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Estudos sobre vacinologia e evolução do vírus da cinomose caninaBudaszewski, Renata da Fontoura January 2017 (has links)
O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.
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Incorporação e remodelação de enxertos homólogos na reconstrução alveolar em humanos: análise tomográfica, histológica e histomorfométrica / Incorporation and remodeling of bone homografts in the alveolar ridge reconstruction in humans: tomographic, histologic and histomorphometric analisysDaniel Deluiz Martins 05 December 2011 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Enxertos ósseos homólogos congelados têm sido documentados apresentando bons resultados clínicos como substituto ao material autógeno nas reconstruções alveolares. Entretanto, dados referentes à incorporação e remodelação destes enxertos não estão disponíveis na literatura. Este estudo tem por objetivo determinar um período ótimo de espera para instalação de implantes em rebordos reconstruídos com enxertos ósseos homólogos em bloco no que se refere à incorporação e reabsorção. 24 pacientes foram submetidos à reconstrução alveolar óssea homóloga previamente à instalação de implantes. Os indivíduos foram alocados randomicamente em um de 3 grupos de acordo com o tempo de espera para o segundo estágio cirúrgico (4, 6 e 8 meses). Análises tomográficas, histológicas e histomorfométricas foram utilizadas a fim de determinar o grau de reabsorção e incorporação dos enxertos nos diferentes intervalos de tempo para cada grupo. Os dados de reabsorção sofrida pelos enxertos demonstraram diferenças estatisticamente significativas para os três intervalos de espera. Da mesma forma, parâmetros histomorfométricos como contagem de osteócitos e quantificação de remanescentes de osso homólogo nas biópsias apresentaram diferenças significativas entre os grupos. De acordo com os dados do presente trabalho, no que diz respeito à remodelação e incorporação, o período mais favorável à instalação dos implantes a curto prazo após recontruções com enxertos homólogos é de 4 meses. / Fresh-frozen homologous bone grafts have been reported achieving good clinical results as a substitute for autogenous bone in alveolar reconstruction. However, data regarding the incorporation and remodeling of these grafts are not available in the literature. The aim of this study is to determine the optimal period for the implant placement in alveolar ridges reconstructed with bone block allografts. 24 patients underwent alveolar ridge reconstruction with homologous bone prior to implant placement. Subjects were randomly assigned into one of three groups according to the waiting time for the second surgical stage (4, 6 and 8 months). Tomographic, histological and histomorphometric analisys were used to determine the rates of grafts resorption and incorporation at different time intervals for each group. Data from graft resorption showed statistically significant differences for the three healing intervals. Similarly, histomorphometric parameters as: osteocytes count and quantification of remaining graft in the biopsies showed significant differences between groups. According to this work, with regard to the remodeling and incorporation, the most favorable the short term period to implant placement after fresh-frozen block allografts ridge reconstruction is 4 months.
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Construção e manipulação de clone infeccioso de uma amostra brasileira do vírus da diarreia viral bovina / Construction and manipulation of infectious clone from a brazilian bovine viral diarrhea virus isolateArenhart, Sandra 29 March 2012 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a worldwide pathogen associated with
important losses to livestock production. Most of these losses come from reproductive
disorders and from the ability of the virus to produce persistent infections following in utero
infection of the fetus. A number of reverse genetics methodologies have been used for BVDV
in order to better understand the biology of the virus, which allowed the elucidation of a
number of biological features including virus replication, host-virus interaction, immune
response, and the pathogenesis of fetal infection. The present study describes the construction,
characterization and manipulation of an infectious clone out of a non-cytophatic Brazilian
BVDV strain IBSP4-ncp. The cDNA recombinant clone was constructed by yeast
homologous recombination with a low-copy vector, from three genomic fragments
comprising the open reading frame (ORF). The two untranslated regions (5' and 3' UTR) were
replaced by the respective UTRs of the reference strain NADL. The constructed vector was
transcribed in vitro and the resulting RNA was transfected on MDBK cells to rescue
