O aumento da incidência da doença huanglonbing (HLB) nos pomares brasileiros tem contribuído significativamente para o aumento do custo de produção de laranja no Brasil, devido à suscetibilidade de todas as variedades cultivadas. O HLB é associado às bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus, transmitidas pelos psilídeos Diaphorina citri e Trioza erytreae. No Brasil, o inseto vetor responsável pela rápida disseminação da doença é o psilídeo Diaphorina citri. Os principais métodos de controle do HLB são a eliminação de plantas sintomáticas, uso de mudas sadias e controle do vetor. O uso de plantas geneticamente modificadas pode ser uma alternativa ao uso excessivo de inseticidas para controle do inseto vetor. Sendo assim, pode-se adotar uma nova tecnologia que se baseia no uso de RNAs de interferência (RNAi) para o silenciamento de genes específicos do inseto vetor. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do silenciamento dos genes calreticulina (DcCRT), lacase (DcLAC) e Snf7 (DcSNF7) de Diaphorina citri por RNA de interferência via alimentação em folhas destacadas de Murraya paniculata que absorveram solução contendo dsRNA de silenciamento. A princípio, foi avaliada a expressão dos genes candidatos em diferentes estádios fenológicos dos insetos. Em seguida, foram realizados bioensaios de sobrevivência e silenciamento, com as doses 0, 5, 25 e 50µg de dsRNA. A sobrevivência dos insetos foi avaliada ao longo de 144 horas, enquanto que os insetos utilizados na análise de expressão gênica foram coletados 12, 24, 48, 72 e 96h após o início da alimentação. Para os genes DcCRT, relacionado à quelatização de íons cálcio, e DcLAC, relacionado à gelificação oxidativa do estilete, ambos envolvidos no processo alimentar do inseto, também foi observado o efeito das doses de dsRNA na quantidade de alimento ingerido, 120h após o início da alimentação. Além disso, também foi realizado bioensaio com dsRNA Cy3-labbled, para verificar a distribuição do dsRNA absorvido. A expressão dos genes candidatos, de modo geral, se manteve uniforme ao longo dos estádios de desenvolvimento dos insetos, exceto para o gene DcLAC que apresentou maior expressão em adultos recém emergidos do que nos demais estádios avaliados. Nos bioensaios com dsRNA de silenciamento, observou-se fenótipo letal apenas com o silenciamento do gene DcSnf7, 144 horas após o início da alimentação. Durante o período avaliado, foi constatada redução na expressão gênica apenas de DcCRT, após 12h de alimentação e DcLAC após 96h de alimentação com seus respectivos dsRNA de silenciamento. Além disso, a dose de 5µg de dsRNA foi suficiente para causar tal efeito de silenciamento gênico. No bioensaio para quantificação da alimentação, observou- se redução na excreção de aminoácidos nos insetos alimentados com 5µg de dsRNA, em ambos os genes candidatos (DcCRT e DcLAC) 120h após o início da alimentação. Adicionalmente, a análise de distribuição de dsRNA pela folha mostrou que há absorção do dsRNA pela folha destacada, permitindo a alimentação pelo inseto. Dessa forma, conclui-se que os genes estudados apresentam potencial para o controle do psilídeo Diaphorina citri, via silenciamento gênico por RNAi. / The increase in the incidence of huanglonbing disease (HLB) in Brazilian orchards has contributed to increase of orange production costs in Brazil, due to the susceptibility of all cultivated variety of orange. HLB is associated with the Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus and Candidatus Liberibacter americanus bacteria, transmitted by the psyllids Diaphorina citri and Trioza erytreae. In Brazil, the insect vector responsible for the rapid spread of the disease is Diaphorina citri. The most important methods of HLB control are the elimination of symptomatic plants, the use of healthy nursery trees, and vector control. The use of genetically modified plants may be an alternative to the excessive use of insecticides to control the insect vector. Therefore, a new technology based on using RNAs of interference (RNAi), for silencing specific genes of the insect vector can be used. Thus, the aim of this work was to evaluate the effect of silencing calreticulin (DcCRT), laccase (DcLAC) and Snf7 (DcSNF7) genes in Diaphorina citri by interference RNA through feeding in leaves of Murraya paniculata that absorbed a solution containing dsRNA of silencing. At first, the expression of the candidate genes in different phenological stages of the insects was evaluated. Survival and silencing bioassays were then performed at doses of 0, 5, 25 and 50 µg of dsRNA. Insect survival was evaluated over 144 hours, while the insects used in gene expression analysis were collected 12, 24, 48, 72 and 96 hours after feeding. For the DcCRT genes, associated to the calcium ion chelation, and DcLAC, related to the oxidative gelling of the stylet, both involved in the insect feed process, the effect of the doses of dsRNA on the amount of food ingested, 120h after the beginning of feeding was observed. In addition, a bioassay with Cy3-labbled dsRNA was also performed to verify the distribution of absorbed dsRNA. The expression of the candidate genes generally remained uniform throughout the stages of insect development, except for the DcLAC gene that showed greater expression in newly emerged adults than in the other evaluated stages. In the bioassays with dsRNA for gene silencing, a lethal phenotype was observed only with the silencing of the DcSnf7 gene, 144 hours after the beginning of feeding. During the evaluated period, there was a reduction in the gene expression only of DcCRT, after 12h of feed and DcLAC after 96h of feeding with their respective silencing dsRNA. Additionally, the dose of 5µg of dsRNA was enough to cause this gene silencing effect. In the bioassay for feeding quantification, a reduction in amino acid excretion was observed in insects fed with 5 µg of dsRNA, in both candidate genes (DcCRT and DcLAC) 120 h after the beginning of feeding. In addition, the analysis of dsRNA distribution by the leaf showed that there is absorption of the dsRNA by the detached leaf, allowing feeding by the insect. Thus, we conclude that the genes studied have potential for the control of the psyllid Diaphorina citri, through gene silencing mediated by RNAi.

