Diaphorina citri é o inseto vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., causadoras do huanglongbing (HLB), doença que tem causado sérios danos e grandes perdas econômicas à citricultura mundial, pois acomete todas as variedades comerciais de citros e não existem genótipos comerciais resistentes. Por esta razão, têm-se buscado estratégias que auxiliem no controle do inseto vetor, hoje feito quase que exclusivamente com o uso de excessivas aplicações de agroquímicos que aumentam o custo de produção e potencializam a agressão ao meio ambiente. Tem-se vislumbrado o desenvolvimento de plantas transgênicas que aumentem a resposta de defesa da planta contra Ca. Liberibacter spp. ou o vetor de forma mais efetiva, pelo direcionamento da expressão de genes alvo em tecidos específico, controlados por promotores de floema ou constitutivo. Nosso grupo tem buscado estratégias ainda não utilizadas em citros, mas efetivas para outras culturas, como o uso da bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Bt) para o controle de D. citri. Essa bactéria se destaca devido à produção de proteínas com atividades inseticidas contra diversas fases imaturas de insetos, por isso tem sido amplamente utilizada tanto na produção de bioinseticidas quanto, principalmente, na produção de plantas transgênicas em culturas como algodão, milho e soja. Em trabalhos anteriores, identificamos que o gene cry11 codifica uma toxina capaz de causar elevada mortalidade em ninfas do psilídeo dos citros 120 horas após sua inoculação em seedlings de citros. Este gene foi clonado para a expressão em tecido de plantas de laranja doce sob o direcionamento de dois promotores, um específico de floema e o outro constitutivo. Foram obtidas 19 plantas transgênicas, com a inserção de uma a três cópias do transgene em seus genomas. Algumas delas apresentaram elevados níveis de expressão do transcrito. Todas essas plantas foram propagadas via enxertia em limoeiro Cravo e estão praticamente prontas para serem desafiadas com ninfas de D. citri. Esse é o primeiro esforço para a produção de citrus Bt visando ao manejo do HLB dos citros. / Diaphorina citri is the insect vector of Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of huanglongbing (HLB), the most devastating disease of citrus worldwide, due to the severe losses it induces and the lack of commercial resistant genotypes. For this reason, strategies have been sought to assist in the control of the insect vector, nowadays done almost exclusively with the use of excessive applications of agrochemicals that increase the cost of production and potentiate the aggression to the environment. It has been envisioned the development of transgenic plants that increase the defense response of the plant against Ca. Liberibacter spp. or the vector more effectively, by targeting the expression of target genes in specific tissues, controlled by phloem or constitutive promoters. Our group has sought strategies not yet used in citrus, but effective for other crops, such as the use of the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) for the control of D. citri. This bacterium stands out due to the production of proteins with insecticidal activity against several immature phases of insects, so it has been widely used both in the production of bioinsecticides and mainly in the production of transgenic plants in crops such as cotton, corn and soybean. In previous work, we have identified that the cry11 gene encodes a toxin capable of causing high mortality of citrus psyllid nymphs 120 hours after inoculation in citrus seedlings. This gene was cloned for expression in sweet orange plant tissue under the guidance of two promoters, one phloem specific and the other constitutive. Nineteen transgenic plants were obtained, with the insertion of one to three copies of the transgene into their genomes. Some of them had high levels of transcript expression. All these plants were propagated via grafting in Clove lemon tree and are practically ready to be challenged with D. citri nymphs. This is the first effort to produce citrus Bt for the management of citrus HLB.

Submitted by Patrícia Aparecida de Carvalho Felisberto (pa_carvalho@ymail.com) on 2018-11-08T19:56:30Z No. of bitstreams: 1 Tese Patrícia Versão online.pdf: 2228261 bytes, checksum: 89c38e258ad3447be819bce9d86a335a (MD5) / Rejected by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: 1- O agradecimento à CAPES deve ter a seguinte redação: O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Agradecemos a compreensão. on 2018-11-09T17:12:01Z (GMT) / Submitted by Patrícia Aparecida de Carvalho Felisberto (pa_carvalho@ymail.com) on 2018-11-12T09:35:21Z No. of bitstreams: 1 Tese Patrícia Versão online.pdf: 2429963 bytes, checksum: addf9a608efce9e12bc9ff713f0e6408 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-11-12T17:10:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 felisberto_pac_dr_jabo.pdf: 2429963 bytes, checksum: addf9a608efce9e12bc9ff713f0e6408 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-12T17:10:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 felisberto_pac_dr_jabo.pdf: 2429963 bytes, checksum: addf9a608efce9e12bc9ff713f0e6408 (MD5) Previous issue date: 2018-09-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Huanglongbing (HLB) é a doença mais devastadora dos citros. Está associada a bactérias de floema disseminadas eficientemente pelo psilídeo Diaphorina citri, inseto altamente prolífico e com ampla gama de hospedeiros dentre as rutáceas. Diversas espécies desta família ocorrem em matas onde o inseto poderia estar se reproduzindo e reinfestando pomares além de servir como fonte de multiplicação