infectious virus. The rescued viruses (IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 and #3) were maintained for
ten passages in tissue culture and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus
size and morphology similar to those of the parental IBSP-4. Genomic analysis revealed five
point mutations in the gene coding for Npro protein, resulting in amino acid changes. These
mutations probably reflect an adaptation of the virus to the heterologous UTRs. The infectious
clone IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 was further used for the construction of a recombinant virus
expressing the Gaussia luciferase (Gluc) reporter gene. The reporter gene was inserted
between the Npro and Core genes, being flanked by an upstream linker and a downstream
sequence of the Foot and Mouth Disease virus protease (FMDV2Apro) for accurate protein
processing. The recombinant vector was in vitro transcribed and the RNA was transfected on
MDBK cells. Recombinant infectious viruses were rescued (IC-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 and
#4) and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology
similar to those of the parental IBSP-4 clone. The Gluc reporter gene was accurately
expressed and processed by the recombinant virus during 15 passages in tissue culture. These
studies revealed that the infectious clone constructed herein can be easily manipulated and is
able to carry in its genome heterologous genes up to 555 base pairs in length in a stable
fashion and without interference with its replication efficiency. Thus, the constructed clone
may be very useful for genetic manipulation towards studying different aspects of the BVDV
biology and its interactions with the host, and for the development of vaccine strains with
attenuated phenotype and/or with antigenic markers. / O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um patógeno de bovinos distribuído
mundialmente, associado com importantes perdas econômicas. As maiores perdas devem-se
aos problemas reprodutivos causados pela infecção, e pela capacidade do vírus de causar
persistência após infecção fetal no terço inicial da gestação. Para entender melhor a biologia
desse vírus, sistemas de genética reversa foram desenvolvidos e tem permitido a elucidação
de vários aspectos da replicação viral, interação vírus hospedeiro, resposta imune e
patogenia da infecção fetal. O presente estudo relata a construção, caracterização e
manipulação de um clone infeccioso, a partir da cepa brasileira não-citopática IBSP4-ncp. O
clone de DNA recombinante foi construído pela técnica de recombinação homóloga em
levedura, utilizando um vetor de baixo número de cópias, construído a partir de três
fragmentos genômicos, que compreendiam a fase aberta de leitura (open reading frame, ORF)
do vírus. As duas regiões não traduzidas (5 e 3 UTR) foram substituídas pelas respectivas
UTRs da cepa de referência NADL. O vetor construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido
foi transfectado em células MDBK para recuperação de vírus infecciosos. Os vírus
recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncp#2 e #3) foram mantidos por 10 passagens em cultivo
celular e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia
de focos similares ao vírus parental IBSP-4. A análise do genoma por sequenciamento revelou
cinco mutações pontuais no gene Npro, com trocas de aminoácidos, provavelmente refletindo
uma adaptação do vírus às UTRs heterólogas. O clone infeccioso construído CIpBSC_
IBSP4-ncp#2, foi então utilizado para a construção de um vírus recombinante
expressando o gene repórter Gaussia luciferase (Gluc). O gene repórter foi inserido entre os
genes Npro e Core do vírus. Para o processamento da proteína repórter, uma sequência ligante
foi adicionada anteriormente ao gene, e a sequência da protease do vírus da Febre Aftosa
(FMDV2Apro) foi inserida após o gene. O vetor recombinante construído foi transcrito in vitro
e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK. Vírus recombinantes infecciosos foram
recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 e #4) e caracterizados in vitro, apresentando
dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus obtido do clone
infecioso. O gene repórter Gluc foi corretamente expresso e processado pelo vírus
recombinante durante 15 passagens em cultivo celular. Com os resultados obtidos nestes
estudos, conclui-se que o clone infeccioso construído pode ser facilmente manipulado e é
capaz de carrear em seu genoma, e expressar de forma estável, genes heterólogos com até 555
pares de base, que parecem não interferir com sua capacidade replicativa. Dessa forma, o
clone obtido pode ser muito útil para manipulação genética visando estudar diferentes
aspectos da biologia do BVDV e de suas interações com o hospedeiro, assim como para a
produção de cepas vacinais com fenótipo atenuado e/ou com marcadores antigênicos.