A cultura da laranja doce é muito importante ao redor do mundo, em especial no Brasil, maior produtor mundial dessas frutas. A produção citrícola sempre esteve ameaçada por muitas doenças de grande importância, tais como, o cancro cítrico, a clorose variegada dos citros (CVC) e pinta preta. Entretanto, em 2004, surgiu o huanglongbing (HLB) ou greening, que tem devastado pomares, e para a qual ainda não foi encontrada uma solução definitiva. A transgenia pode ser uma técnica auxiliar no manejo desta doença com a busca de cultivares mais tolerantes, em especial ao HLB. Neste trabalho, as pesquisas de transgenia não envolveram genes exógenos à planta como, por exemplo, genes de outros organismos ou genes sintéticos, ou seja, foi baseado em tecnologias mais recentes já aplicadas em outras espécies vegetais, nas quais a transgenia é utilizada para super-expressar genes dos sistemas de defesa da própria planta. Estudos indicam que a super-expressão de genes do sistema de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR - do inglês, \"Systemic Acquired Resistance\") promove a resistência de plantas a doenças. Um gene importante para esse sistema é o gene npr1 que controla a expressão das proteínas relacionadas à patogênese (PR), em especial a PR1. Junto do gene npr1, os genes npr3 e npr4 também são reguladores desse sistema, atuando sobre o gene npr1 de acordo com os níveis de ácido salicílico presentes na célula, nível este que varia de acordo com o nível de infecção de cada célula. Porém, a avaliação de um evento transgênico de citros pode levar muitos anos. Desta forma, para diminuir esse tempo de avaliação, pensou-se em usar plantas modelos. O sistema escolhido foi o tomateiro Micro-Tom (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). Para a obtenção das construções gênicas, foram identificados os genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 de Citrus sinensis L. Osbeck a partir dos genes Atnpr1, Atnpr3 e Atnpr4 de Arabidopsis thaliana L.. Os genes de citros foram obtidos a partir de uma planta de laranja doce por RT-PCR e clonados no vetor pCambia 2201, que foi então inserido em Agrobacterium tumefaciens para a transformação genética. Foi feita a transformação genética de plantas de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) e do tomateiro Micro-Tom. Após o crescimento dos brotos regenerados, foi feita a avaliação das plantas obtidas por meio de PCR. As plantas geneticamente modificadas foram aclimatizadas. As plantas de citros foram enxertadas e mantidas em casa de vegetação. As plantas de tomateiro Micro-Tom foram propagadas por sementes. A progênie foi avaliada aplicando o antibiótico de seleção canamicina, obtendo-se assim uma linhagem transgênica homozigota. / The sweet orange industry is very important worldwide, specially in Brazil, considered the world´s largest producer. The citrus production has always been threatened by several diseases of great importance, such as canker, CVC, and black spot. However, in 2004, the huanglongbing (HLB) or greening has been detected and devastated many citrus groves, and no definitive solution has been found yet. Transgenes may be a helpful tool for the management of this diseases, leading to the production of tolerant cultivars, especially to HLB. In this work, research on transgenic did not include the use of exogenous genes to the plant, such as genes from other organism or synthetic genes, i.e, it was based on new emerging technologies, already used on other crops, in which transgeny is used to super express genes from the plants own defense system. Studies indicate that a super expression of genes from the system called Systemic Acquired Resistance (SAR) promotes disease resistance. One important gene to this system is the npr1 gene, which controls the expression of the pathogen related proteins (PR), in special the PR1. Together with the npr1 gene, the genes npr3 and npr4 are also regulators of this system, regulating the action of the npr1 gene according to the levels of salicylic acid present in the cell, this level varies with the level of infection in each cell. Nevertheless, evaluating a citrus transgenic event may take several years. In order to shorten this time, model plants were used. The model chosen was the Micro-Tom tomato (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). In order to obtain the genetic constructions, the genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 were identified in Citrus sinensis L. Osbeck from the genes, Atnpr1, Atnpr3 and Atnpr4 present in the Arabidopsis thaliana L. genome. The citrus genes were obtained from the citrus genome using RT-PCR procedure and cloned separately into the pCambia 2201 vector, which was inserted into Agrobacterium tumefaciens in order to perform the genetic transformation. Sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and Micro-Tom plants were genetically modified. After the growth of the regenerated shoots, the evaluation of the obtained plants was done through PCR analysis. The genetically modified plants were acclimatized, the citrus plants were grafted and kept in the greenhouse, the Micro-Tom plants were propagated trough seeds and its progeny was evaluated by applying the selection antibiotic kanamycin, thus obtaining a homozygous transgenic line.

