Au sein des populations naturelles d'êtres vivants circulent une diversité de parasites, qu'il s'agisse de plusieurs espèces, souches ou plus généralement types. Si certains modèles d'épidémiologie évolutive intègrent déjà le polymorphisme des parasites, rares sont ceux pour lesquels la dynamique épidémiologique dépend de la croissance intra-hôte et des interactions que les parasites entretiennent lorsqu’ils infectent le même hôte. Les complexité combinatoire et dynamique explique pourquoi il n'y a pour l'heure pas de prédiction générale de l'évolution de la virulence dans de tels contextes d'infections multiples. À la recherche d'une tendance générale d'évolution de la virulence, nous modélisons chaque niveau de dynamique sur lequel l'évolution des parasites repose. En particulier, nous étudions explicitement les interactions et l'issue de la compétition au sein des hôtes, les dynamiques épidémiologique et enfin adaptative. Sur l'exemple des infections chroniques causées par des micro-parasites transmis horizontalement, nous employons les approches propres aux systèmes dynamiques et aux probabilités pour emboîter cette suite de dynamiques afin d'en explorer les conséquences évolutives. Nous définissions notamment le concept de patron d'infection, à savoir l'ensemble des issues intra-hôte associées à chaque configuration d'inoculation et décrivons cinq patrons jusqu'ici non décrits, lesquels échappent à la dichotomie classique entre super- et coinfection. Cette typologie nous permet par la suite d'envisager l'évolution de la virulence dans un cadre général. Nous observons en particulier une inéluctable mais bornée croissance évolutive de la virulence. / Natural populations of living beings are exposed to a diversity of parasites, be they several species, strains or more generally types. While some evolutionary epidemiology models already incorporate parasite polymorphism, few make the connection between between-host dynamics and within-host parasite growth. As parasite polymorphism can even occur within the same host, distinct parasite types can interact in various ways and thus interfere with their transmission and therefore their evolution. The combinatorial and dynamical complexity explains why we still lack general predictions regarding the evolution of virulence in such multiple infection contexts. Seeking for a general trend in virulence evolution, we model each dynamical level on which parasite evolution relies. In particular, we explicitly investigate the within-host interactions and competition outcomes, the epidemiological and adaptive dynamics. Focusing on chronic infections caused by horizontally-transmitted microparasites, we apply both dynamical systems and probabilistic approaches to this nested sequence of dynamics to explore the evolutionary outcomes. We notably define the concept of infection pattern, that is the set of within-host outcomes of all inoculation challenges and identify five yet undescribed patterns that escape from the classical super/coinfection dichotomy. This typology then allows us to address virulence evolution under a general framework. We in particular observe an unavoidable but bounded evolutionary increase in virulence.

Les HPV sont les agents d'infections latentes, d'hyperplasies bénignes ou encore de cancer. Afin de mieux comprendre leur pathogenèse, nous avons cartographié les réseaux d'interactions de protéines de régulation virale E2 pour 12 génotypes HPV. Par double hybride, nous avons procédé à l'identification des interacteurs des protéines E2 suivi par une validation en cellule de mammifère par une méthode basée sur la reconstitution d'une luciferase. Le regroupement des profiles d'interaction montre une corrélation avec la phylogénie, établissant ainsi la contribution de E2 dans la pathogénie associée aux HPV. L'étude des réseaux d'interaction a révélé le ciblage préférentiel de protéines cellulaires hautement connectées, impliquées dans 5 catégories fonctionnelles récapitulant les principales fonctions de E2 mais aussi ouvrant de nouvelles perspectives quant au rôle de cette protéine virale dans les mécanismes d'infection. Dans un deuxième temps, ce travail s'est focalisé sur l'étude d'une interaction impliquant spécifiquement la protéine E2 d'HPV16, le virus le plus représenté dans les cancers cervicaux, et une protéine cellulaire, CCHCR1. En identifiant la surface d'interaction de CCHCR1 sur E2, il s'est avéré qu'elle induisait une compétition avec BRD4, un interacteur majeur de E2, se traduisant par une diminution des capacités transcriptionelle de E2. De même, nous avons montré que CCHCR1 induisait la délocalisation de E2 du noyau vers le cytoplasme. Enfin, nos résultats indiquent qu'en présence de CCHCR1, HPV16 E2 est moins apte à induire la différentiation précoce des kératinocytes, ce qui pourrait potentiellement avoir un effet important sur le cycle viral.