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Incorporação e remodelação de enxertos homólogos na reconstrução alveolar em humanos: análise tomográfica, histológica e histomorfométrica / Incorporation and remodeling of bone homografts in the alveolar ridge reconstruction in humans: tomographic, histologic and histomorphometric analisysDaniel Deluiz Martins 05 December 2011 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Enxertos ósseos homólogos congelados têm sido documentados apresentando bons resultados clínicos como substituto ao material autógeno nas reconstruções alveolares. Entretanto, dados referentes à incorporação e remodelação destes enxertos não estão disponíveis na literatura. Este estudo tem por objetivo determinar um período ótimo de espera para instalação de implantes em rebordos reconstruídos com enxertos ósseos homólogos em bloco no que se refere à incorporação e reabsorção. 24 pacientes foram submetidos à reconstrução alveolar óssea homóloga previamente à instalação de implantes. Os indivíduos foram alocados randomicamente em um de 3 grupos de acordo com o tempo de espera para o segundo estágio cirúrgico (4, 6 e 8 meses). Análises tomográficas, histológicas e histomorfométricas foram utilizadas a fim de determinar o grau de reabsorção e incorporação dos enxertos nos diferentes intervalos de tempo para cada grupo. Os dados de reabsorção sofrida pelos enxertos demonstraram diferenças estatisticamente significativas para os três intervalos de espera. Da mesma forma, parâmetros histomorfométricos como contagem de osteócitos e quantificação de remanescentes de osso homólogo nas biópsias apresentaram diferenças significativas entre os grupos. De acordo com os dados do presente trabalho, no que diz respeito à remodelação e incorporação, o período mais favorável à instalação dos implantes a curto prazo após recontruções com enxertos homólogos é de 4 meses. / Fresh-frozen homologous bone grafts have been reported achieving good clinical results as a substitute for autogenous bone in alveolar reconstruction. However, data regarding the incorporation and remodeling of these grafts are not available in the literature. The aim of this study is to determine the optimal period for the implant placement in alveolar ridges reconstructed with bone block allografts. 24 patients underwent alveolar ridge reconstruction with homologous bone prior to implant placement. Subjects were randomly assigned into one of three groups according to the waiting time for the second surgical stage (4, 6 and 8 months). Tomographic, histological and histomorphometric analisys were used to determine the rates of grafts resorption and incorporation at different time intervals for each group. Data from graft resorption showed statistically significant differences for the three healing intervals. Similarly, histomorphometric parameters as: osteocytes count and quantification of remaining graft in the biopsies showed significant differences between groups. According to this work, with regard to the remodeling and incorporation, the most favorable the short term period to implant placement after fresh-frozen block allografts ridge reconstruction is 4 months.
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Análises da epidemiologia molecular e evolução de pestivírusWeber, Matheus Nunes January 2016 (has links)
O gênero Pestivirus da família Flaviviridae, compreende vírus de genoma RNA fita simples e polaridade positiva que comumente estão associados a infecções em ruminantes e suídeos. Possui quatro espécies reconhecidas: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2, o vírus da doença da fronteira (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Além disso, possui possíveis espécies atípicas, sendo o vírus ‘HoBi’-like a mais reconhecida na literatura. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da epidemiologia molecular de pestivírus no País e dos mecanismos na evolução de vírus do gênero, o presente trabalho será apresentado sob a forma de seis artigos científicos. Os trabalhos visam a caracterização de pestivírus detectados em bovinos e javalis no Rio Grande do Sul, a identificação de cepas resultantes de provável recombinação homóloga, a análise das variantes virais intrahospedeiro (quasispécies) de animais infectados pelo vírus ‘HoBi’-like, e a comparação da multiplicação in vitro de diferentes cepas de pestivírus em cultivos celulares oriundos de diferentes raças bovinas. No primeiro trabalho, amostras de soro bovino de animais do Rio Grande do Sul foram obtidas junto ao serviço veterinário oficial e submetidas a RT-PCR para detecção de pestivírus seguida de sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, onde 57,6% foram classificadas como BVDV-1 e 42,4% como BVDV-2, sendo constada frequência elevada de BVDV-2 quando comparada a outras regiões no mundo. No segundo trabalho, 40 amostras de javalis cativos obtidas de abatedouro foram testadas utilizando metodologia