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Pseudomonas syringae is a common foliar plant pathogenic bacterium that causes diseases on many crop plants. We hypothesized that today's highly virulent P. syringae crop pathogens with narrow host range might have evolved after the advent of agriculture from ancestral P. syringae strains with wide host range that were adapted to mixed plant communities. The model tomato and Arabidopsis pathogen P. syringae pv. tomato (Pto) DC3000 and its close relatives isolated from crop plants were thus selected to unravel basic principles of host range evolution by applying molecular evolutionary analysis and comparative genomics approaches. Phylogenetic analysis was combined with host range tests to reconstruct the host range of the most recent common ancestor of all analyzed strains isolated from crop plants. Even though reconstruction of host range of the most recent common ancestor of all analyzed strains was not conclusive, support for this hypothesis was found in some sub-groups of strains. The focus of my studies then turned to Pto T1, which was found to represent the most common P. syringae lineage causing bacterial speck disease on tomato world-wide. Five genomes were sequenced and compared to each other. Identical genotypes were found in North America and Europe suggesting frequent pathogen movement between these continents. Moreover, the type III-secreted effector gene hopM1 was found to be under strong selection for loss of function and non-synonymous mutations in the fliC gene allowed to identify a region that triggers plant immunity. Finally, Pto T1 was compared to closely related bacteria isolated from snow pack and surface water in the French Alps. Recombination between alpine strains and crop strains was inferred and virulence gene repertoires of alpine strains and crop strains were found to overlap. Alpine strains cause disease on tomato and have relatively wider host ranges than Pto T1. The conclusion from these studies is that Pto T1 and other crop pathogens may have evolved from ancestors similar to the characterized environmental strains isolated in the French Alps by adapting their effector repertoire to individual crops becoming more virulent on these crops but losing virulence on other plants. / Ph. D.

Nach der Eradikation der humanen Pockenerkrankung stellen zoonotische Orthopockenvirus-(OPV-)Infektionen heute eine mögliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit dar. Hierbei sind insbesondere Kuhpocken-(CPXV), Affenpocken-(MPXV) und Vaccinia Viren (VACV) von Bedeutung. In dieser Arbeit wurde das Genexpressionsprofil humaner (HeLa) Zellen nach Infektion mit CPXV, MPXV oder VACV untersucht. Es wurden sowohl zelluläre Gene identifiziert, welche generell von allen verwendeten Viren reguliert wurden, als auch Gene, die eine Virus-spezifische Regulation durch individuelle OPV aufwiesen. Gemeinsamkeiten zeigten sich insbesondere zwischen CPXV und MPXV, welche, im Gegensatz zu VACV, die Expression zahlreicher Cytokine und Chemokine induzierten. Insbesondere für Interleukin-6, -8 und CXCL1 konnte auch auf Proteinebene eine gesteigerte Sekretion durch CPXV-infizierte Zellen nachgewiesen werden. Vermutlich aufgrund dieser Induktion, trat in vitro eine verstärkte Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen in Folge einer CPXV-, nicht aber einer VACV-Infektion auf. Makrophagen spielen eine kontroverse Rolle im Rahmen einer OPV-Infektion und sind sowohl für deren Bekämpfung, als auch, im infizierten Zustand, für die Ausbreitung der Viren im Organismus von Bedeutung. Daher wurde die Replikationsfähigkeit von CPXV und VACV in Makrophagen charakterisiert. Der Virulenzfaktor p28, welcher von den meisten VACV Stämmen nicht kodiert wird, konnte als essentiell für die Replikation von CPXV in einer murinen Makrophagen-Zelllinie, primären peritonealen Makrophagen der Ratte und in Makrophagen aus primären humanen PBMCs identifiziert werden. In Anbetracht der Bedeutung der Replikationsfähigkeit in Makrophagen für die Ausbreitung einer OPV-Infektion im Wirtsorganismus, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CPXV, im Fall einer weiteren Adaption an den Menschen, ein höheres Bedrohungspotential im Vergleich zu VACV aufweisen könnten. / Today, following the eradication of human smallpox, zoonotic infections caused by orthopoxviruses (OPV) are emerging as a potential human health threat. Especially cowpox viruses (CPXV), vaccinia viruses (VACV), and monkeypox viruses (MPXV) are gaining importance as a cause of infectious