• Refine Query
  • Source
  • Publication year
  • to
  • Language
  • 1
  • 1
  • 1
  • Tagged with
  • 4
  • 4
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • 2
  • About
  • The Global ETD Search service is a free service for researchers to find electronic theses and dissertations. This service is provided by the Networked Digital Library of Theses and Dissertations.
    Our metadata is collected from universities around the world. If you manage a university/consortium/country archive and want to be added, details can be found on the NDLTD website.
1

MDCKII-bABCG2-Zellen: ein Modell zur Abschätzung der Anreicherung von Pflanzenschutzmitteln in der Milch

Kuhnert, Lydia 05 June 2019 (has links)
Einleitung Der intensive Einsatz von Pflanzenschutzmitteln in der konventionellen Landwirtschaft kann zum Eintrag von Rückständen in die Nahrungskette führen. Milchliefernde Rinder nehmen Pflanzenschutzmittelrückstände mit dem Futter auf, die durch aktive Sekretion in die Milch eine Gefährdung für sensible Bevölkerungsgruppen, wie Kinder, verursachen könnten. Die in nationalen Rückstandskontrollen untersuchten Milchproben unterschreiten zwar in der Regel die gesetzlich festgelegten Höchstgrenzen (Maximum Residue Level, MRL), jedoch kann eine andauernde Belastung mit Pflanzenschutzmitteln die Entstehung chronischer Erkrankungen, wie Morbus Parkinson und Kinderleukämie, fördern. Im Rindereuter stellt der ATP-binding cassette Transporter der Subfamilie G2 (ABCG2) den wichtigsten Transportweg für Fremdstoffe in die Milch dar. Mit seinem breiten Substratspektrum ist der bovine ABCG2-Transporter (bABCG2) in der Lage, unterschiedliche Substrate in die Kuhmilch zu transportieren. Jedoch ist bislang unklar, ob auch Pflanzenschutzmittel bABCG2-vermittelt in die Milch sezerniert werden können und ob die gleichzeitige Aufnahme mehrerer Rückstände die bABCG2-Effluxaktivität beeinflusst. Ziele der Untersuchungen Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Pflanzenschutzmitteln als mögliche Substrate des bovinen Effluxtransporters. Weiterhin wurde untersucht, ob zwischen zwei Wirkstoffen synergistische oder antagonistische Effekte am bABCG2-Transporter auftreten. Material und Methoden Es wurden 14 häufig in der konventionellen Landwirtschaft eingesetzte Pflanzenschutzmittel in 0,1-, 1- und 10-facher MRL-Konzentration, in Bezug auf essbare Gewebe von Rindern, untersucht. Weiterhin wurden sechs Kombinationen aus jeweils zwei Wirkstoffen ausgewählt. Im WST-1 (Water Soluble Tetrazolium 1) Assay wurden MDCKII-bABCG2-Zellen in aufsteigender Konzentration mit den Pflanzenschutzmitteln inkubiert (72 h) und die Zellvitalität ermittelt. Nach Inkubation der MDCKII-bABCG2- und MDCKII-Mock-Zellen mit den ausgewählten Pflanzenschutzmitteln oder den Kombinationen (4 h) wurde der Hoechst 33342-Akkumulationsassay durchgeführt. Dabei führt eine Interaktion des Pflanzenschutzmittels mit dem bABCG2-Transporter zu einer intrazellulären Anreicherung des Hoechst 33342-Farbstoffes. Für die Identifikation signifikanter Unterschiede wurden jeweils mindestens zwölf Monolayer auf Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) überprüft und eine Einweg-Varianzanalyse mit Holm-Šidák post hoc Test (p ≤ 0,05) durchgeführt. Ergebnisse Nachdem eine Beeinträchtigung der Zellvitalität durch die ausgewählten Pflanzenschutzmittel in 0,1- bis 10-facher MRL-Konzentration ausgeschlossen wurde, konnte im Hoechst 33342-Assay für Chlorpyrifos-methyl und Tebuconazol ab 0,1-facher MRL-Konzentration eine signifikante