Les virus infectant les archées présentent des morphotypes inhabituels et des génomes extrêmement divers. Leur isolation a permis de développer nos connaissances sur la diversité de la virosphère et demeure une piste de recherche primordiale. Durant ma thèse, j’ai isolé et caractérisé de nouveaux virus d'archées et étudié les interactions virus-hôte dans un système modèle bien établi. Des cultures d'enrichissement et des analyses bioinformatiques nous ont permis de décrire de nouveaux virus de crénarchées hyperthermophiles infectant les espèces du genre Pyrobaculum et ainsi de mieux comprendre la diversité architecturale des virus filamenteux. De plus, un provirus a été identifié chez P. oguniense et l’étude de sa réplication a révélé par microscopie électronique des nanostructures pyramidales à la surface des cellules ressemblant à des structures connues de sortie des virions chez des virus de crénarchées. Deux études de protéomique nous ont fourni un aperçu de la dynamique du protéome de Sulfolobus islandicus : l’analyse du protéome de cellules de S. islandicus non infectées a révélé de nombreuses modifications post-traductionnelles, et l’analyse de la régulation des protéines dans des cellules de S. islandicus infectées par le virus SIRV2 a révélé 136 protéines de l'hôte présentant une régulation temporelle significative. L’analyse structurale de SIRV2 a permis d'étudier la résistance des virus crénarchées à des conditions extrêmes et a révélé pour la première fois que la forme A de l'ADN est biologiquement pertinente. Ces résultats ont contribué au développement des connaissances sur la diversité de la virosphère et sur l'évolution des virus d'archées. / Viruses infecting Archaea display unusual morphotypes and highly diverse genomes. Several virus-host systems have emerged enabling the detailed characterization of virus-host interplay in archaea. However, isolation of new archaeal viruses proved to be instrumental for expanding the knowledge on the diversity of the Earth’s virosphere. Therefore, I have focused on two major lines of research: isolation of new archaeal viruses and characterization of the virus-host interactions in a well-established model system. A new Pyrobaculum virus with a unique architecture among DNA viruses was described, expanding our knowledge on the diversity of architectural solutions explored by filamentous viruses. Furthermore, attempts to trigger the replication of a provirus in P. oguninese led to the development of six-fold pyramidal nanostructures on the cell surface, resembling known virion egress structures of archeal viruses. Finally, I focused on the interplay between Sulfolobus islandicus and the rod-shaped virus SIRV2. Two proteomic studies yielded insights into the dynamics and posttranslational modifications (PTMs) of the Sulfolobus proteome. Sulfolobus proteins were found to carry a high degree of PTMs on functionally diverse proteins. The global analysis of the regulation of viral and host proteins in SIRV2-infected S. islandicus cells yielded insights the temporal regulation of host and virus proteins. Structural studies on SIRV2 virion have resulted in the first ever description of A-form DNA being a biologically relevant form of DNA. Together, these results contribute to the knowledge on the diversity of the extant virosphere, and the biology and evolution of archaeal viruses.