disease of man and livestock. This study aimed to analyse and compare the gene expression profile of human (HeLa) cells following infection with CPXV, MPXV or VACV. Cellular genes were identified which were either commonly modulated by infection with any of the three viruses, or which were specifically modulated by one individual OPV. Particularly similar effects on cellular gene expression were observed in the case of CPXV and MPXV infection, which both induced the expression of several cytokine and chemokine genes. Especially interleukin-6, -8, and CXCL1 were strongly secreted by CPXV-infected cells but not by VACV-infected cells. Consequently, CPXV infection also induced a strong chemotactic recruitment of monocytes and macrophages in vitro in contrast to VACV infection. Especially macrophages are known to play a controversial role during OPV infection. On the one hand, macrophages are of importance for the control of the infection. On the other hand, infected macrophages also facilitate virus spread across the organism. Therefore, the capability of CPXV and VACV to replicate in macrophages was analysed. Thereby, the poxviral virulence factor p28, which is absent from most strains of VACV, was identified as an essential factor, allowing CPXV replication in a murine macrophage cell line, primary peritoneal rat macrophages and in human PBMC-derived macrophages. Concerning the importance of productively infected macrophages for OPV spread, these results suggest that CPXV, if further adapted to human beings as host species, may harbor a greater threat to human health when compared to VACV.

De nombreuses études suggèrent que linhibition de la voie alterne du complément de lhôte est nécessaire aux parasites hématophages pour leur permettre daccomplir leur repas sanguin. Une revue décrivant ces études a été publiée dans Developmental and Comparative Immunology (Schroeder et al., (2009) Dev. Comp. Immunol. 33, 5-13). Plusieurs études suggèrent que linhibition de la voie alterne de lhôte par les protéines salivaires de tiques est importante pour lacquisition du repas sanguin et la transmission subséquente de pathogènes à lhôte infesté. Confortant cette hypothèse, une protéine salivaire capable dinhiber la voie alterne du complément a été clonée chez la tique américaine Ixodes scapularis (Valenzuela et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 18717-18723). Cette protéine, appelée Isac, ne présente aucune homologie avec les autres molécules anti-complément connues à ce jour, suggérant que cette protéine a été acquise au cours de lévolution par un mécanisme dévolution convergente. En plus de cet aspect fondamental, Isac représente un candidat antigénique prometteur pour le développement dun vaccin anti-tique potentiellement capable dinduire le rejet de la tique et/ou de prévenir la transmission des pathogènes. Le but initial de cette thèse était didentifier le ou les homologue(s) de la protéine Isac de la tique américaine Ixodes scapularis chez la tique européenne Ixodes ricinus. De façon intéressante, deux séquences différentes ont été isolées du transcriptome des glandes salivaires de la tique I. ricinus (Daix et al., (2007) Insect Mol. Biol. 16 (2), 155-166). Lexpression de ces séquences a révélé quelles codent pour des protéines secrétées capables dinhiber la voie alterne du complément. Ces protéines ont été appelées IRAC I et II pour « Ixodes ricinus anti-complement protein I and II ». La caractérisation des IRACs à laide danticorps monoclonaux a permis de révéler que ces deux protéines sont exprimées de façon constitutive au sein des glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus et sont sur-exprimées au cours du repas sanguin. Létude de lexpression des protéines IRAC I et IRAC II au sein de la population dIxodes ricinus a révélé que ces deux protéines sont des paralogues codés par des gènes différents et non par des allèles dun même locus. Enfin, des analyses phylogéniques portant sur les différentes séquences codant pour les protéines homologues à Isac isolées chez les tiques Ixodes scapularis, Ixodes ricinus et Ixodes pacificus ont révélé que les tiques appartenant au complexe Ixodes ricinus codent pour une famille encore non décrite de molécules anti complément qui se sont diversifiées au cours de lévolution par un processus de sélection darwinienne positive. Les analyses phylogéniques des IRACs suggèrent que ces séquences ont subi une diversification par un processus de pression de sélection darwinienne positive, menant probablement à des molécules possédant des propriétés biologiques différentes. Dans la seconde étude, nous avons testé lhypothèse de travail selon laquelle chaque paralogue pourrait posséder des activités inhibitrices différentes à lencontre du complément de différentes espèces dhôtes naturels, contribuant ainsi à élargir le spectre dhôte des tiques I. ricinus. Les résultats obtenus démontrent que cette hypothèse est correcte (Schroeder et al., (2007) Microbes Infect. 