de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), dificultando o controle do HLB. Nesse sentido foram realizados dois estudos, sendo o primeiro para avaliar a sobrevivência de D. citri em folhas jovens recém-diferenciadas e totalmente expandida e a reprodução de D. citri em brotos em 20 espécies de rutáceas. E o segundo para avaliar a reação dessas espécies após inoculação do patógeno por meio de enxertia de tecidos infectados e uso de adultos infectivos de D. citri. No primeiro, classificou-se as espécies quanto a favorabilidade em reproduzir D. citri em quatro grupos de plantas: Grupo I (altamente favorável ao inseto) incluiu Citrus ×aurantium 'Valência', Citrus limonia, Murraya paniculata (syn. Murraya exotica L.) (Aurantioideae: Aurantieae) e Bergera koenigii (Aurantioideae: Clauseneae). As espécies do Grupo II (de intermédiio a baixa favorabilidade) incluiu Citrus (Poncirus) trifoliata ‘Pomeroy’, Citrus wintersii, Swinglea glutinosa (Aurantieae) e Clausena lansium (Clauseneae). O grupo III (não favorável) incluiu Aegle marmelos, Atalantia buxifolia e Citrus (‘Microcitrus’) sp. (Aurantieae) e Helietta apiculata (Amyridoideae). O grupo IV (não hospedeiro) incluiu Glycosmis pentaphylla (Clauseneae), Balfourodendron riedelianum, Casimiroa edulis, Esenbeckia febrifuga, Esenbeckia leiocarpa, Metrodorea stipularis, Zanthoxylum rhoifolium (Amyridoideae) e Dictyoloma vandellianum (Cneoroideae). Os insetos sobreviveram por mais tempo em folhas jovens recém-diferenciadas do que em folhas totalmente expandidas. No segundo, confirmou-se a suscetibilidade de laranjeira ‘Valência’ em multiplicar CLas. Quando a inoculação foi por enxertia C. trifoliata ‘Pomeroy’ tornou-se mais suscetível à multiplicação da bactéria e a ausência de sintomas não significa que a planta não esteja infectada por CLas. B. koenigii não multiplica CLas e M. paniculata não favorece a multiplicação de CLas tanto quanto os citros. G. pentaphylla não é uma espécie favorável a multiplicação de CLas. Z. rhoifolium, E. febrifuga, E. leiocarpa, M. stipularis, B. riedelianum e D. vandellianum ocorrem quase que exclusivamente em matas brasileiras próximas a áreas de produção comercial de citros e não apresentam risco para aumento da incidência de HLB. Por fim, acredita-se que as principais fontes de inóculo de CLas e D. citri são principalmente pomares de citros abandonados, mal manejados ou ainda plantas de citros existentes em fundos de quintais e chácaras sem manejo. M. paniculata é importante hospedeiro do vetor e portanto quando próximas de citros o problema seria o grande número de psilídeos se movimentando entre as plantas de M. paniculata e citros, infectados e saudáveis. / Huanglongbing (HLB) is the most devastating disease of citrus. It is associated with phloem bacteria efficiently disseminated by the psilid Diaphorina citri, a highly prolific insect with a wide range of hosts among the rutaceous. Several species of this family occur in forests where the insect could be reproducing and reinfesting orchards besides serving as a source of multiplication of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), hindering the control of HLB. In this sense, two investigations were carried out, the first one to evaluate the survival of D. citri on newly differentiated and fully-expanded soft leaves and the shoots reproduction of D. citri in 20 species of rutaceous. And the second to evaluate the reaction of these species after inoculation of the pathogen by grafting of infected tissues and use of infective adults of D. citri. In the first, this allowed suitability of the plants as hosts of the psyllid to be separated into 4 groups of plants. Group I (highly suitable to the insect) species included Citrus ×aurantium ‘Valencia’, Citrus limonia, and Murraya paniculata (syn. Murraya exotica L.) (Aurantioideae: Aurantieae), and Bergera koenigii (Aurantioideae: Clauseneae). Group II (intermediate to low suitability) species included Citrus (Poncirus) trifoliata ‘Pomeroy’, Citrus wintersii, and Swinglea glutinosa (Aurantieae), and Clausena lansium (Clauseneae). Group III (not suitable) included Aegle marmelos, Atalantia buxifolia, and Citrus (‘Microcitrus’) sp. (Aurantieae), and Helietta apiculata (Amyridoideae). Group IV (non-hosts) included Glycosmis pentaphylla (Clauseneae), Balfourodendron riedelianum, Casimiroa edulis, Esenbeckia febrifuga, Esenbeckia leiocarpa, Metrodorea stipularis, Zanthoxylum rhoifolium (Amyridoideae) and Dictyoloma vandellianum (Cneoroideae). The insects survived longer on newly differentiated than fully-expanded soft leaves. In the second, the susceptibility of 'Valencia' orange tree in multiplying CLas was confirmed. When the inoculation was by grafting C. trifoliata 'Pomeroy' becomes more susceptible to multiplication of the bacteria and the absence of symptoms does not mean that the plant is not infected by CLas. B. koenigii does not multiplicate CLas and M. paniculata does not multiplicate CLas as much as citrus. G. pentaphylla is not a good species to CLas multiplication. Z. rhoifolium, E. febrifuga, E. leiocarpa, M. stipularis, B. riedelianum and D. vandellianum occur almost exclusively in Brazilian forests near of citrus commercial production areas and do not represent a risk for HLB incidence increasing. Finally, it is believed that the main inoculum sources of CLas and D. citri are mainly abandoned citrus orchards, poorly managed or even citrus plants existing in backyards and unmanaged small farms. M. paniculata is an important host of the vector and therefore when close to citrus the problem would be the large number of psyllids moving between M. paniculata and citrus infected and healthy orchards.