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Le virus de la fièvre catarrhale ovine (Bluetongue virus, BTV) est l’agent étiologique de la maladie du même nom, une arbovirose non contagieuse transmise aux ruminants domestiques et sauvages par l’intermédiaire de morsures de moucherons hématophages du genre Culicoides. Il existe actuellement 27 sérotypes décrits de BTV à travers le monde qui se distinguent par les pathologies qu’ils induisent et leur capacité à infecter et se propager chez leur(s) hôte(s) mammifère(s). Le premier objectif de mon projet de thèse visait à identifier les interactions cellulaires spécifiques des sérotypes 8 et 27 pour identifier des facteurs de pathogénicité/virulence et/ou de franchissement de barrière d’espèces. Pour atteindre cet objectif, l’ensemble des protéines virales du BTV a été criblé par la méthode du double-hybride en levure contre deux banques d’ADN complémentaires, l’une d’origine bovine et l’autre d’origine culicoïde. A l’issue de 70 cribles, une centaine de nouvelles interactions virus-hôtes a été mise en évidence et révèle un enrichissement pour quatre processus cellulaires : l’épissage des ARNm, les ribosomes, la SUMOylation et l’apoptose. Cette étude nous a ainsi permis de réaliser le premier interactome pour le BTV qui se poursuit au travers de multiples validations biochimiques et fonctionnelles des interactions identifiées. En parallèle de ce travail de protéomique, le second objectif de mon projet de thèse a été de déterminer l’impact du BTV sur la voie MAPK/ERK, une voie cellulaire essentielle à la prolifération et différenciation cellulaire et classiquement modulée lors d’infections virales. En plus de son rôle antagoniste sur la voie des interférons de type I, nous avons démontré la capacité de la protéine NS3 de BTV à activer la voie MAPK/ERK. En effet, nous avons démontré que NS3 a la capacité d’augmenter le niveau de phosphorylation des protéines kinases ERK1/2 mais également du facteur de traduction eIF4E. Cette fonction, qui semble être spécifique au BTV par rapport aux autres orbivirus, implique l’interaction de NS3 avec la protéine cellulaire BRAF, une protéine MAP3 kinase jouant un rôle majeur dans l’activation de la voie MAPK/ERK. L’activation cette voie par NS3 pourrait être un mécanisme de détournement de la traduction cellulaire au profit de celle du virus mais aussi constituer un élément de réponse pour expliquer l’hyper-inflammation observée dans le cas d’une infection par ce virus / Bluetongue virus (BTV) is the etiological agent of the bluetongue (BT) disease, a non-contagious arbovirus that affects a wide range of wild and domestic ruminants. It is transmitted by blood-feeding midges of the genus Culicoides. There are currently 27 serotypes described of BTV in the world that are distinguished by their differences in term of pathology/virulence and their capacity to infect and disseminate in their mammalian host(s). The first objective of my thesis project was to identify specific cellular interactions of serotype 8 and 27 to reveal new factors of pathogenicity/virulence and/or cross species barrier. To reach this goal, all the proteins encoded by BTV were used as baits to screen, by a high-throughput yeast two-hybrid (Y2H) approach, two complementary DNA libraries originating from hosts naturally infected by BTV : Culicoides and cattle. Therefore, 70 screens were performed to identify a hundred of new virus-host interactions and reveal an enrichment for four cellular processes : mRNA splicing, ribosomes, SUMOylation and apoptosis. This study allowed us to build the first interactome of BTV which continues through multiple biochemical and functional validations of the identified interactions. In parallel to this proteomics work, my second objective was to determine the impact of BTV on the MAPK/ERK pathway, a cellular pathway essential for cell proliferation and differentiation usually modulated during viral infections. In addition to its antagonist role on the type I interferon pathway, we have demonstrated the ability of BTV-NS3 to activate the MAPK/ERK pathway. Indeed, we have demonstrated that NS3 has the ability to increase the level of phosphorylation of ERK1/2 protein and the eIF4E translation factor. This function, which seems to be specific to BTV compared to other orbiviruses, involves the interaction of NS3 with BRAF cellular protein, a MAP3 kinase protein that plays a major role in the regulation of the MAPK/ERK pathway. These results could provide a better understanding of the molecular basis underlying the hijacking of the translation machinery to support virus replication but also constitute a hypothesis to explain the hyperinflammation observed in the BTV infection context