9 (2), 247-250). Dans la troisième et dernière étude de ce manuscrit, nous avons testé le potentiel des protéines IRACs comme candidat antigénique pour le développement dun vaccin anti tique. Des recombinants de lherpèsvirus bovin 4 (BoHV-4) exprimant IRAC I ou IRAC II ont été produits. De façon intéressante, nous avons observé que bien que les recombinants BoHV-4 expriment de hauts taux de protéines IRACs fonctionnelles in vitro, les lapins immunisés à laide des recombinants BoHV-4 exprimant les IRACs ne développent pas de réponse humorale détectable à lencontre des transgènes. Dans le but daugmenter limmunogénicité des IRACs exprimés comme transgène, une seconde génération de recombinants BoHV-4 a été produite. Ceux-ci induisent lexpression des IRACs sous la forme de protéines de fusion transmembranaires à la surface des cellules infectées. Linoculation de ces recombinants à des lapins a engendré le développement dune forte réponse humorale à lencontre des IRACs. Néanmoins, cette réponse immune na pas engendré deffet majeur sur le repas sanguin de femelles Ixodes ricinus placées sur les lapins immunisés. / An increasing number of studies demonstrate that inhibition of host complement activation is crucial for completion of the blood feeding process of hematophagous parasites. A review of these studies has been published in Developmental and Comparative Immunology (Schroeder et al., (2009) Dev. Comp. Immunol. 33, 5-13). Several observations suggest that inhibition of the host complement alternative pathway by tick salivary proteins is crucial for the achievement of blood feeding and efficient transmission of the pathogens transmitted by the parasite. Strongly supporting this conclusion, a salivary protein able to inhibit the alternative pathway was cloned from the American tick Ixodes scapularis (Valenzuela et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 18717-18723). Interestingly, this molecule, termed Isac, has no similarity to any previously reported anti-complement molecules suggesting that it has been acquired through a mechanism of convergent evolution. In addition to this fundamental aspect, Isac is also a promising candidate antigen for the development of an anti-tick vaccine potentially able to induce the reject of the tick and/or to prevent the transmission of the pathogens. The initial goal of the present work was to clone the orthologue of Isac from the European tick Ixodes ricinus. Interestingly, two different sequences were isolated from the transcriptome of I. ricinus salivary glands (Daix et al., (2007) Insect Mol. Biol. 16 (2), 155-166). Expression of these sequences revealed that they both encode secreted proteins able to inhibit the complement alternative pathway. These proteins were called I. ricinus anticomplement (IRAC) protein I and II. Further characterization of IRACs using monoclonal antibodies revealed that both proteins are expressed constitutively in I. ricinus salivary glands and are up-regulated during blood feeding. Analysis of a series of individual ticks revealed that all ticks tested express both IRAC I and IRAC II, demonstrating that they are the products of different genes and not of alleles of the same locus. Finally, phylogenetic analyses of the I. ricinus IRAC I and II sequences together with homologues from I. scapularis and I. pacificus demonstrates that ticks belonging to the Ixodes ricinus complex encode a new family of relatively small anti-complement molecules undergoing diversification by positive Darwinian selection. Phylogenetic analyses of IRACs suggested that these sequences were diversifying by a process of positive Darwinian selection, possibly leading to molecules with different biological properties. In the second study, we tested the hypothesis that each paralogue may have different inhibitory activities against the complement of different natural host species, thereby contributing to broaden the host range of I. ricinus ticks. The data obtained demonstrated that this working hypothesis is correct (Schroeder et al., (2007) Microbes Infect. 