A pesquisa teve por objetivo determinar o desenvolvimento, o número de gerações e a constante térmica de Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Liviidae) e Tamarixia radiata (Waterston, 1922) (Hymenoptera: Eulophidae), sob 20 combinações de temperaturas alternantes que simulam as condições de Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo e Votuporanga, áreas citrícolas do estado de São Paulo, nas quatro estações do ano. Paralelamente, discutem-se as estimativas dos períodos de liberação do parasitoide associados ao alerta fitossanitário desenvolvido pelo FUNDECITRUS. Foi estudado o desenvolvimento de D. citri e T. radiata, sendo registrado o tempo necessário para completarem o ciclo biológico. A partir destes dados, foi calculada a constante térmica e o número de gerações da praga e do parasitoide para cada uma das condições propostas. Com base na duração do desenvolvimento de D. citri, foi definido o momento ideal para liberação de T. radiata em campo. Os resultados da determinação do número de gerações de D. citri e de T. radiata, baseando-se em temperaturas alternantes, foram comparáveis ao modelo desenvolvido em temperaturas constantes, sendo que as variações existentes entre os dois modelos se deveram à inclusão do período de pré-oviposição que foi variável em função da temperatura. A previsão do número de gerações se ajustou mais a T. radiata do que a D. citri, sendo propostos fatores de correção para casos em que a constante térmica observada superou 10- 15% do valor determinado em laboratório. Observou-se que uma geração de D. citri variou de 22,9 a 74,2 dias, no verão e inverno para as simulações de Votuporanga e Tatuí, respectivamente; por outro lado, nas mesmas condições, uma geração de T. radiata pode variar de 9,8 a 21,6 dias. A relação entre o número de gerações de D. citri: T. radiata no decorrer do ano é superior a 1:2, sendo de 1: 2,58; 1: 2,47; 1: 2,28; 1: 2,28; 1: 2,34, respectivamente, para as simulações de Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo e Votuporanga. A regressão linear mostrou que o número de gerações de D. citri é melhor explicado pela média das temperaturas diurna e noturna, enquanto que para T. radiata, apenas pela temperatura diurna. Os valores extremos de dias para liberação de T. radiata após o alerta fitossanitário, correspondem às regiões de Avaré e Bebedouro. Os resultados indicam que há uma variação no desenvolvimento da praga e do seu parasitoide entre as regiões e que há necessidade de validação em campo; no entanto, se confirmados, permitirão o uso mais eficiente do parasitoide T. radiata, se tornando um componente auxiliar ao sistema de alerta e ao Manejo Integrado dessa importante doença, o HLB. / This study determined the development, number of generations and thermal constant of the HLB vector Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Liviidae) and the parasitoid Tamarixia radiata (Waterston, 1922) (Hymenoptera: Eulophidae) under 20 combinations of alternating temperatures that simulated the conditions of five citrus-growing areas of São Paulo state (Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo and Votuporanga) in the four seasons. The estimated optimum release time of the parasitoid is discussed in relation to a phytosanitation alert developed by FUNDECITRUS. The development time and time needed to complete the life cycles of D. citri and T. radiata were assessed. The thermal constant and number of generations of the pest and parasitoid for each temperature condition were calculated based on these data. Based on the development time of D. citri, the optimum time to release T. radiata in the field was established. The estimated number of generations of D. citri and T. radiata in alternating temperatures was comparable to the model developed at constant temperatures; the differences between the two models were due to the inclusion of the pre-oviposition period, which varied as a function of temperature. The estimated number of generations was larger for T. radiata than D. citri, and correction factors were proposed for those cases in which the observed thermal constant exceeded 10-15% of the value determined in the laboratory. Generation times of D. citri ranged from 22.9 days in summer to 74.2 days in winter for the simulations for Votuporanga and Tatuí. Under the same conditions, one generation of T. radiata may range from 9.8 to 21.6 days. The ratio between the annual number of generations of D. citri: T. radiata was higher than 1: 2, ranging from 1: 2.58; 1: 2.47; 1: 2.28; 1: 2.28; 1: 2.34 for the simulations for Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo and Votuporanga, respectively. Linear regression analysis showed that the number of generations of D. citri is best explained by the mean diurnal and nocturnal temperatures, whereas for T. radiata, only by the mean diurnal temperature. The extreme values for optimum release day of T. radiata after a phytosanitation alert were found for Avare and Bebedouro. The results indicate that the development of the pest and its parasitoid differ among areas, and there is need for validation in the field. However, if confirmed, these data will allow more efficient use of the parasitoid T. radiata as a complementary component of the alert system and of Integrated Management of HLB.