Hepatitis C virus (HCV) is a single-stranded plus-sense RNA virus that is transmitted by blood-to-blood contact, and infects the human liver. HCV has a unique dependence on the liver-specific microRNA miR-122, where miR-122 binds the 5´ un-translated region of the viral RNA at two tandem sites and increases viral RNA abundance. The mechanisms of augmentation are not yet fully understood, but the interaction is known to stabilize the viral RNA, increase translation from the viral internal ribosomal entry site (IRES), and result in increased viral yield. In an attempt to create a small animal model for HCV, we added miR-122 to mouse cell lines previously thought non-permissive to HCV, which rendered these cells permissive to the virus, additionally showing that miR-122 is one of the major determinants of HCV hepatotropism. We found that some wild-type and knockout mouse cell lines – NCoA6 and PKR knockout embryonic fibroblasts – could be rendered permissive to transient HCV sub-genomic, but not full-length, RNA replication upon addition of miR-122, and that other wild-type and knockout cell lines cannot be rendered permissive to HCV replication by addition of miR-122. These knockout cell lines demonstrated varying permissiveness phenotypes between passages and isolates and eventually completely lost permissiveness, and we were unable to achieve sub-genomic RNA replication in PKR knockout primary hepatocytes. Knockdown of NCoA6 and PKR in Huh7.5 cells did not substantially impact sub-genomic replication, leading us to conclude that there are additional factors within the cell lines that affect their permissiveness for HCV replication such as epigenetic regulation during passage or transformation and immortalization. We also added miR-122 to Hep3B cells, a human hepatoma cell line lacking expression of miR-122 and previously thought to be non-permissive to HCV replication. Added miR-122 rendered the cells as highly permissive to HCV replication as the Huh7-derived cell lines commonly used to study the virus. In these cells, we were also able to observe miR-122-independent replication of sub-genomic HCV RNA. This was verified by use of a miR-122 antagonist that had no impact on the putative miR-122-independent replication, and by mutating the miR-122 binding sites to make them dependent on a single nucleotide-substituted microRNA. This replication in the absence of miR-122 was not detected in full-length HCV RNA, but was detectable using a bi-cistronic full-length genomic replicon, suggesting that the addition of a second IRES in sub-genomic and full-genomic replicons altered replication dynamics enough to allow detectable RNA replication without miR-122 binding. Because miR-122 has been implicated in protecting the viral RNA from destabilization and degradation by Xrn1, the main cytoplasmic 5´ to 3´ RNA exonuclease, we employed our miR-122-independent system to test this miR-122-mediated protection. We verified that miR-122 functions to protect the viral RNA from Xrn1, but this was insufficient to account for the overall impact of miR-122 on replication, meaning that miR-122 has further functions in the virus’ life cycle. We showed that the effect of miR-122 on translation is due to stabilization of the RNA by protecting it from Xrn1, through binding at both sites. We further evaluated the role of each miR-122 binding site (S1 and S2) in the virus life cycle, and found that binding at each site contributes equally to increasing viral RNA replication, while binding at both sites exerts a co-operative effect. Finally, we determined that binding of miR-122 at site S2 is more important for protection from Xrn1, suggesting that miR-122 binding at S1 is more important for the additional functions of miR-122 in enhancing HCV RNA accumulation. Altogether, we have shown that miR-122 is partially responsible for the hepatotropic nature of Hepatitis C virus, and that supplementation with this microRNA can render non-permissive cells permissive to viral replication. We have also identified and confirmed replication of both sub-genomic and full-length HCV RNA in the absence of miR-122. Finally, we have characterized the impact of the host RNA exonuclease Xrn1 on the HCV life cycle, and determined the roles of each miR-122 binding site in shielding the viral RNA from this host restriction factor.

Les probiotiques sont des « microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent un effet positif sur la santé de l’hôte ». Ils agissent en modulant le système immunitaire, en empêchant l’adhésion et/ou la croissance des bactéries pathogènes, en renforçant la barrière intestinale et en stabilisant sa microflore. Cependant, les mécanismes d’action de ces bactéries restent encore peu connus.Ce travail de thèse propose d’élucider les modes d’action de deux souches de Bacillus probiotiques humains : Bacillus clausii O/C et de Bacillus subtilis CU1.L’adhésion des probiotiques aux surfaces intestinales est un facteur important pour leur persistance dans l’organisme, l’immunomodulation et la compétition envers les agents pathogènes. B. clausii et B. subtilis présentent de fortes capacités d’adhésion sous forme de spores grâce à leurs protéines de surface préférentiellement impliquées dans les interactions avec l’hôte. En effet, celles-ci jouent un rôle prépondérant dans la stimulation de l’expression des gènes codant les cytokines dans les cellules Caco-2 et la production de cytokines par les cellules immunitaires, induite par les souches probiotiques, via la liaison avec des récepteurs de l’hôte. Des protéines S-layers, protéines ribosomales et protéases ont été identifiées à la surface de ces souches, ainsi qu’une grande quantité de