Orientador: Silvio Aparecido Lopes / Resumo: Huanglongbing (HLB) é a doença mais devastadora dos citros. Está associada a bactérias de floema disseminadas eficientemente pelo psilídeo Diaphorina citri, inseto altamente prolífico e com ampla gama de hospedeiros dentre as rutáceas. Diversas espécies desta família ocorrem em matas onde o inseto poderia estar se reproduzindo e reinfestando pomares além de servir como fonte de multiplicação de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), dificultando o controle do HLB. Nesse sentido foram realizados dois estudos, sendo o primeiro para avaliar a sobrevivência de D. citri em folhas jovens recém-diferenciadas e totalmente expandida e a reprodução de D. citri em brotos em 20 espécies de rutáceas. E o segundo para avaliar a reação dessas espécies após inoculação do patógeno por meio de enxertia de tecidos infectados e uso de adultos infectivos de D. citri. No primeiro, classificou-se as espécies quanto a favorabilidade em reproduzir D. citri em quatro grupos de plantas: Grupo I (altamente favorável ao inseto) incluiu Citrus ×aurantium 'Valência', Citrus limonia, Murraya paniculata (syn. Murraya exotica L.) (Aurantioideae: Aurantieae) e Bergera koenigii (Aurantioideae: Clauseneae). As espécies do Grupo II (de intermédiio a baixa favorabilidade) incluiu Citrus (Poncirus) trifoliata ‘Pomeroy’, Citrus wintersii, Swinglea glutinosa (Aurantieae) e Clausena lansium (Clauseneae). O grupo III (não favorável) incluiu Aegle marmelos, Atalantia buxifolia e Citrus (‘Microcitrus’) sp. (Aurantieae... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Huanglongbing (HLB) is the most devastating disease of citrus. It is associated with phloem bacteria efficiently disseminated by the psilid Diaphorina citri, a highly prolific insect with a wide range of hosts among the rutaceous. Several species of this family occur in forests where the insect could be reproducing and reinfesting orchards besides serving as a source of multiplication of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), hindering the control of HLB. In this sense, two investigations were carried out, the first one to evaluate the survival of D. citri on newly differentiated and fully-expanded soft leaves and the shoots reproduction of D. citri in 20 species of rutaceous. And the second to evaluate the reaction of these species after inoculation of the pathogen by grafting of infected tissues and use of infective adults of D. citri. In the first, this allowed suitability of the plants as hosts of the psyllid to be separated into 4 groups of plants. Group I (highly suitable to the insect) species included Citrus ×aurantium ‘Valencia’, Citrus limonia, and Murraya paniculata (syn. Murraya exotica L.) (Aurantioideae: Aurantieae), and Bergera koenigii (Aurantioideae: Clauseneae). Group II (intermediate to low suitability) species included Citrus (Poncirus) trifoliata ‘Pomeroy’, Citrus wintersii, and Swinglea glutinosa (Aurantieae), and Clausena lansium (Clauseneae). Group III (not suitable) included Aegle marmelos, Atalantia buxifolia, and Citrus (‘Microcitrus’) sp. (Auran... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Diaphorina citri é o inseto vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., causadoras do huanglongbing (HLB), doença que tem causado sérios danos e grandes perdas econômicas à citricultura mundial, pois acomete todas as variedades comerciais de citros e não existem genótipos comerciais resistentes. Por esta razão, têm-se buscado estratégias que auxiliem no controle do inseto vetor, hoje feito quase que exclusivamente com o uso de excessivas aplicações de agroquímicos que aumentam o custo de produção e potencializam a agressão ao meio ambiente. Tem-se vislumbrado o desenvolvimento de plantas transgênicas que aumentem a resposta de defesa da planta contra Ca. Liberibacter spp. ou o vetor de forma mais efetiva, pelo direcionamento da expressão de genes alvo em tecidos específico, controlados por promotores de floema ou constitutivo. Nosso grupo tem buscado estratégias ainda não utilizadas em citros, mas efetivas para outras culturas, como o uso da bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Bt) para o controle de D. citri. Essa bactéria se destaca devido à produção de proteínas com atividades inseticidas contra diversas fases imaturas de insetos, por isso tem sido amplamente utilizada tanto na produção de bioinseticidas quanto, principalmente, na produção de plantas transgênicas em culturas como algodão, milho e soja. Em trabalhos anteriores, identificamos que o gene cry11 codifica uma toxina capaz de causar elevada mortalidade em ninfas do psilídeo dos citros 120 horas após sua inoculação em seedlings de citros. Este gene foi clonado para a expressão em tecido de plantas de laranja doce sob o direcionamento de dois promotores, um específico de floema e o outro constitutivo. Foram obtidas 19 plantas transgênicas, com a inserção de uma a três cópias do transgene em seus genomas. Algumas delas apresentaram elevados níveis de expressão do transcrito. Todas essas plantas foram propagadas via enxertia em limoeiro Cravo e estão praticamente prontas para serem desafiadas com ninfas de D. citri. Esse é o primeiro esforço para a produção de citrus Bt visando ao manejo do HLB dos citros. / Diaphorina citri is the insect vector of Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of huanglongbing (HLB), the most devastating disease of citrus worldwide, due to the severe losses it induces and the lack of commercial resistant genotypes. For this reason, strategies have been sought to assist in the control of the insect vector, nowadays done almost exclusively with the use of excessive applications of agrochemicals that increase the cost of production and potentiate the aggression to the environment. It has been envisioned the development of transgenic plants that increase the defense response of the plant against Ca. Liberibacter spp. or the vector more effectively, by targeting the expression of target genes in specific tissues, controlled by phloem or constitutive promoters. Our group has sought strategies not yet used in citrus, but effective for other crops, such as the use of the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) for the control of D. citri. This bacterium stands out due to the production of proteins with insecticidal activity against several immature phases of insects, so it has been widely used both in the production of bioinsecticides and mainly in the production of transgenic plants in crops such as cotton, corn and soybean. In previous work, we have identified that the cry11 gene encodes a toxin capable of causing high mortality of citrus psyllid nymphs 120 hours after inoculation in citrus seedlings. This gene was cloned for expression in sweet orange plant tissue under the guidance of two promoters, one phloem specific and the other constitutive. Nineteen transgenic plants were obtained, with the insertion of one to three copies of the transgene into their genomes. Some of them had high levels of transcript expression. All these plants were propagated via grafting in Clove lemon tree and are practically ready to be challenged with D. citri nymphs. This is the first effort to produce citrus Bt for the management of citrus HLB.