Nos anos recentes, a atividade agrícola da citricultura vem enfrentando grandes problemas fitossanitários, principalmente, com relação à viabilidade econômica decorrente do controle das doenças. A bactéria Candidatus Liberibacter spp. está associada ao HLB, a principal doença que limita a produção das plantas cítricas. Assim, muitos pesquisadores têm voltado suas atenções para estudarem e encontrarem genes-alvo na resposta do hospedeiro a este patógeno para utilização no melhoramento genético. Nesse sentido, métodos de transformação genética das plantas cítricas são essenciais, porém características inerentes à espécie limitam seu cultivo in vitro e requerem um maior tempo para crescimento e propagação. Com isso, torna-se importante o estudo em plantas modelo, principalmente, para seguir protocolos de validação de genes. De acordo com o exposto, o gene EDS5 isolado de Citrus sinensis, associado ao mecanismo de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR) foi superexpresso por meio da transformação genética em tomateiro (Solanum lycopersicum L. Micro-Tom). Após o crescimento dos brotos regenerados, foram identificadas as plantas positivas por meio de análise de GUS e PCR. Linhagens transgênicas homozigotas foram obtidas com avaliação da resistência ao antibiótico canamicina. / In the recent years, the agricultural activity of the citrus industry has been facing big phytosanitary problems, mainly with regard to economic viability arising from disease control. The bacterium Candidatus Liberibacter spp. is associated with HLB, the main disease that limits the production of citrus trees. Thus, many researchers have been returning their attentions to study and find target genes in the host response to this pathogen for use in the genetic improvement. In this way, methods of genetic transformation of citrus plants are essential, but the inherent characteristics of the species border your in vitro cultivation and require a longer time for growth and propagation. Therefore, it is important to study of model plants, mainly for genetic validation protocols. Thus, the EDS5 gene isolated from Citrus sinensis, associated with Systemic Acquired Resistance mechanism (SAR) was overexpressed by genetic transformation in tomato (Solanum lycopersicum L. Micro-Tom). After the growth of regenerated shoots, positive plants were identified by PCR and GUS analysis. Homozygous transgenic lines were obtained with evaluation of resistance to kanamycin.

A pesquisa teve por objetivo determinar o desenvolvimento, o número de gerações e a constante térmica de Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Liviidae) e Tamarixia radiata (Waterston, 1922) (Hymenoptera: Eulophidae), sob 20 combinações de temperaturas alternantes que simulam as condições de Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo e Votuporanga, áreas citrícolas do estado de São Paulo, nas quatro estações do ano. Paralelamente, discutem-se as estimativas dos períodos de liberação do parasitoide associados ao alerta fitossanitário desenvolvido pelo FUNDECITRUS. Foi estudado o desenvolvimento de D. citri e T. radiata, sendo registrado o tempo necessário para completarem o ciclo biológico. A partir destes dados, foi calculada a constante térmica e o número de gerações da praga e do parasitoide para cada uma das condições propostas. Com base na duração do desenvolvimento de D. citri, foi definido o momento ideal para liberação de T. radiata em campo. Os resultados da determinação do número de gerações de D. citri e de T. radiata, baseando-se em temperaturas alternantes, foram comparáveis ao modelo desenvolvido em temperaturas constantes, sendo que as variações existentes entre os dois modelos se deveram à inclusão do período de pré-oviposição que foi variável em função da temperatura. A previsão do número de gerações se ajustou mais a T. radiata do que a D. citri, sendo propostos fatores de correção para casos em que a constante térmica observada superou 10- 15% do valor determinado em laboratório. Observou-se que uma geração de D. citri variou de 22,9 a 74,2 dias, no verão e inverno para as simulações de Votuporanga e Tatuí, respectivamente; por outro lado, nas mesmas condições, uma geração de T. radiata pode variar de 9,8 a 21,6 dias. A relação entre o número de gerações de D. citri: T. radiata no decorrer do ano é superior a 1:2, sendo de 1: 2,58; 1: 2,47; 1: 2,28; 1: 2,28; 1: 2,34, respectivamente, para as simulações de Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo e Votuporanga. A regressão linear mostrou que o número de gerações de D. citri é melhor explicado pela média das temperaturas diurna e noturna, enquanto que para T. radiata, apenas pela temperatura diurna. Os valores extremos de dias para liberação de T. radiata após o alerta fitossanitário, correspondem às regiões de Avaré e Bebedouro. Os resultados indicam que há uma variação no desenvolvimento da praga e do seu parasitoide entre as regiões e que há necessidade de validação em campo; no entanto, se confirmados, permitirão o uso mais eficiente do parasitoide T. radiata, se tornando um componente auxiliar ao sistema de alerta e ao Manejo Integrado dessa importante doença, o HLB. / This study determined the development, number of generations and thermal constant of the HLB vector Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Liviidae) and the parasitoid Tamarixia radiata (Waterston, 1922) (Hymenoptera: Eulophidae) under 20 combinations of alternating temperatures that simulated the conditions of five citrus-growing areas of São Paulo state (Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo and Votuporanga) in the four seasons. The estimated optimum release time of the parasitoid is discussed in relation to a phytosanitation alert developed by FUNDECITRUS. The development time and time needed to complete the life cycles of D. citri and T. radiata were assessed. The thermal constant and number of generations of the pest and parasitoid for each temperature condition were calculated based on these data. Based on the development time of D. citri, the optimum time to release T. radiata in the field was established. The estimated number of generations of D. citri and T. radiata in alternating temperatures was comparable to the model developed at constant temperatures; the differences between the two models were due to the inclusion of the pre-oviposition period, which varied as a function of temperature. The estimated number of generations was larger for T. radiata than D. citri, and correction factors were proposed for those cases in which the observed thermal constant exceeded 10-15% of the value determined in the laboratory. Generation times of D. citri ranged from 22.9 days in summer to 74.2 days in winter for the simulations for Votuporanga and Tatuí. Under the same conditions, one generation of T. radiata may range from 9.8 to 21.6 days. The ratio between the annual number of generations of D. citri: T. radiata was higher than 1: 2, ranging from 1: 2.58; 1: 2.47; 1: 2.28; 1: 2.28; 1: 2.34 for the simulations for Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo and Votuporanga, respectively. Linear regression analysis showed that the number of generations of D. citri is best explained by the mean diurnal and nocturnal temperatures, whereas for T. radiata, only by the mean diurnal temperature. The extreme values for optimum release day of T. radiata after a phytosanitation alert were found for Avare and Bebedouro. The results indicate that the development of the pest and its parasitoid differ among areas, and there is need for validation in the field. However, if confirmed, these data will allow more efficient use of the parasitoid T. radiata as a complementary component of the alert system and of Integrated Management of HLB.