9 (2), 247-250). In the third and last chapter of the present manuscript, we addressed the potential of IRAC I and II as candidate antigens for the development of an anti-tick vaccine. Bovine herpesvirus 4 (BoHV-4) recombinants expressing IRAC I or II were produced. Interestingly, we observed that although both recombinants expressed high levels of functional IRAC proteins in vitro, our attempts to immunize rabbits against IRACs via infection with these viruses invariably failed. In order to improve the immunogenicity of IRACs expressed as transgene, a second generation of BoHV-4 recombinants was produced. The latter expressed IRACs as transmembrane fusion proteins on cell surface. Comparison of the vaccine potential of BoHV-4 recombinant viruses expressing either secreted or transmembrane IRAC proteins revealed that while the former did not induce a detectable immune response against IRACs, the latter led to high titers of anti-IRAC antibodies. However, the immune response induced against IRACs did not lead to the reject of the tick but only slightly increased the duration of the blood feeding process.

Au Canada, les pertes de rendement en agriculture attribuées aux nématodes sont généralement associées aux nématodes des lésions du genre Pratylenchus. En 2011, la découverte d’une nouvelle espèce exotique au Canada et qualifiée de rare dans le Nord-Est américain, soit Pratylenchus alleni Ferris, a soulevé de nouvelles inquiétudes. Afin de déterminer si cette espèce représente une menace pour les productions agricoles du Québec, mon projet de maîtrise visait à recueillir des informations sur sa virulence. Dans un premier temps, le spectre d’hôtes de P. alleni a été étudié et les résultats ont montré que ce nématode se développe très bien sur la pomme de terre, mais non sur la luzerne et le trèfle rouge. Ensuite, la reproduction de P. alleni dans un contexte de changements climatiques a été étudiée. L’augmentation prévue des températures et CO2 devrait favoriser le développement de P. alleni puisqu’il possède un meilleur taux de reproduction sur le soya lorsque soumis à un régime de températures de 17/28 ˚C et à une concentration en CO2 de 1200 ppm comparativement à 12/23 ˚C (400 ppm) et 15/26 ˚C (800 ppm). Dans cette même étude, une réduction de 19 à 58 % du poids sec racinaire des plants de soya inoculés avec P. alleni a été observée comparativement aux plants témoins. De plus, une méthode moléculaire de détection et de quantification simultanée de P. alleni et P. penetrans, l’espèce de Pratylenchus la plus répandu dans l’Est canadien, par qPCR a également été développée. Pour chacune des deux espèces, une sonde TaqMan associée avec le fluorophore CY5 pour P. alleni et FAM pour P. penetrans ciblant la région D2/D3 de la grande sous-unité ribosomale (28S) ont été développées et celles-ci se sont avérées spécifiques à chaque espèce. Ces résultats amènent de nouvelles connaissances sur ce ravageur et mettent en lumière sa pathogénicité. / In Canada, yield losses attributed to nematodes are generally associated with root-lesion nematodes from the genus Pratylenchus. In 2011, a new exotic species was detected in Canada and identified as Pratylenchus alleni Ferris. Pratylenchus alleni is rare in the Northeastern U.S. and its discovery has raised new concerns. To determine whether this species is a threat to agricultural production in Québec, my project aims to collect information about its pathogenicity. First, the host range of P. alleni was studied and the results showed that the nematode was developing well on potato, but poorly performed on alfalfa and red clover. The reproduction of P. alleni has also been studied in a context of climate change. The results showed that anticipated temperature and CO2 increases should favor P. alleni since it has a better reproduction rate on soybeans subjected to a night/day temperature regime of 17/28°C and a CO2 concentration of 1200 ppm compared to 12/23˚C (400 ppm) and 15/26°C (800 ppm) regimes. In the same study, a reduction of 19 to 58 % of roots dry weight of soybeans inoculated with P. alleni was observed compared to control plants. A simultaneous molecular detection and quantification method by qPCR of P. alleni and P. penetrans, the most widespread Pratylenchus species in Eastern Canada, was also developed. For each species, a TaqMan probe associated with the CY5 fluorophore for P. alleni and FAM for P. penetrans targeting the D2/D3 expansion segments of the large ribosomal subunit (28S) were developed and proved to be specific to each species. These results bring new insights into this new pest and highlight its pathogenicity.