O aumento da incidência da doença huanglonbing (HLB) nos pomares brasileiros tem contribuído significativamente para o aumento do custo de produção de laranja no Brasil, devido à suscetibilidade de todas as variedades cultivadas. O HLB é associado às bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus, transmitidas pelos psilídeos Diaphorina citri e Trioza erytreae. No Brasil, o inseto vetor responsável pela rápida disseminação da doença é o psilídeo Diaphorina citri. Os principais métodos de controle do HLB são a eliminação de plantas sintomáticas, uso de mudas sadias e controle do vetor. O uso de plantas geneticamente modificadas pode ser uma alternativa ao uso excessivo de inseticidas para controle do inseto vetor. Sendo assim, pode-se adotar uma nova tecnologia que se baseia no uso de RNAs de interferência (RNAi) para o silenciamento de genes específicos do inseto vetor. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do silenciamento dos genes calreticulina (DcCRT), lacase (DcLAC) e Snf7 (DcSNF7) de Diaphorina citri por RNA de interferência via alimentação em folhas destacadas de Murraya paniculata que absorveram solução contendo dsRNA de silenciamento. A princípio, foi avaliada a expressão dos genes candidatos em diferentes estádios fenológicos dos insetos. Em seguida, foram realizados bioensaios de sobrevivência e silenciamento, com as doses 0, 5, 25 e 50µg de dsRNA. A sobrevivência dos insetos foi avaliada ao longo de 144 horas, enquanto que os insetos utilizados na análise de expressão gênica foram coletados 12, 24, 48, 72 e 96h após o início da alimentação. Para os genes DcCRT, relacionado à quelatização de íons cálcio, e DcLAC, relacionado à gelificação oxidativa do estilete, ambos envolvidos no processo alimentar do inseto, também foi observado o efeito das doses de dsRNA na quantidade de alimento ingerido, 120h após o início da alimentação. Além disso, também foi realizado bioensaio com dsRNA Cy3-labbled, para verificar a distribuição do dsRNA absorvido. A expressão dos genes candidatos, de modo geral, se manteve uniforme ao longo dos estádios de desenvolvimento dos insetos, exceto para o gene DcLAC que apresentou maior expressão em adultos recém emergidos do que nos demais estádios avaliados. Nos bioensaios com dsRNA de silenciamento, observou-se fenótipo letal apenas com o silenciamento do gene DcSnf7, 144 horas após o início da alimentação. Durante o período avaliado, foi constatada redução na expressão gênica apenas de DcCRT, após 12h de alimentação e DcLAC após 96h de alimentação com seus respectivos dsRNA de silenciamento. Além disso, a dose de 5µg de dsRNA foi suficiente para causar tal efeito de silenciamento gênico. No bioensaio para quantificação da alimentação, observou- se redução na excreção de aminoácidos nos insetos alimentados com 5µg de dsRNA, em ambos os genes candidatos (DcCRT e DcLAC) 120h após o início da alimentação. Adicionalmente, a análise de distribuição de dsRNA pela folha mostrou que há absorção do dsRNA pela folha destacada, permitindo a alimentação pelo inseto. Dessa forma, conclui-se que os genes estudados apresentam potencial para o controle do psilídeo Diaphorina citri, via silenciamento gênico por RNAi. / The increase in the incidence of huanglonbing disease (HLB) in Brazilian orchards has contributed to increase of orange production costs in Brazil, due to the susceptibility of all cultivated variety of orange. HLB is associated with the Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus and Candidatus Liberibacter americanus bacteria, transmitted by the psyllids Diaphorina citri and Trioza erytreae. In Brazil, the insect vector responsible for the rapid spread of the disease is Diaphorina citri. The most important methods of HLB control are the elimination of symptomatic plants, the use of healthy nursery trees, and vector control. The use of genetically modified plants may be an alternative to the excessive use of insecticides to control the insect vector. Therefore, a new technology based on using RNAs of interference (RNAi), for silencing specific genes of the insect vector can be used. Thus, the aim of this work was to evaluate the effect of silencing calreticulin (DcCRT), laccase (DcLAC) and Snf7 (DcSNF7) genes in Diaphorina citri by interference RNA through feeding in leaves of Murraya paniculata that absorbed a solution containing dsRNA of silencing. At first, the expression of the candidate genes in different phenological stages of the insects was evaluated. Survival and silencing bioassays were then performed at doses of 0, 5, 25 and 50 µg of dsRNA. Insect survival was evaluated over 144 hours, while the insects used in gene expression analysis were collected 12, 24, 48, 72 and 96 hours after feeding. For the DcCRT genes, associated to the calcium ion chelation, and DcLAC, related to the oxidative gelling of the stylet, both involved in the insect feed process, the effect of the doses of dsRNA on the amount of food ingested, 120h after the beginning of feeding was observed. In addition, a bioassay with Cy3-labbled dsRNA was also performed to verify the distribution of absorbed dsRNA. The expression of the candidate genes generally remained uniform throughout the stages of insect development, except for the DcLAC gene that showed greater expression in newly emerged adults than in the other evaluated stages. In the bioassays with dsRNA for gene silencing, a lethal phenotype was observed only with the silencing of the DcSnf7 gene, 144 hours after the beginning of feeding. During the evaluated period, there was a reduction in the gene expression only of DcCRT, after 12h of feed and DcLAC after 96h of feeding with their respective silencing dsRNA. Additionally, the dose of 5µg of dsRNA was enough to cause this gene silencing effect. In the bioassay for feeding quantification, a reduction in amino acid excretion was observed in insects fed with 5 µg of dsRNA, in both candidate genes (DcCRT and DcLAC) 120 h after the beginning of feeding. In addition, the analysis of dsRNA distribution by the leaf showed that there is absorption of the dsRNA by the detached leaf, allowing feeding by the insect. Thus, we conclude that the genes studied have potential for the control of the psyllid Diaphorina citri, through gene silencing mediated by RNAi.