Nos anos recentes, a atividade agrícola da citricultura vem enfrentando grandes problemas fitossanitários, principalmente, com relação à viabilidade econômica decorrente do controle das doenças. A bactéria Candidatus Liberibacter spp. está associada ao HLB, a principal doença que limita a produção das plantas cítricas. Assim, muitos pesquisadores têm voltado suas atenções para estudarem e encontrarem genes-alvo na resposta do hospedeiro a este patógeno para utilização no melhoramento genético. Nesse sentido, métodos de transformação genética das plantas cítricas são essenciais, porém características inerentes à espécie limitam seu cultivo in vitro e requerem um maior tempo para crescimento e propagação. Com isso, torna-se importante o estudo em plantas modelo, principalmente, para seguir protocolos de validação de genes. De acordo com o exposto, o gene EDS5 isolado de Citrus sinensis, associado ao mecanismo de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR) foi superexpresso por meio da transformação genética em tomateiro (Solanum lycopersicum L. Micro-Tom). Após o crescimento dos brotos regenerados, foram identificadas as plantas positivas por meio de análise de GUS e PCR. Linhagens transgênicas homozigotas foram obtidas com avaliação da resistência ao antibiótico canamicina. / In the recent years, the agricultural activity of the citrus industry has been facing big phytosanitary problems, mainly with regard to economic viability arising from disease control. The bacterium Candidatus Liberibacter spp. is associated with HLB, the main disease that limits the production of citrus trees. Thus, many researchers have been returning their attentions to study and find target genes in the host response to this pathogen for use in the genetic improvement. In this way, methods of genetic transformation of citrus plants are essential, but the inherent characteristics of the species border your in vitro cultivation and require a longer time for growth and propagation. Therefore, it is important to study of model plants, mainly for genetic validation protocols. Thus, the EDS5 gene isolated from Citrus sinensis, associated with Systemic Acquired Resistance mechanism (SAR) was overexpressed by genetic transformation in tomato (Solanum lycopersicum L. Micro-Tom). After the growth of regenerated shoots, positive plants were identified by PCR and GUS analysis. Homozygous transgenic lines were obtained with evaluation of resistance to kanamycin.

A cultura da laranja doce é muito importante ao redor do mundo, em especial no Brasil, maior produtor mundial dessas frutas. A produção citrícola sempre esteve ameaçada por muitas doenças de grande importância, tais como, o cancro cítrico, a clorose variegada dos citros (CVC) e pinta preta. Entretanto, em 2004, surgiu o huanglongbing (HLB) ou greening, que tem devastado pomares, e para a qual ainda não foi encontrada uma solução definitiva. A transgenia pode ser uma técnica auxiliar no manejo desta doença com a busca de cultivares mais tolerantes, em especial ao HLB. Neste trabalho, as pesquisas de transgenia não envolveram genes exógenos à planta como, por exemplo, genes de outros organismos ou genes sintéticos, ou seja, foi baseado em tecnologias mais recentes já aplicadas em outras espécies vegetais, nas quais a transgenia é utilizada para super-expressar genes dos sistemas de defesa da própria planta. Estudos indicam que a super-expressão de genes do sistema de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR - do inglês, \"Systemic Acquired Resistance\") promove a resistência de plantas a doenças. Um gene importante para esse sistema é o gene npr1 que controla a expressão das proteínas relacionadas à patogênese (PR), em especial a PR1. Junto do gene npr1, os genes npr3 e npr4 também são reguladores desse sistema, atuando sobre o gene npr1 de acordo com os níveis de ácido salicílico presentes na célula, nível este que varia de acordo com o nível de infecção de cada célula. Porém, a avaliação de um evento transgênico de citros pode levar muitos anos. Desta forma, para diminuir esse tempo de avaliação, pensou-se em usar plantas modelos. O sistema escolhido foi o tomateiro Micro-Tom (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). Para a obtenção das construções gênicas, foram identificados os genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 de Citrus sinensis L. Osbeck a partir dos genes Atnpr1, Atnpr3 e Atnpr4 de Arabidopsis thaliana L.. Os genes de citros foram obtidos a partir de uma planta de laranja doce por RT-PCR e clonados no vetor pCambia 2201, que foi então inserido em Agrobacterium tumefaciens para a transformação genética. Foi feita a transformação genética de plantas de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) e do tomateiro Micro-Tom. Após o crescimento dos brotos regenerados, foi feita a avaliação das plantas obtidas por meio de PCR. As plantas geneticamente modificadas foram aclimatizadas. As plantas de citros foram enxertadas e mantidas em casa de vegetação. As plantas de tomateiro Micro-Tom foram propagadas por sementes. A progênie foi avaliada aplicando o antibiótico de seleção canamicina, obtendo-se assim uma linhagem transgênica homozigota. / The sweet orange industry is very important worldwide, specially in Brazil, considered the world´s largest producer. The citrus production has always been threatened by several diseases of great importance, such as canker, CVC, and black spot. However, in 2004, the huanglongbing (HLB) or greening has been detected and devastated many citrus groves, and no definitive solution has been found yet. Transgenes may be a helpful tool for the management of this diseases, leading to the production of tolerant cultivars, especially to HLB. In this work, research on transgenic did not include the use of exogenous