Zunahme der intrazellulären Hoechst 33342-Gehalte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nachgewiesen werden. Für Diflufenican, Glyphosat, Methiocarb, Prochloraz, Rimsulfuron sowie Thiacloprid konnte in 1- und 10-facher MRL-Konzentration und für Iprodion sowie Ioxynil in 10-facher MRL-Konzentration eine signifikant erhöhte Hoechst 33342-Anreicherung detektiert werden. Darüber hinaus führte eine gleichzeitige Applikation von Methiocarb und Chlorpyrifos-methyl in 1-facher MRL-Konzentration, sowie von Glyphosat und Rimsulfuron in 10-facher MRL-Konzentration zu einer synergistischen Steigerung der Farbstoffakkumulation. Schlussfolgerung Es konnte festgestellt werden, dass das MDCKII-Zellmodell in Kombination mit dem Hoechst 33342-Assay eine valide Methode darstellt, um Wechselwirkungen einzelner und kombinierter Pflanzenschutzmittel zu detektieren. Insgesamt konnten unterhalb gesetzlich festgelegter MRL-Werte acht Pflanzenschutzmittel als potentielle bABCG2-Substrate identifiziert, sowie additive Effekte von Wirkstoffkombinationen nachgewiesen werden. Durch die Aufnahme von Pflanzenschutzmitteln mit dem Futter könnten diese aktiv in die Milch sezerniert werden und somit eine Gefahr für den Verbraucher darstellen:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Überblick über Membrantransporter 4 2.2 ABCG2-Effluxtransporter 5 2.2.1 Überblick 5 2.2.2 Struktur 6 2.2.3 ABCG2-Transportmechanismus 8 2.2.4 Spezifität der ABCG2-Substrate und Inhibitoren 9 2.2.5 Gewebeexpression 11 2.2.6 Bedeutung 12 2.2.7 Regulation der ABCG2-Transportaktivität 14 2.3 Fremdstoffsekretion der bovinen Milchdrüse 16 2.3.1 Funktionelle Anatomie 16 2.3.2 Transportmechanismen 16 2.3.3 Fremdstofftransporter 17 2.3.4 Bedeutung des ABCG2-Transporters 19 2.4 Pestizide 20 2.4.1 Überblick 20 2.4.2 Einsatz von Pflanzenschutzmitteln 21 2.4.3 Rechtliche Regelungen 21 2.4.4 MRL-Wert-Festsetzung von Pestiziden 22 2.4.5 Exposition des Verbrauchers 23 2.4.6 Gesundheitliche Risiken 24 2.4.7 Pestizide als endokrine Disruptoren 25 2.4.8 Mehrfachrückstände 26 2.4.9 Risikobewertung von Mehrfachrückständen 27 2.5 Problemstellung und Zielsetzung 29 3 Material und Methoden 30 3.1 Material 30 3.1.1 Pestizide 30 3.1.2 Chemikalien 32 3.1.3 Kit 32 3.1.4 Puffer und Lösungen 32 3.1.5 Zellkultur 33 3.1.6 Geräte 34 3.2 Methoden 35 3.2.1 Allgemeine zellbiologische Methoden 35 3.2.1.1 Kultivierung 35 3.2.1.2 Passagieren 35 3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl 35 3.2.1.4 Kryokonservierung 36 3.2.2 Bestimmung der Zellvitalität mittels WST-1 Zytotoxizitätstest 36 3.2.3 Quantitative Proteinbestimmung mittels BCA-Assay 38 3.2.4 Ermittlung von Interaktionen am bABCG2-Transporter 38 3.2.4.1 Aussaat und Vorbehandlung 39 3.2.4.2 Durchführung des Hoechst 33342-Assays 40 3.2.5 Detektion von Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 41 3.3 Statistik 42 4 Ergebnisse 43 4.1 Auswahl der Pestizide und ihrer Konzentrationen 43 4.2 Auswahl der Pestizidkombinationen 46 4.3 Einfluss der Pestizide auf die Zellvitalität 48 4.4 Interaktionen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 53 4.5 Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 56 5 Diskussion 60 5.1 Zellmodell 60 5.2 Zellvitalitätsstudien in MDCKII-bABCG2-Zellen 61 5.3 Pestizide als potentielle bABCG2-Substrate 64 5.4 Wechselwirkungen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 75 5.5 Risiken potentieller bABCG2-Substrate 79 6 Zusammenfassung 80 7 Summary 82 8 Literaturverzeichnis 84 9 Anhang 106 10 Danksagung 111
2