Atualmente, o controle da doença Huanglongbing (HLB) ou greening é baseado, principalmente, no controle químico do inseto vetor Diaphorina citri, realizado por meio de aplicações intensivas de produtos químicos, o que vem causando surtos de pragas secundárias, ressurgência de pragas, seleção de população resistente e eliminação dos inimigos naturais. Com esse trabalho, objetivou-se avaliar a possibilidade da utilização da planta de curry (Murraya koenigii) como planta-isca para o manejo do psilídeo D. citri. Para isso, foram realizados os seguintes testes: i) teste de transmissão de \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' para determinar se a planta de curry não é hospedeira da bactéria; ii) teste de comportamento de escolha, para verificar a preferência hospedeira de D. citri em plantas de curry em relação a citros; iii) teste de comportamento alimentar do psilídeo por meio da técnica de Electrical Penetration Graphs (EPG) em plantas de curry, visando entender a alimentação do inseto nessa planta; iv) seleção de inseticidas sistêmicos para uso em plantas de curry, determinando o período residual e eficiência; e v) teste com plantio-isca em um talhão de citros, no qual foram instaladas plantas de curry em frente as plantas de citros e o psilídeo foi monitorado com o uso de armadilhas adesivas amarelas. Como resultado, observouse que a planta de curry não é hospedeira da bactéria \'Ca. L. asiaticus\' por meio da inoculação pelo psilídeo D. citri, e, em teste de livre escolha e de olfatômetro, é mais atrativa para o psilídeo do que a planta de citros, em condições laboratoriais. O comportamento alimentar do psilídeo em plantas de curry é diferente do que em citros e murta, sendo que o consumo da seiva do xilema em plantas de curry é maior. Além disso, inseticidas aplicados via \'drench\', como thiamethoxam e imidacloprid, nessa planta, são eficientes contra D. citri, pois controlam o psilídeo adulto por mais de 70 dias após a aplicação e, no campo, a captura de espécimes nas parcelas com a planta de curry foi maior, podendo concluir, portanto, que a planta de curry M. koenigii apresenta potencial para ser utilizada como plantio isca para manejo do psilídeo D. citri e, consequentemente, da doença HLB. / Currently, the control of the disease Huanglongbing (HLB) or greening is based mainly on the chemical control of the insect vector Diaphorina citri, through intensive applications of insecticides, which has been causing secondary pest outbreaks, pest resurgence, selection of population resistant and elimination of natural enemies. The goal of this work was to evaluate the possibility of using the curry leaf (Murraya koenigii) as a trap crop for the management of the D. citri. For this, the following tests have been performed: i) Transmission test of \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' to determine if the curry leaf is not a host for the bacterium; ii) test of choice behavior, to verify the host preference of D. citri to curry leaves in relation to citrus plants; iii) test of probing behavior in curry leaf using the Electrical Penetration Graphs (EPG) technique, in order to understand the feeding of the insect on this plant; iv) selection of systemic insecticides for use in curry leaf, determining the residual period and efficiency; and v) test with trap crop in a citrus orchard, in which curry plants were installed in front of the citrus plants and the psyllid was monitored with the yellow stick traps. As a result, it has been observed that the curry leaf is not a host to \'Ca. L. asiaticus\' by the D. citri inoculation and, in a free choice and olfactometer test, is more attractive to the psyllid than the citrus plant under laboratory conditions. The probing behavior of the psyllid in curry leaf is different from citrus and orange jasmine, being the ingestion of xylem sap in curry leaf higher. In addition, the insecticides applied by \'drench\' such as thiamethoxam and imidacloprid in these plants are efficient against D. citri for more than 70 days after application and, in the field, the capture of psyllids in the plots with the curry leaf was higher and could therefore conclude that, the curry leaf M. koenigii is a potencial plant to be used as a trap crop for the management of D. citri and consequently, the disease HLB.