semelhante a anteriormente mencionada, e foi possível a detecção de uma amostra positiva, que foi classificada como BVDV-2, sendo a primeira evidência molecular do BVDV em javalis na literatura. No terceiro artigo científico, foi pesquisado a ocorrência de recombinação homóloga, utilizando metodologia in silico, em sequências de pestivírus presentes em banco de dados públicos, onde foram descritos novos possíveis eventos de recombinação entre BVDV-1a e BVDV-1b, BVDV-2a e BVDV-2b e CSFV-2.2 com outro genogrupo indefinido. No quarto e quinto trabalhos, animais persistentemente infectados com o vírus ‘HoBi’-like foram gerados experimentalmente e, utilizando RT-PCR seguida de clonagem, sequenciamento e análises in silico, a composição e variações intrahospedeiro das quasispécies virais em circulação foram avaliadas, onde foi possível observar que características individuais do hospedeiro são importantes na seleção de variantes virais e que a nuvem de mutantes aumenta com o passar do tempo, não havando quasispécie dominante. Por fim, no sexto artigo científico, a multiplicação de cepas de BVDV-1a e 1b, BVDV-2a e vírus ‘HoBi’-like foram avaliadas in vitro em células de cultivo primário obtidas de gado europeu, zebuíno e raça mista e comparadas utilizando modelos estatísticos, onde foi possível a observação de ausência de diferenças entre as raças (P=0,88), mas presença de diferença entre indivíduos da mesma raça (P˂0,05). Os resultados aqui apresentados somam informações acerca da epidemiologia molecular, biologia e evolução dos pestivírus, sendo importantes para embasar futuras campanhas de controle e erradicação das doenças causadas por pestivírus. / The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, comprises single stranded RNA-viruses that are commonly associated with infections in ruminants and swine. It has four recognized species: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), BVDV-2, border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). It also has putative atypical species where the ‘HoBi’-like virus is the most highlighted in the literature. In order to generate more information about molecular epidemiology of pestiviruses and important mechanisms in the evolution of the virus genus, this work will be presented in six scientific articles form. The works aimed in the characterization of pestivirus detected in cattle and wild boar in Rio Grande do Sul state, identification of strains resulting from putative homologous recombination, analysis of intrahost viral variants (quasispecies) of animals infected with ‘HoBi’-like viruses, and the comparison of in vitro growth of different pestivirus strains in cell cultures derived from different cattle breeds. In the first study, bovine serum samples of cattle from Rio Grande do Sul state were collected by the official veterinary service and submitted to RT-PCR for detection of pestivirus followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples, where 57.6% were classified as BVDV-1 and 42.4% as BVDV-2, which revealed high frequency of BVDV- 2 when compared to other regions worldwide. In the second work, 40 captive wild boar lung samples obtained from slaughterhouse were tested using similar methodology described above, and one sample resulted positive and was classified as BVDV-2, which represented the first molecular evidence of BVDV in wild boars. In the third scientific article, the occurrence of homologous recombination was investigated using in silico methods applied to sequences available in public databases, which are described putative new events between BVDV-1a and BVDV-1b, BVDV-2a and 2b and CSFV-2.2 and undetermined genogroup. In the fourth and fifth studies, animals persistently infected with the ‘HoBi’-like viruses were experimentally generated and using RT-PCR followed by cloning, sequencing and in silico analysis, the composition and intrahost variations of viral quasispecies in circulation were evaluated, where it was observed that individual characteristics of the host are important in the selection of viral variants and the mutant clouds increased overtime. Finally, in the sixth scientific article, the growth of BVDV-1a and 1b, and BVDV-2b, ‘HoBi’-like virus strains were evaluated in vitro using primary cell cultures obtained by taurine, indicine and mixed breed cattle using statistical models, it was possible to observe the absence of differences between cattle breeds (P=0.88), but presence of difference between individuals within the breed (P˂0.05). The results presented herein add information about the molecular epidemiology, biology and evolution of pestiviruses, being important to support future control and eradication programs of diseases caused by pestiviruses.
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Estudos sobre vacinologia e evolução do vírus da cinomose caninaBudaszewski, Renata da Fontoura January 2017 (has links)
O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.