Efecto de diversas técnicas para visualizar la placa metafásica y el corpúsculo polar sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos porcinos madurados in vitro

Maside Mielgo, Carolina 14 December 2012 (has links)
La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) en la especie porcina se ha convertido en una herramienta muy útil para para la elaboración de modelos genéticos de enfermedades humanas y para el uso en xenotransplantes. Aunque el número de cerdos clonados aumenta cada año, la eficiencia total de esta tecnología es todavía muy baja. Uno de los pasos más difíciles de la SCNT en porcino es la enucleación del ovocito, principalmente debido a que su citoplasma contiene numerosas gotas lipídicas. El principal objetivo de la tesis fue evaluar el efecto de diversas técnicas para visualizar la placa metafásica y el corpúsculo polar sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos porcinos madurados in vitro. / Somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology in porcine has become a very useful tool for the elaboration of genetic models for human diseases and the use in xenotransplantation. The efficiency of SCNT is still very low, although the number of cloned pigs increases each year. One of the hardest steps of porcine SCNT is the enucleation of the oocyte because its cytoplasm contains many lipid droplets. The main objective of this thesis was to assess the effect of several approaches to visualize the metaphase II plate and the first polar body on the developmental ability of in vitro mature porcine oocytes.
3

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Fadainia, Christophe 07 1900 (has links)
Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire. / Traditionally associated with female reproduction, oxytocin (OT), a peptidic hormone synthesized in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus and secreted by the posterior pituitary (neurohypophysis), was revisited recently and was revealed to have several new roles in the cardiovascular system. Indeed, our laboratory has shown that OT can induce the differentiation of embryonic stem cells (ESC) into functional cardiomyocytes (CM). On the model of embryonal carcinoma cell line P19, it has been shown that this process occurs following the release of cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent nitric oxide. Similarly, it is known that atrial natriuretic peptide (ANP), a peptide produced, stored and secreted by cardiac myocytes, can also induce the release of cGMP. However, the cellular mechanisms involved in cardiac differentiation are still poorly understood. Numerous studies have shown that the injured heart can be regenerated from an isolated population of transplanted stem and progenitor cells. One of these cell populations, frequently isolated from embryonic and adult animal organs, called "Side Population" (SP), is characterized by active efflux of the fluorescent dye Hoechst 33342 (Ho). SP cells express specific ATP-binding cassette transporter proteins which actively transport Ho out of their cytoplasm. The SP cell subpopulation isolated from the heart display enhanced differentiation potential into cardiac phenotype in response to OT treatment. Recently, the phenotypic and functional heterogeneity of embryonic stem cells has been demonstrated, and this was correlated with the presence of cell subpopulations much like the SP cells from the heart and these cells can be identified by flow cytometry (FACS) as a population of unmarked cells by the Ho and which exhibit sensitivity to the inhibitor of the family of ATP-binding cassette ABC, verapamil. Thus, the SP from ESC could be a good candidate to induce cell differentiation more effectively to the cardiac phenotype. Since ANP can induce the release of cGMP and it has been shown that cardiac differentiation was mediated by the release of cGMP through the nitric oxide (NO), then we therefore formulate the hypothesis that ANP could also induce cardiac differentiation. Since ESC are composed of a mixture of different cell types so as we emit the hypothesis that the use of a subpopulation of more homogeneous ESC strengthen the differentiation potential of ANP. Methods: SP were isolated from P19 cells by FACS using