory capacity circulating in peripheral blood of healthy individuals. Naturally occurring CD14+HLA-Gpos cells suppressed T cell responses and acted immunotolerogenic on T cells by rendering them hyporesponsive and immunosuppressive in vitro. After allogeneic hematopoietic cell transplantation, HLA-Gpos cells increase in blood. Interestingly, besides an increase of CD14+HLA-Gpos cells there was also a pronounced expansion of CD3+HLA-Gpos cells. Of note, CD3+HLA-Gpos and CD14+HLA-Gpos cells from transplanted patients were suppressive in in vitro lymphoproliferation assays. Furthermore, we found an upregulation of HLA-G expression in skin specimens from transplanted patients which correlated with graft-versus-host disease. Inflammatory cells infiltrating the dermis of transplanted patients were also HLA-Gpos. Here, we report the presence of naturally occurring HLA-Gpos monocytic cells with in vitro suppressive properties. HLA-G epressing regulatory blood cells were found in increased numbers after allogeneic transplantation. Epithelial cells in skin affected by graft-versus-host disease revealed elevated HLA-G expression. / Το ανθρώπινο λεμφοκυτταρικό αντιγόνο -G (HLA-G) θεωρείται ένα σημαντικό ανοσορρυθμιστικό μόριο, το οποίο κατέχει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην προαγωγή εμβρυο-μητρικής αντοχής, η οποία αποτελεί το ιδανικό παράδειγμα επιτυχούς φυσιολογικής ανοσοαντοχής του ημι-αλλομοσχεύματος. Στο πλαίσιο αυτό, στοχεύσαμε στη διερεύνηση του πιθανού ρόλου του μορίου HLA-G στην αλλογενή μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (άλλο-ΜΑΚ). Το ποσοστό των HLA-G+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των υγιών ενηλίκων και των μεταμοσχευμένων ασθενών ελέγθηκε με κυτταρομετρία ροής. Ο ανοσορρυθμιστικός τους ρόλος και οι ανοσοκατασταλτικές τους ικανότητες ελέγθηκαν σε in vitro ανοσοδιεγερτικές και ανοσοκατασταλτικές δοκιμασίες. Ανοσοιστοχημική ανάλυση της έκφρασης του HLA-G πραγματοποιήθηκε σε δερματικές βιοψίες από άλλο-μεταμοσχευμένους ασθενείς και συσχετίστηκε με την εμφάνιση της νόσου του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή(GvHD). Ένας CD14+HLA-Gθετ πληθυσμός με HLA-DRlow φαινότυπο και μειωμένη in vitro ανοσοδιεγερτική ικανότητα ανιχνεύτηκε στο περιφερικό αίμα των υγιών ενηλίκων. Τα φυσικώς εμφανιζόμενα CD14+HLA-Gθετ κύτταρα κατέστειλαν τον Τ λεμφοκυτταρικό πολλαπλασιασμό και είχαν ανοσοκατασταλτική επίδραση στα Τ κύτταρα, μετατρέποντάς τα σε υπο-απαντητικά και ανοσοκατασταλτικά κύτταρα in vitro. Μετά την αλλογενή μεταμόσχευση, τα HLA-Gθετ κύτταρα αυξάνουν στο αίμα. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι πέραν της αύξησης των CD14+HLA-Gθετ κυττάρων παρατηρήθηκε επίσης μια ιδιαίτερη αύξηση των CD3+HLA-Gθετ κυττάρων στο αίμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα CD14+HLA-Gθετ και CD3+HLA-Gθετ κύτταρα των άλλο-μεταμοσχευμένων ασθενών ήταν ικανά να καταστέλλουν τον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό in vitro. Επιπλέον ανιχνεύθηκε μια αύξηση της έκφρασης του HLA-G στις δερματικές βιοψίες των μεταμοσχευμένων ασθενών, η οποία συσχετίζονταν με τη νόσο GvHD. Τα φλεγμονώδη κύτταρα που είχαν διεισδύσει στο δέρμα των ασθενών ήταν επίσης HLA-G θετικά. Στη συγκεκριμένη εργασία αναφέρουμε την παρουσία φυσικώς εμφανιζόμενων HLA-Gθετ μονοκυττάρων με in vitro ανοσοκατασταλτικές ικανότητες. HLA-G εκφραζόμενα ρυθμιστικά κύτταρα ανιχνεύονται στο αίμα μετά τη μεταμόσχευση σε αυξημένους αριθμούς. Τα επιθηλιακά κύτταρα του δέρματος που είναι προσβεβλημένο από τη νόσο GvHD εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του HLA-G.