genes to the plant, such as genes from other organism or synthetic genes, i.e, it was based on new emerging technologies, already used on other crops, in which transgeny is used to super express genes from the plants own defense system. Studies indicate that a super expression of genes from the system called Systemic Acquired Resistance (SAR) promotes disease resistance. One important gene to this system is the npr1 gene, which controls the expression of the pathogen related proteins (PR), in special the PR1. Together with the npr1 gene, the genes npr3 and npr4 are also regulators of this system, regulating the action of the npr1 gene according to the levels of salicylic acid present in the cell, this level varies with the level of infection in each cell. Nevertheless, evaluating a citrus transgenic event may take several years. In order to shorten this time, model plants were used. The model chosen was the Micro-Tom tomato (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). In order to obtain the genetic constructions, the genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 were identified in Citrus sinensis L. Osbeck from the genes, Atnpr1, Atnpr3 and Atnpr4 present in the Arabidopsis thaliana L. genome. The citrus genes were obtained from the citrus genome using RT-PCR procedure and cloned separately into the pCambia 2201 vector, which was inserted into Agrobacterium tumefaciens in order to perform the genetic transformation. Sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and Micro-Tom plants were genetically modified. After the growth of the regenerated shoots, the evaluation of the obtained plants was done through PCR analysis. The genetically modified plants were acclimatized, the citrus plants were grafted and kept in the greenhouse, the Micro-Tom plants were propagated trough seeds and its progeny was evaluated by applying the selection antibiotic kanamycin, thus obtaining a homozygous transgenic line.

Com uma grande diversidade climática, 13% de toda a água doce do mundo em seu território, abundância na energia solar e chuvas regulares, o Brasil é um país favorável para o desenvolvimento da agropecuária. Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) as vendas do setor do Agronegócio brasileiro, de janeiro até julho de 2016, alcançaram US$ 52,8 bilhões, respondendo por 49% de todas as exportações do país. Dois produtos que contribuem decisivamente para este sucesso são a soja e a laranja, onde o Brasil se enquadra como grande produtor e exportador. Um fator que pode comprometer o crescimento do setor do agronegócio são as pragas e doenças. Neste trabalho foram utilizadas técnicas de imagens e espectroscopia de fluorescência como ferramentas de diagnóstico de doenças e fenotipagem. As culturas estudadas, por sua relevância econômica, foram os citros e a soja. Foram investigadas folhas de laranja sadias e doentes com Huanglongbing (HLB), conhecida também como Greening e folhas de soja sadias e doentes com Green StemandFoliar Retention (GSFR), popularmente conhecida como Soja Louca II. Com base em descritores retirados dos espectros e das imagens foram desenvolvidos classificadores utilizando-se a Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR). O desempenho dos classificadores para diferenciar folhas de soja doentes de folhas sadias alcançou 99% para o sistema de espectroscopia de fluorescência e 100% para o sistema de Imagens de Fluorescência. Já com o sistema de imagens de Refletância com Luz Polarizada o acerto na classificação correta entre folhas de laranja sadias e com HLB foi de 84%. Também foi estudada a possibilidade de utilização de imagens termais em diferentes situações de estresse hídrico e nutricional. Através deste sistema foi possível detectar plantas em condições de estresses hídricos decorridos dois dias após o corte de água. As técnicas acima mencionadas também foram testadas para fenotipagem de plantas. Foram analisadas 20 variedades diferentes de citros e 3 de soja. A taxa de acerto na diferenciação de citros geneticamente muito próximos ficou em torno de 63% e para soja foi alcançado 95%, isso quando empregado o sistema de espectroscopia de fluorescência. Com base nesses resultados é possível afirmar que as técnicasfotônicas combinadas com os modelos classificadores, podem ser utilizadas como ferramentas para diagnosticar as doenças, como a GSFR e o HLB, e avaliar diferentes tipos de estresse abiótico. Elas também podem ser utilizadas para diferenciar variedades de plantas, mesmo no caso de variedades muito próximas geneticamente, onde as técnicas tradicionais não são capazes de fazê-lo. Os resultados apresentados foram promissores e podem, em um futuro próximo, gerar sistemas portáteis que devem auxiliar os produtores no campo. / With a great climatic diversity, 13% of all the fresh water of the world in its territory, abundance in solar energy and regular rains, Brazil is a favorable country for the development of agriculture. According to the Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply (MAPA), sales of the Brazilian Agribusiness sector, from January to July 2016, reached US$ 52.8 billion, accounting for 49% of all Brazilian exports. Two products that contribute decisively to this success are soy and orange, where Brazil is a major producer and exporter. One factor that can jeopardize the growth of the agribusiness sector is pests and diseases. In this work, fluorescence spectroscopy and imaging techniques were used as tools for the diagnosis of diseases and phenotyping. The crops studied, because of their economic relevance, were citrus and soybean. Healthy and infected leaves with Huanglongbing (HLB), also known as Greening, and healthy and infected leaves with Green Stem and Foliar Retention (GSFR), popularly known as Mad Soybean II, were