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Funkční in vitro analýza alternativních sestřihových variant genu BRCA1 / The functional in vitro analysis of the BRCA1alternative splicing variantsŠevčík, Jan January 2012 (has links)
BACKGROUND: The inactivation of the tumor suppressor gene BRCA1 is a predisposing factor for a breast/ovarian cancer development. Formation of cancer-specific alternative splicing variants with aberrant biological properties can represent additional mechanism decreasing the overall BRCA1 activity in DNA double strand break (DDSB) repair. In this study, we analyzed BRCA1 alternative splicing variants BRCA114-15 and 17-19 ascertained previously during the screening of high-risk breast cancer individuals. METHODS: We established a stable MCF-7 cell line-based model system for an in vitro analysis of BRCA1 variants. Using this system, we analyzed the impact of BRCA114-15 and 17-19 variants on DNA repair kinetics using comet assay and confocal immunomicroscopy. The capacity of DNA repair was assessed directly by an in vitro NHEJ assay and indirectly by a mitomycin C sensitivity test. The proliferation activities were determined by a clonogenic assay and growth curves. RESULTS: Overexpression of BRCA114-15 and 17-19 increases the endogenous level of DNA damage, slows down the DDSB repair, and decelerates the initial phase of radiation-induced foci formation and prolongs their persistence. Moreover, BRCA114-15 and 17-19 differentially influence the activity of HR and NHEJ and sensitivity of MCF-7 cells to ionizing...
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A single molecule perspective on DNA double-strand break repair mechanisms / Réparation des cassures double-brin de l'Adn : une perspective en molécule uniqueZhang, Hongshan 24 July 2017 (has links)
Les cassures double brin de l'ADN altèrent l'intégrité physique du chromosome et constituent l'un des types les plus sévères de dommages à l'ADN. Pour préserver l'intégrité du génome contre les effets potentiellement néfastes des cassures double brin de l'ADN, les cellules humaines ont développé plusieurs mécanismes de réparation, dont la réparation par recombinaison de l'ADN et la jonction d'extrémités non-homologues (NHEJ), catalysés par des enzymes spécifiques. Pendant ma thèse, nous avons caractérisé la dynamique de certaines des interactions protéines/ADN impliquées dans ces mécanismes au niveau de la molécule unique. Dans ce but, nous avons combiné des pinces optiques et de la micro-fluidique avec de la microscopie de fluorescence à champ large afin de manipuler une ou deux molécules d'ADN individuelles et d'observer directement les protéines de la réparation marquées par fluorescence agissant sur l'ADN. Nous avons concentré notre analyse sur trois protéines/complexes essentiels impliqués dans la réparation de l'ADN: (i) la protéine humaine d’appariement de brin RAD52, (ii) les protéines humaines XRCC4, XLF et le complexe XRCC4/Ligase IV de la NHEJ et (iii) le complexe humain MRE11/RAD50/NBS1. / DNA double-strand breaks disrupt the physical continuity of the chromosome and are one of the most severe types of DNA damage. To preserve genome integrity against the potentially deleterious effects of DNA double-strand breaks, human cells have evolved several repair mechanisms including DNA recombinational repair and Non-Homologous End Joining (NHEJ), each catalyzed by specific enzymes. In this thesis we aimed at unraveling the dynamics of protein/DNA transactions involved in DNA double-strand break repair mechanisms at single molecule level. To do this, we combined optical tweezers and microfluidics with wide-field fluorescence microscopy, which allowed us to manipulate individual DNA molecules while directly visualize fluorescently-labeled DNA repair proteins acting on them. We focused the study on three crucial proteins/complexes involved in DNA repair: (i) the human DNA annealing protein RAD52, (ii) the non-homologous end joining human proteins XRCC4 and XLF and the complex XRCC4/Ligase IV, and (iii) the human MRE11/RAD50/NBS1 complex.