Uma das principais doenças da citricultura é o Huanglongbing (HLB, Greening). Não há métodos curativos para o manejo do HLB e minimizam-se seus danos com a eliminação de plantas com sintomas da doença e com o controle do inseto vetor. A manutenção de áreas com plantas doentes e sem o controle de D. citri resulta em risco para a viabilidade econômica de pomares nos quais são empregadas essas estratégias de controle. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar o progresso temporal de plantas com sintomas de HLB, a distribuição espacial dessas plantas e seu vetor, a dinâmica populacional de D. citri e estimar o número de armadilhas adesivas amarelas para detecção de adultos do vetor. Os dados de campo foram obtidos de três áreas destinadas à produção de citros, que realizavam o controle para o vetor, e outras duas áreas vizinhas que tinham plantas cítricas sem esse controle. Essas áreas foram amostradas de 2012 a 2016 com o emprego de armadilhas adesivas amarelas. As frequências de captura de D. citri, as médias de adultos/armadilha e as incidências de plantas com HLB, foram maiores em lotes vizinhos de áreas não comerciais, em comparação com lotes vizinhos de áreas comerciais regularmente pulverizadas com inseticidas. As áreas comerciais apresentaram médias de 0,01 a 0,05 adulto/armadilha, enquanto as áreas não comerciais apresentaram médias de 0,20 a 1,32 adulto/armadilha. A proporção desses adultos detectados como bacterilíferos variou de 18% a 72%. Os adultos de D. citri foram detectados quase que exclusivamente em armadilhas localizadas nas bordas dos lotes, em comparação com armadilhas colocadas internamente. Oitenta porcento das plantas com HLB estavam até 80 a 160 metros da borda. O modelo exponencial negativo se ajustou aos dados referente à proporção de plantas com HLB em função da distância da borda, com valores do coeficiente angular de 0,01 a 0,02. Plantas com HLB detectadas nesses lotes apresentaram-se distantes entre si até 90,7 metros, indicando que a infecção das plantas foi relacionada à dispersão de adultos de D. citri provenientes de áreas externas. Estimativas precisas para a média de adultos/armadilha exigem o emprego de dezenas a centenas de armadilhas, o que torna esse procedimento impraticável em áreas regularmente pulverizadas com inseticidas. Os modelos de progresso temporal logístico e de Gompertz se ajustaram à maioria dos dados de proporção de plantas com HLB, com taxas de progresso de 0,43 a 1,18 para o modelo logístico e 0,01 a 0,46 para o modelo de Gompertz. Áreas comerciais, mantidas sem a eliminação frequente de plantas com HLB, mas com controle frequente do vetor, podem ser menos importantes como fontes de inóculo do HLB que plantas não comercias, infectadas e sem tratamentos com inseticidas, o que exige ações adicionais, destinadas às áreas não comerciais, na tentativa de se reduzir as infecções primárias de HLB. / Citrus Huanglongbing, also called HLB or Greening, is one of the most important diseases of citrus. There are no curative methods for HLB management. By consequence, roguing and vector control are recommended measures to prevent new infections. The maintenance of areas with infected trees and without D. citri control put under risk the viability of orchards in which HLB control strategies are employed. The objectives of this work were to evaluate the temporal progress of HLB-symptomatic trees, the spatial distribution of HLB-symptomatic trees and its vector, the population dynamics of D. citri and to estimate the number of yellow sticky traps for adult detection. Data were obtained from three commercial areas where HLB were under management by roguing and insecticide sprays, and two additional neighboring areas without HLB control. All areas were sampled from 2012 to 2016 and adults of psyllid vector were sampled by yellow traps. The capture frequencies of D. citri, the average of adults/trap, and the incidences of HLB-symptomatic plants were higher in plots neighboring non-commercial areas, compared to plots neighboring commercial areas regularly sprayed with insecticides. Commercial areas presented averages ranging from 0.01 to 0.05 adult/trap, while non-commercial areas presented averages between 0.20 to 1.32 adult/trap. The proportion of bacteriliferous adults ranged from 18% to 72%. Adults of D. citri were detected almost exclusively in traps located on the edge of the plots, compared to traps placed internally. Eighty percent of the plants with HLB were distant up to 80 to 160 meters from the edge. The negative exponential model was adjusted to the data concerning the proportion of plants with HLB as a function of distance from the edge, with values of the angular coefficient from 0.01 to 0.02. Affected plants detected in those plots were distant to each other up to 90.7 meters, indicating that infection process was related to D. citri adults from external areas. Precise estimates of adults/trap require the adoption of tens to hundred traps per plot, which makes this procedure impractical in areas regularly sprayed with insecticides. Logistic and Gompertz models fitted for the majority of affected plants proportion data. Rates ranged from 0.43 to 1.18 for Logistic and 0.01 to 0.46 for Gompertz model. Commercial areas, maintained without frequent HLB-plant eradication, but with regular vector control, maybe are less important as HLB sources of inoculum than non-commercial HLB-infected plants, never treated with insecticides, which requires additional efforts to attempt a reduction on the primary spread of HLB.

A pesquisa teve por objetivo determinar o desenvolvimento, o número de gerações e a constante térmica de Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Liviidae) e Tamarixia radiata (Waterston, 1922) (Hymenoptera: Eulophidae), sob 20 combinações de temperaturas alternantes que simulam as condições de Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo e Votuporanga, áreas citrícolas do estado de São Paulo, nas quatro estações do ano. Paralelamente, discutem-se as estimativas dos períodos de liberação do parasitoide associados ao alerta fitossanitário desenvolvido pelo FUNDECITRUS. Foi estudado o desenvolvimento de D. citri e T. radiata, sendo registrado o tempo necessário para completarem o ciclo biológico. A partir destes dados, foi calculada a constante térmica e o número de gerações da praga e do parasitoide para cada uma das condições propostas. Com base na duração do desenvolvimento de D. citri, foi definido o momento ideal para liberação de T. radiata em campo. Os resultados da determinação do número de