the method of exclusion of fluorescent dye Hoechst and their phenotype was characterized by immunofluorescence (IF) for markers of the undifferentiated state, self-renewal and pluripotency OCT4 and SSEA1. Then, the optimal pharmacological dose of ANP was determined via cytotoxicity tests in P19 cells (MTT assay). For cardiac differentiation, cells in the form of spheroids were formed using the technique of "Hanging Drop" under the stimulation of ANP for 5 days. Then cuts were made in the spheroids via cryosection to highlight the presence of cardiac progenitor cell markers such as GATA4, Nkx2.5 and a specific mitochondrial marker Tom22. Next, the P19-SP cells were stimulated in cell spheroids by the treatment with ANP (10-7 M) or OT (10-7 M), the specific antagonist of particulate guanylate cyclase A71915 (10-6 M), and the combination of the inducers OT + ANP, OT + A71915, A71915 + ANP. After cell plating, the differentiation into cardiomyocytes has been identified by the appearance of beating cell colonies characteristics of contractile cardiac cells, by determining the cellular phenotype by IF, and finally by the extraction of RNA and proteins that were used for the determination of cGMP by RIA, the mRNA expression by RT-PCR and protein expression by western blotting. Results: The spheroids induced by ANP showed a significant increase in the presence of cardiac transcription factors GATA4 and Nkx2.5 as well as a greater number of mitochondria characterized by a greater presence of Tom22 compared with no induced cells suggesting a cardiomyogenic effect of ANP. In addition, ANP induced the appearance of beating cell colonies from day 7 (early stage) to day 14 (mature stage) similarly to OT. However, the combination of ANP with OT did not induce beating cell colonies suggesting a negative additive effect on cardiomyogenesis. The spheroids, obtained using the technique of "Hanging Drop", have shown a modest increase in mRNA expression as follows: OTR, ANP and GATA4 compared to cells grown in monolayers. By IF, we quantified (number of positive cells) and characterized, from day 6 to day 14 of differentiation, the cardiac phenotype of our cells using the following markers: Cardiac Troponin T, ANP, Connexines 40 and 43, Myosin Light Chain-2V, OTR. The SP differentiated under the stimulation of ANP showed a significant increase in intracellular cGMP compared with undifferentiated cells. Surprisingly, the antagonist A71915 induced a greater appearance of beating cell colonies compared to OT and ANP in early day of cardiac differentiation and the addition of OT or ANP potentiated its effects, further increasing the proportion of beating cells colonies. In addition, the size of beating cell colonies was even greater than under the simple stimulation of OT or ANP. Radioimmunoassay analysis in SP P19 cells stimulated with ANP, A71915 and the combination of both during 15min, 30min and 60min showed that ANP significantly stimulates the release of cGMP, however, A71915 does not abolish the effects of ANP and it rather stimulates the release of cGMP through partial agonist effects. Conclusion: Our results demonstrate firstly that ANP induces the differentiation of P19-SP cells into functional CM. Moreover, it appears that the signaling pathway NPRA-B/pGC/cGMP seems to be involved in the mechanism of cardiac differentiation since the abolition of cGMP mediated by the pGC potentiates cardiac differentiation and it appears that this signaling pathway is additive to the signaling pathway induced by OT, NO/sGC/cGMP, since the addition of OT to the antagonist A71915 stimulates cardiac differentiation more strongly than OT or A71915 alone. This suggests that the therapeutic effect of natriuretic peptides observed in heart failure and vasodilatory properties of certain natriuretic peptide receptor antagonists included the stimulation of stem cell differentiation into cardiomyocytes. This would therefore suggest that the natriuretic peptides or natriuretic peptide receptor antagonists could be an attractive alternative to cell therapy to induce heart regeneration.
4

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Fadainia, Christophe 07 1900 (has links)
No description available.

Page generated in 0.2589 seconds