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Influência do gene PTEN na expressão de RAD51 e suas parálogas, RAD51C e RAD51B, em linhagens de glioblastoma multiforme tratadas com etoposídeo / PTEN gene Influence in expression of RAD51 and its Paralogs RAD51C and RAD51B, in Glioblastoma strains treated with EtoposideAna Clara Oliveira 12 May 2016 (has links)
O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de tumor cerebral maligno com maior incidência na população. A perda do gene PTEN (fosfatase e tensina homóloga) é uma alteração comum associada ao GBM (até 60%) e esse gene codifica uma enzima que antagoniza a ação de PI3K, inibindo a fosforilação de AKT e, desse modo, regulando vias de sinalização relativas à sobrevivência celular e proliferação. Mutações em PTEN têm sido associadas à instabilidade genômica e ao aumento no número de quebras de fita dupla, além de serem relacionadas também à redução da expressão de RAD51, a qual é uma proteína-chave da via de reparo por recombinação homóloga (HR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar se o status de PTEN interfere na expressão de RAD51 e proteínas parálogas (RAD51C e RAD51B) e, consequentemente, se PTEN é capaz de influenciar a eficiência de HR. Com o objetivo de induzir a formação de quebras de fita duplas (DSBs) no DNA, as células foram tratadas com a droga antitumoral etoposídeo, que produz quebras no DNA, principalmente duplas (DSBs). Duas linhagens de GBM com status diferentes de PTEN foram utilizadas: T98G (PTEN mutado) e LN18 (PTEN tipo selvagem). As células de GBM foram tratadas com etoposídeo em diferentes experimentos ou ensaios: proliferação celular, quantificação da necrose e apoptose, cinética do ciclo celular, imunofluorescência da proteína ?- H2AX, quantificação dos níveis de expressão de RAD51 e parálogas e o silenciamento de PTEN na linhagem LN18. Os resultados mostraram que a linhagem LN18 foi mais sensível à droga nos tempos iniciais (24 e 72 h) (até 61,2% de redução), em comparação com a T98G (até 12,3% de redução); no tempo mais tardio de análise (120 h), ambas as linhagens sofreram redução acentuadana proliferação. Adicionalmente, a LN18 exibiu maior porcentagem de células apoptóticas e necróticas, em comparação com a linhagem T98G, nos tempos de24, 72 e 120 horas após o tratamento. O ensaio de imunofluorescência revelou maior indução de células positivas para ?-H2AX na linhagem LN18 em relação à T98G (p =<0,001), após tratamento com etoposídeo (50 e 75 ?M). Nessas concentrações, a análise da cinética do ciclo celular mostrou um bloqueio na fase G2 em ambas as linhagens (p<0,01) nos tempos analisados (24, 48 e 72h), mas apenas a linhagem LN18 revelou bloqueio na fase S. A expressão de RAD51, RAD51B e C foi mais elevada em LN18 em comparação com a T98G e U87MG, nas células tratados (75?M) e controles. PTEN foi silenciado (siRNA-PTEN) na linhagem LN18 para verificar se a redução da expressão desse gene reduziria também a expressão de RAD51 e parálogas. Após 72 horas de silenciamento, com 69,9% de inibição de PTEN, a expressão de RAD51 e RAD51C também se mostrou reduzida em relação ao grupo controle. Em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que o status de PTEN é crucial para as vias de sobrevivência, controle do ciclo celular e indução de apoptose nas células de GBM, indicando a relação entre PTEN e RAD51 e parálogas nas células de GBM tratadas com um indutor de quebras no DNA. Adicionalmente, outras ferramentas de estudo são requeridas para investigar as vias moleculares e possíveis interações e complexos proteicos envolvendo a participação de PTEN e RAD51 e suas proteínas parálogas / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor. Loss of PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) gene is the most frequent alteration associated with GBM and encodes a phosphatase enzyme that antagonizes the PI3K, by inhibiting AKT phosphorylation thereby regulating signaling pathways related to cell survival and proliferation. PTEN deficiency has been associated with genomic instability and increased endogenous DSBs, as well as reduced expression of RAD51, which is a key gene with crucial role in HR. In this study, we aimed to evaluate whether the PTEN status in GBM cell lines can affect RAD51 expression and HR efficiency under conditions of treatment with the antineoplastic drug etoposide, which targets the DNA topoisomerase II enzyme, thus leading to the production of DNA