gerações de D. citri e de T. radiata, baseando-se em temperaturas alternantes, foram comparáveis ao modelo desenvolvido em temperaturas constantes, sendo que as variações existentes entre os dois modelos se deveram à inclusão do período de pré-oviposição que foi variável em função da temperatura. A previsão do número de gerações se ajustou mais a T. radiata do que a D. citri, sendo propostos fatores de correção para casos em que a constante térmica observada superou 10- 15% do valor determinado em laboratório. Observou-se que uma geração de D. citri variou de 22,9 a 74,2 dias, no verão e inverno para as simulações de Votuporanga e Tatuí, respectivamente; por outro lado, nas mesmas condições, uma geração de T. radiata pode variar de 9,8 a 21,6 dias. A relação entre o número de gerações de D. citri: T. radiata no decorrer do ano é superior a 1:2, sendo de 1: 2,58; 1: 2,47; 1: 2,28; 1: 2,28; 1: 2,34, respectivamente, para as simulações de Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo e Votuporanga. A regressão linear mostrou que o número de gerações de D. citri é melhor explicado pela média das temperaturas diurna e noturna, enquanto que para T. radiata, apenas pela temperatura diurna. Os valores extremos de dias para liberação de T. radiata após o alerta fitossanitário, correspondem às regiões de Avaré e Bebedouro. Os resultados indicam que há uma variação no desenvolvimento da praga e do seu parasitoide entre as regiões e que há necessidade de validação em campo; no entanto, se confirmados, permitirão o uso mais eficiente do parasitoide T. radiata, se tornando um componente auxiliar ao sistema de alerta e ao Manejo Integrado dessa importante doença, o HLB. / This study determined the development, number of generations and thermal constant of the HLB vector Diaphorina citri Kuwayama, 1908 (Hemiptera: Liviidae) and the parasitoid Tamarixia radiata (Waterston, 1922) (Hymenoptera: Eulophidae) under 20 combinations of alternating temperatures that simulated the conditions of five citrus-growing areas of São Paulo state (Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo and Votuporanga) in the four seasons. The estimated optimum release time of the parasitoid is discussed in relation to a phytosanitation alert developed by FUNDECITRUS. The development time and time needed to complete the life cycles of D. citri and T. radiata were assessed. The thermal constant and number of generations of the pest and parasitoid for each temperature condition were calculated based on these data. Based on the development time of D. citri, the optimum time to release T. radiata in the field was established. The estimated number of generations of D. citri and T. radiata in alternating temperatures was comparable to the model developed at constant temperatures; the differences between the two models were due to the inclusion of the pre-oviposition period, which varied as a function of temperature. The estimated number of generations was larger for T. radiata than D. citri, and correction factors were proposed for those cases in which the observed thermal constant exceeded 10-15% of the value determined in the laboratory. Generation times of D. citri ranged from 22.9 days in summer to 74.2 days in winter for the simulations for Votuporanga and Tatuí. Under the same conditions, one generation of T. radiata may range from 9.8 to 21.6 days. The ratio between the annual number of generations of D. citri: T. radiata was higher than 1: 2, ranging from 1: 2.58; 1: 2.47; 1: 2.28; 1: 2.28; 1: 2.34 for the simulations for Limeira, Tatuí, Araraquara, Santa Cruz do Rio Pardo and Votuporanga, respectively. Linear regression analysis showed that the number of generations of D. citri is best explained by the mean diurnal and nocturnal temperatures, whereas for T. radiata, only by the mean diurnal temperature. The extreme values for optimum release day of T. radiata after a phytosanitation alert were found for Avare and Bebedouro. The results indicate that the development of the pest and its parasitoid differ among areas, and there is need for validation in the field. However, if confirmed, these data will allow more efficient use of the parasitoid T. radiata as a complementary component of the alert system and of Integrated Management of HLB.

Submitted by JEANE DAYSE VELOSO DOS SANTOS (dayse_1990@hotmail.com) on 2018-06-06T00:38:43Z No. of bitstreams: 1 Tese.corrigidacx.pdf: 3031465 bytes, checksum: b0bb106972f6c8b900e9b70153d5c2dc (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-07T18:37:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pulici_jdvs_dr_jabo.pdf: 3031465 bytes, checksum: b0bb106972f6c8b900e9b70153d5c2dc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T18:37:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pulici_jdvs_dr_jabo.pdf: 3031465 bytes, checksum: b0bb106972f6c8b900e9b70153d5c2dc (MD5) Previous issue date: 2018-05-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Huanglongbing (HLB) é considerada a mais importante doença da citricultura mundial. No Brasil, está associada principalmente a bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), transmitida pelo inseto Diaphorina citri. Apesar da grande importância comercial, poucas são as informações sobre vários aspectos desta doença limeiras ácidas, inclusive o potencial que esta representa como fonte de inóculo para as laranjeiras. O objetivo do presente trabalho foi (i) avaliar a favorabilidade da limeira ácida ‘Tahiti’ à reprodução de D. citri e multiplicação de Las, (ii) caracterizar sintomas foliares e danos em raízes de plantas afetadas e (iii) avaliar, por meio de inoculações cruzadas, seu potencial como fonte de inóculo para a laranjeira ‘Valência’ e vice-versa. Ambos os hospedeiros estavam enxertados em limoeiro ‘Cravo’, com 2 anos de idade. O capítulo I contém revisão de literatura, o II estudo comparativo de plantas das duas hospedeiras como criadouro de D. citri e o III caracterização de sintomas foliares, danos em raízes e resultados das inoculações cruzadas, usando como inóculo borbulhas doentes e insetos infectivos. A ‘Tahiti’ foi menos favorável que a ‘Valência’ ao desenvolvimento do inseto. Nela as taxas de oviposição e sobrevivência de ninfas foram menores, ou seja, 59,7 e 48,5%, respectivamente, em relação à ‘Valência’ no primeiro experimento, e de 75,4 e 33,4% no segundo experimento. Em ‘Tahiti’ as manchas amarelas foliares foram mais intensas, porém os danos nas raízes similares aos observados em ‘Valência’. Uma escala fotográfica foi desenvolvida e mostrou-se útil na avaliação dos