investigated. Based on descriptors taken from spectra and images, classifiers were developed using Partial Least Squares Regression (PLSR). The performance of the classifiers to differentiate diseased leaves from healthy leaves reached 99% for the fluorescence spectroscopy system and 100% for the Fluorescence Imaging system. The success rate of classification for the system using polarized reflectance images reached 84%. We also studied the possibility of using thermal images in different situations of water and nutritional stress. Through this system, it was possible to detect plants in conditions of water stress after two days of water cut. The techniques above mentioned were also tested for plant phenotyping. Twenty different citrus and three soybean varieties were analyzed. The success rate of the differentiation using fluorescence spectroscopy for very close citrus was around 63% and for soybean was reached 95%. Based on these results it is possible to conclude that the photonic techniques combined with the classifier models can be used as tools to diagnose diseases such as GSFR and HLB and to evaluate different types of abiotic stress. They can also be used to differentiate plant varieties, even in the case of very closely varieties, where traditional techniques are not able to carry out. The results presented were promising and may, in the near future, generate portable systems that should assist farmers in the field.

Os citros são as plantas economicamente mais importantes da fruticultura mundial. O Brasil responde por cerca de 30% da produção do planeta, e o Estado de São Paulo produz cerca de 80% dos citros do país. A pior ameaça atual a esse mercado é a doença bacteriana conhecida como greening ou huanglongbing (HLB), pela severidade dos sintomas, por afetar todas as variedades de citros e pela rapidez com que se espalha pelos pomares, transmitida pelo inseto psilídeo Diaphorina citri. O greening torna os frutos inúteis para consumo e leva à morte da planta. Não existe cura para a doença, de modo que o principal método de controle de infestação é a combinação das pulverizações, para reduzir a população do inseto vetor, com a erradicação das plantas doentes. Este último procedimento é efetuado porque a planta doente funciona como foco de propagação para o restante do pomar. Por isso, é importante identificar e erradicar a planta doente o mais cedo possível. Hoje, a identificação das plantas doentes é feita por inspeção visual. Esse método é muito pouco eficaz, pois, na ausência de frutos, os sintomas nas folhas não se manifestam de maneira uniforme em toda a planta e podem ser bastante sutis, sendo até confundidos com outras doenças. Além disso, as plantas inoculadas permanecem cerca de um ano sem manifestar sintoma algum. Por isso, a inspeção visual tipicamente identifica apenas cerca de 27% das plantas infectadas. O método de diagnóstico mais preciso disponível atualmente é a reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT- PCR). Entretanto, essa técnica é trabalhosa e dispendiosa, o que torna impossível seu uso para o diagnóstico de grandes quantidades de plantas. Este trabalho propõe uma metodologia de diagnóstico baseada na obtenção de espectros de fluorescência induzida por laser (LIFS) das folhas e na aplicação de redes neurais artificiais para distinguir plantas sadias e doentes. Um experimento realizado no campo com pés de laranjeira Pêra-rio enxertada em limoeiro Cravo demonstrou que plantas sintomáticas podem ser diagnosticadas com eficiência de 87%. Um experimento controlado usando mudas de laranjeira Valência em citrumeleiro Swingle atestou que a técnica proposta também é capaz de diagnosticar plantas assintomáticas, obtendo taxas de acerto de até 63%. Da comparação dos resultados com os obtidos por RT-PCR constatou-se que a técnica aqui proposta apresenta taxa de acerto até duas vezes maior nos estágios iniciais do desenvolvimento da doença, até dois meses antes do aparecimento dos sintomas. Foram feitos também estudos preliminares da viabilidade do uso das técnicas de imagens de fluorescência induzida por laser (LIFI) e espectroscopia de emissão óptica com plasma induzido por laser (LIBS) para o diagnóstico precoce do greening. Os resultados foram bons em ambos os casos: na fase assintomática da doença, LIFI obteve sempre mais de 68% de acerto, e LIBS obteve mais de 62% em todos os casos. Todas as técnicas forneceram, portanto, resultados muito melhores que os da inspeção visual, e todas são mais viáveis que o RT-PCR, tanto pela rapidez quanto pelo custo envolvido. / Citrus plants are the most economically important fruit worldwide. Brazil accounts for about 30% of the planet\'s production, and the State of São Paulo produces 80% of citrus in the country. Nowadays, the worst threat to this market is the bacterial disease known as greening or huanglongbing (HLB), because it causes severe symptoms, affects all citrus varieties, and spreads very quickly through the orchards, being transmitted by the insect Diaphorina citri. The greening-affected fruits are useless and the plant dies. There is no healing for this disease, so the main method for infestation control is pulverization, to reduce the population of the vector insect, combined with eradication of diseased plants. The last procedure is done because the diseased plant acts as a focus, spreading HLB to the healthy trees around. Therefore, it is important to identify and eradicate the diseased plant as soon as possible. The identification of diseased plants is done currently by visual inspection. This method is very inefficient, because, in the absence of fruits, the leaf\'s symptoms do not appear uniformly throughout the plant and when appear they can be quite subtle, and even they can be mistaken for other diseases. Moreover, inoculated plants do