breaks. T98G (PTEN mutated) and LN18 (PTEN wild-type) cells were treated with etoposide, and several assays were carried out: cell proliferation, detection and quantification of necrosis and apoptosis, cell cycle kinetics, immunofluorescence staining, RAD51 (and paralogs) protein expression, and PTEN silencing in LN18 cell line, by using the siRNA method. LN18 cells showed a greater reduction in cell proliferation, compared to T98G after treatments (25, 50, 75 e 100 µM) at 24, 72 and 120h. Both cell lines showed a significant increase (p=<0.001) in cell death induction, but LN18 presented a greater percentage of apoptotic and necrotic cells than T98G (24, 72 and 120h). The induction of DSB was analyzed by immunostaining (with ?-H2AX antibody), and for the concentrations (50 and 75 µM) tested, LN18 showed higher levels of ?-H2AX positive cells than that observed for T98G (p=<0.001). The analysis of cell cycle kinetics performed for cells treated with etoposide (50 and 75 µM) and collected at 24, 48 and 72h, LN18 presented a greater G2-blockage, as compared to T98G; only LN18 showed a blockage at the S-phase. The expression of RAD51, RAD51B and C was higher in LN18 compared to T98G and U87MG cells treated with etoposide (75 µM) and controls. When we silenced PTEN in LN18 linage, to check if PTEN silencing may reduce the expression of RAD51 and its paralogs, we found a 69.9% reduction in PTEN protein expressions, and the expression of RAD51 and RAD51C was also found reduced, compared to the control group. Taken together, the results obtained in this study indicate that the status of PTEN is critical for survival pathways, cell cycle control and induction of apoptosis in GBM cells, confirming the relationship between PTEN and RAD51 and its paralogs in GBM cells treated with an inducer of DNA breaks. These results contribute with relevant information for further studies on molecular pathways underlying the interaction between PTEN and RAD51 and its paralogs
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Efeito da utilização de plasma rico em plaquetas na osteointegração dos enxertos ósseos homólogos criopreservados: estudo histomorfométrico em coelhos / Effects of platelet rich plasma in osteointegration of cryopreserved homologous bone grafts: histomorphometric study in rabbitsLuiz Augusto Ubirajara Santos 03 July 2007 (has links)
As perdas ósseas em alguns seguimentos do sistema músculoesquelético têm sido motivo de grande preocupação na área da Ortopedia e Traumatologia. Propostas de tratamentos com uso de enxertos e fatores de crescimento são descritas ao longo dos anos. Neste estudo avaliamos o efeito do plasma rico em plaquetas -PRP na fase inicial do processo de osteointegração de enxertos ósseos homólogos criopreservados a - 80 °C, em forma de blocos, implantados no côndilo femoral de coelhos. Operamos 19 animais (38 fêmures), onde ambas as técnicas foram aplicadas no mesmo animal em lados alternados. De um lado aplicamos o aloenxerto isolado (Lado 1) e no outro associamos o aloenxerto ao PRP (Lado 2). Após 15 dias, os animais foram sacrificados e os côndilos femorais com as áreas de enxertia analisados pela histomorfometria com o método semiautomático. Não observamos efeito do plasma rico em plaquetas nas áreas de enxertias dos aloenxertos, pois a comparação dos parâmetros histomorfométricos estruturais, de formação e reabsorção não mostraram diferenças significativas. / Bone loss, in some segments of the muscle-skeleton system, are of great concern in the fields of Orthopedics and Traumatology. There are several options of treatment by means of bone grafts and growth factors. In this study we evaluate the effect of platelet rich plasma (PRP) in the initial phase of osteointegration of cryopreserved (- 80 °C) homologous bone grafts, in blocks, implanted in the femoral condyles of rabbits. We operated 19 animals (38 femurs). Both techniques were applied in the same animal in alternate sides. In one side we applied isolated allograft (side 1) and on the contralateral side we added PRP to the allograft (side 2). After 15 days, the animals were sacrificed and the femoral condyles, with the receptor area, were analyzed histomorphometrically (semi-automatic method). We found no effect of the PRP in the receptor. The comparison between the histomorphometric parameters of structural, formation and bone resorption showed no significant differences.
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