experimentos. Inesperadamente, diversas plantas experimentais estavam infectadas com Phytophthora spp., o que nos permitiu, embora em caráter preliminar, também avaliar possível influência deste patógeno na interação Las-citros. Na parte aérea, Phytophthora promoveu maiores títulos nas plantas inoculadas por enxertia, assim como estimulou a planta a exibir sintomas foliares mais cedo. No sistema radicular, este patógeno não favoreceu a colonização por Las, com exceção de ‘Tahiti’ inoculada com inóculo oriundo de ‘Tahiti’, independente do método de inoculação. Phytophthora não contribuiu para aumento dos danos em plantas com Las. De forma geral, plantas de ‘Valência’ foram colonizadas por Las, independente da fonte de inóculo e método de inoculação. A ‘Tahiti’, por sua vez, foi colonizada por Las oriunda de ambos os hospedeiros, porém somente quando inoculada por enxertia. A ‘Tahiti’ pode atuar como fonte de inóculo para si mesma e para laranjeiras. / Huanglongbing (HLB) is considered the most important disease of citrus worldwide. In Brazil, the bacterium most commonly associated with the disease is Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) transmitted by the insect Diaphorina citri. Despite the great commercial importance, little is known about the disease on acid limes. The objectives of this study were (i) to evaluate the favorability of the ‘Tahiti’ acid lime for the reproduction of D. citri and multiplication of Las, (ii) characterize foliar symptoms and root damage on infected plants and (iii) to evaluate, through cross inoculations, the potential that diseased ‘Tahiti’ represents as source of inoculum to sweet orange ‘Valencia’ and vice versa. Both hosts were two-year-old and growing on ‘Cravo’ Rangpur lime rootstock. Chapter I contains literature review, II a comparative study of the favorability of the two hosts for D. citri reproduction, and III a characterization of foliar symptoms, root damage and the results of cross inoculation experiments, using as inoculum diseased budsticks and infective insects. ‘Tahiti’ was less favorable than ‘Valencia’ to insect development. On these plants oviposition rates and nymph survival were, respectively, 59.7 and 48.5% of those on ‘Valencia’ in the first experiment, and 75.4 e 33.4 % in the second experiment. On ‘Tahiti’ the yellow leaf spots were more intense, but root damage like those on 'Valencia’. Unexpectedly, several experimental plants were infected with Phytophthora spp., which allowed us to assess the influence of this pathogen on Las-citrus interaction. On Phytophthora-infected plants inoculated by grafting, higher bacterium titers were detected on leaves, and the symptoms expressed earlier. This pathogen did not favor root colonization by Las, excepting ‘Tahiti’ that received inoculum of Las from ‘Tahiti', nor contributed to increase root damage. Overall, ‘Valencia’ was infected by Las, independently of the citrus variety source inoculum and method of inoculation. ‘Tahiti’, in turn, was infected by Las originated from both hosts, but only when inoculated by grafting. When exposed to infective insects, ‘Tahiti' became infected only when the source of inoculum was another ‘Tahiti’. Removal of diseased trees of ‘Tahiti’ (as of any other citrus) from commercial or noncommercial areas should be reinforced as crucial to the success of HLB control.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-22Bitstream added on 2014-06-13T19:23:51Z : No. of bitstreams: 1 leal_rm_dr_jabo.pdf: 4872255 bytes, checksum: 46bfab51f00e499d72157c3c120d648c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do trabalho foi verificar a distribuição espacial de ninfas e adultos de D. citri e sua relação com a expansão do greening em duas áreas cultivadas com laranjeiras, uma de quatro e outra de 12 anos de idade, de uma propriedade agrícola localizada no município de Matão-SP, utilizando geoestatística. Para determinar o número de psilídeos adultos, de ninfas e de plantas com greening foram realizadas avaliações periódicas no período de dezembro/2005 a novembro/2007. Realizou-se uma análise descritiva dos dados e, para verificar a distribuição espacial de adultos e ninfas de D. citri e das plantas com greening, utilizou-se a metodologia geoestatística, ajustando semivariogramas e criando mapas através de interpolação por krigagem. A maior incidência de adultos e ninfas de D. citri ocorreu no período de primavera e verão. A área com plantas de quatro anos de idade apresentou maior incidência de adultos e ninfas de D. citri quando comparada com a área com plantas de 12 anos de idade. A distribuição espacial de adultos e ninfas de D. citri e das plantas com greening foi agregada, com raio de agregação que variou de 55 a100 metros. Por meio da geoestatística observou-se a expansão do greening nas duas áreas de laranjeira Valência. Na área de 4 anos, houve maior incidência de psilídeos e uma maior expansão da doença, com um aumento de 1700% no número de plantas com greening, enquanto que na área de 12 anos, houve menor incidência do psilídeo, e o aumento no número de plantas com greening foi de 277,78%. / The aim of this study was to use geostatistics to verify the spatial distribution of adults and nymphs of D. citri and its relation with expansion greening in two areas sweet orange, at four years old and other the twelve years old, in a Farm located in the Matão, municipality - São Paulo, State. To determine the number of adults psyllid, nymphs and plants with greening symptoms, periodic assessments were done December 2005 until November 2007. A descriptive data analysis was undertaken, and geostatistics were used to verify the spatial distribution of adults and nymphs of D. citri and plants of greening symptoms through the adjustment of semivariograms and interpolation of data by kriging. The higher incidence of adults and nymphs of D. citri occurred in the Spring and Summer periods when there was not high precipitation. The area with plants the four years old showed higher incidence of adults and nymphs of D. citri when compeered with area the plants the twelve years old. The spatial distribution the adults and nymphs of D. citri and the plants with greening were aggregate forming a beam of aggregation of 55 to 100 m. Through geostatistics verified the greening expansion in two areas with ‘Valência’ sweet orange. In the area with plants the four years old, with higher incidence of adults and nymphs of D. citri there was increase of 1700% in the number of plants with greening, while in the area with plants the twelve years old, this increase was of 277,78%.