L’évolution divergente est un processus clef générant de la biodiversité. Elle peut avoir lieu entre localités, via la réduction des flux de gènes, et au sein des localités via la spécialisation écologique. Dans le cas des systèmes parasitaires multi-hôtes, l’adaptation dépend des taux relatifs de flux de gènes des hôtes et des parasites entre différentes localités, ainsi que des échanges locaux de parasites entre différents types d’hôtes. En combinant génétique des populations et expérimentations sur le système composé de la puce Ceratophyllus gallinae et deux de ses hôtes, la mésange charbonnière Parus major et le gobe-mouche à collier Ficedula albicollis dans un habitat fragmenté, nous avons examiné comment l’adaptation et l’isolation génétique façonnent l’évolution des parasites. Nous avons aussi testé comment les choix d’habitat des hôtes pouvaient influencer la rencontre avec des populations de parasites spécialisées. Les analyses de microsatellites révèlent que les populations de puce sont différenciées à une échelle spatiale fine, et fréquemment entre espèces hôtes. De plus, des populations de parasites semblent adaptées à chaque type d’hôte. Cependant, aucune variation dans les choix d’habitats par rapport aux parasites n’a été observée chez les hôtes. Enfin, la réponse des hôtes aux parasites variait entre nos deux zones réplica ; l’histoire des populations d’hôtes pourrait donc influer sur la coevolution avec leurs parasites. Ce système semble donc localement façonné à la fois par une isolation génétique et une sélection par différents hôtes. L’étude de nouveaux sites permettraient d’évaluer si cette évolution divergente peut être génératrice de biodiversité / Divergent evolution is a key process generating biodiversity. This can occur between localities, through reduced gene flow followed by local adaptation or genetic drift, and within localities through ecological specialization. In the case of multi-host parasite systems, adaptation can be driven by the relative rate of host-parasite gene flow among spatially isolated populations, and the amount of parasite exchange among local host types. Combining population genetics and field experiments, we examined how adaptation and genetic isolation shape parasite evolution. Focusing on the hen flea Ceratophyllus gallinae, a presumed host generalist, and two of its hosts, the great tit Parus major and the collared flycatcher Ficedula albicollis, we investigated parasite population structure and adaptation within a fragmented landscape. Additionally, we tested how hosts can influence encounter rates with specialized flea populations through their habitat choice. Neutral markers analyses show that flea populations are genetically differentiated at fine spatial scales, and frequently between the two host species. Evidence for parasite adaptation to each host type were also observed. Host specialization may therefore be ongoing in hen fleas. However, birds did not show specific habitat choice strategies regarding flea-infested nests. Host responses differed between two replicate sites, indicating that local population history may impact parasite evolution. Both isolation and host-based selection are therefore acting on hen flea populations at a local scale. Investigations in new localities will help to assess to what extend this divergent evolution may generate biodiversity