not show any symptoms for about a year. This is why visual inspection typically identifies only about 27% of infected plants. At present, the most accurate method of diagnosis available is real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). However, this technique is laborious and costly, making impossible to use it for large scale diagnosis. This study proposes a new diagnostic methodology carried out in the leaves, without any preparation, based on laser-induced fluorescence spectroscopy (LIFS) and artificial neural networks to distinguish diseased plants from healthy ones. A field experiment using Pêra-rio orange grafted on Cravo lemon plants has shown that symptomatic trees can be diagnosed with an efficiency of 87%. A controlled experiment using Valência orange on Swingle citrumelo trees testified that the proposed technique is also able to diagnose asymptomatic plants, achieving accuracy rates up to 63%. Comparison with results obtained by RT-PCR revealed that the technique proposed here achieves accuracy rates up to twice as high in the early stages of disease development, until two months before the onset of symptoms. Preliminary studies about the feasibility of laser-induced fluorescence imaging (LIFI) and laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) for greening early diagnosis were also performed. Results were good in both cases: in the symptomatic stage of the disease, LIFI always got more than 68% accuracy, and LIBS obtained more than 62% in all cases. All the techniques have provided thus far better results than those from visual inspection, and they all are more applicable than RT-PCR, because of quickness and low cost of analysis.

Diaphorina citri é o inseto vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., causadoras do huanglongbing (HLB), doença que tem causado sérios danos e grandes perdas econômicas à citricultura mundial, pois acomete todas as variedades comerciais de citros e não existem genótipos comerciais resistentes. Por esta razão, têm-se buscado estratégias que auxiliem no controle do inseto vetor, hoje feito quase que exclusivamente com o uso de excessivas aplicações de agroquímicos que aumentam o custo de produção e potencializam a agressão ao meio ambiente. Tem-se vislumbrado o desenvolvimento de plantas transgênicas que aumentem a resposta de defesa da planta contra Ca. Liberibacter spp. ou o vetor de forma mais efetiva, pelo direcionamento da expressão de genes alvo em tecidos específico, controlados por promotores de floema ou constitutivo. Nosso grupo tem buscado estratégias ainda não utilizadas em citros, mas efetivas para outras culturas, como o uso da bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Bt) para o controle de D. citri. Essa bactéria se destaca devido à produção de proteínas com atividades inseticidas contra diversas fases imaturas de insetos, por isso tem sido amplamente utilizada tanto na produção de bioinseticidas quanto, principalmente, na produção de plantas transgênicas em culturas como algodão, milho e soja. Em trabalhos anteriores, identificamos que o gene cry11 codifica uma toxina capaz de causar elevada mortalidade em ninfas do psilídeo dos citros 120 horas após sua inoculação em seedlings de citros. Este gene foi clonado para a expressão em tecido de plantas de laranja doce sob o direcionamento de dois promotores, um específico de floema e o outro constitutivo. Foram obtidas 19 plantas transgênicas, com a inserção de uma a três cópias do transgene em seus genomas. Algumas delas apresentaram elevados níveis de expressão do transcrito. Todas essas plantas foram propagadas via enxertia em limoeiro Cravo e estão praticamente prontas para serem desafiadas com ninfas de D. citri. Esse é o primeiro esforço para a produção de citrus Bt visando ao manejo do HLB dos citros. / Diaphorina citri is the insect vector of Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of huanglongbing (HLB), the most devastating disease of citrus worldwide, due to the severe losses it induces and the lack of commercial resistant genotypes. For this reason, strategies have been sought to assist in the control of the insect vector, nowadays done almost exclusively with the use of excessive applications of agrochemicals that increase the cost of production and potentiate the aggression to the environment. It has been envisioned the development of transgenic plants that increase the defense response of the plant against Ca. Liberibacter spp. or the vector more effectively, by targeting the expression of target genes in specific tissues, controlled by phloem or constitutive promoters. Our group has sought strategies not yet used in citrus, but effective for other crops, such as the use of the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) for the control of D. citri. This bacterium stands out due to the production of proteins with insecticidal activity against several immature phases of insects, so it has been widely used both in the production of bioinsecticides and mainly in the production of transgenic plants in crops such as cotton, corn and soybean. In previous work, we have identified that the cry11 gene encodes a toxin capable of causing high mortality of citrus psyllid nymphs 120 hours after inoculation in citrus seedlings. This gene was cloned for expression in sweet orange plant tissue under the guidance of two promoters, one phloem specific and the other constitutive. Nineteen transgenic plants were obtained, with the insertion of one to three copies of the transgene into their genomes. Some of them had high levels of transcript expression. All these plants were propagated via grafting in Clove lemon tree and are practically ready to be challenged with D. citri nymphs. This is the first effort to produce citrus Bt for the management of citrus HLB.