flagelline à la surface de B. subtilis.Par ailleurs, les composés sécrétés par les souches stimulent également la production de cytokines chimiotactiques et anti-inflammatoires. B. clausii sécrète une protéase capable de neutraliser plusieurs types de toxines dont celles sécrétées par C. difficile et B. cereus. B. subtilis n’a montré aucune propension pour l’inhibition de l’adhésion des agents pathogènes testés, mais un essai clinique a démontré sa capacité à moduler le système immunitaire et la composition du microbiote intestinal. / Probiotic are ”live microorganisms, which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host”. They act by modulating the immune system, preventing the adhesion and / or growth of pathogenic bacteria, reinforcing the intestinal barrier and stabilizing the microbiota.However, the mechanisms of action of these bacteria are still poorly understood.This thesis proposes to elucidate the mode of action of two human probiotic strains of Bacillus : Bacillus clausii O / C and Bacillus subtilis CU1.The adhesion of probiotics to intestinal surfaces is an important factor for their persistence in the host, immunomodulation and competition with pathogens. B. clausii and B. subtilis have strong abilities to adhere as spores, through their surface-associated proteins which are preferentially involved in interactions with the host. Indeed, they play a key role in the up-regulation of gene expression encoding cytokines in Caco-2 cells and in the stimulation of cytokine production by immune cells, induced by probiotic strains, through binding with host receptors. Some S-layers proteins, ribosomal proteins and proteases have been identified on the surface of these strains, and a large quantity of flagellin on the surface of B. subtilis.In addition, secreted compounds of these probiotics also stimulate the production of chemotactic and anti-inflammatory cytokines. B. clausii secretes a protease able to neutralize several types of toxins, including those secreted by C. difficile and B. cereus. B. subtilis has not predisposition to compete with the adhesion of pathogens tested, but a clinical trial has demonstrated its ability to modulate the immune system and the composition of the intestinal microbiota.

Bien que le Virus Respiratoire Syncytial, responsable de la bronchiolite du nourrisson, soit aujourd’hui un problème de santé publique majeur, il n’existe encore aucun vaccin ou antiviral curatif contre ce pathogène. Le manque de données sur les étapes clés du cycle viral et sur les interactions virus-cellule freine le développement de nouvelles molécules antivirales.Nous avons étudié l’interactome de deux protéines virales : la polymérase L et le facteur de transcription M2-1. Dans ce but, nous avons mis au point un crible s’appuyant à la fois sur des critères d’interactomique et sur des critères fonctionnels.La première étape consistait à identifier des partenaires potentiels de M2-1 et L par des co-immunoprécipitations couplées à une approche de protéomique quantitative. Pour plus de pertinence, ce crible a été réalisé sur cellules infectées, grâce des virus recombinants produits par génétique inverse. Ceci nous a permis d’identifier 45 et 137 partenaires potentiels de L et M2-1 respectivement. Une étude systématique de l’impact de l’inhibition de 15 partenaires potentiels de M2-1 sur la multiplication virale a mis en avant trois candidats : ILF2, PABPN1 et PABPC1.Nous nous sommes par la suite concentrés sur PABPC1. L’inhibition de l’expression de PABPC1 altère la multiplication virale, mais nous n’avons pas pu mettre en évidence un effet spécifique sur la transcription ou la traduction virale. Son interaction avec M2-1 a été confirmée, et le domaine MLLE de PABPC1 a été identifié comme le site de liaison à M2-1. L’interaction entre M2-1 et PABPC1 a été observée à la fois dans le cytoplasme et dans les IBAGs, des sous-structures concentrant les ARNm viraux au sein des corps d’inclusion viraux. Nous avons formulé l’hypothèse que M2-1, liée à PABPC1, accompagne les ARNm viraux après leur sortie des corps d’inclusion. Ceci suggère un rôle de M2-1 dans le devenir des ARNm viraux en aval de leur transcription. / Although the Respiratory Syncytial Virus, responsible of bronchiolitis in infants, represents a major public health problem, there are currently no vaccine or curative antiviral directed against it. The lack of information on key steps of its viral cycle and on virus-cell interactions hinders the development of new antiviral molecules.We chose to study the interactome of two viral proteins: the polymerase L and the transcription factor M2-1. To do so, we developed a screen based on interactomic and functional criteria.The first step consisted in identifying potential binding partners of M2-1 and L by co-immunoprecipitations coupled to quantitative proteomics. For better relevance, this screen was realised on infected cells, thanks to recombinant viruses produced by reverse genetics. 45 and 137 potential binding partners of M2-1 and L respectively were thus identified. A systematic study of the inhibition of 15 potential partners of M2-1 and its impact on viral multiplication enabled the selection of three candidates: ILF2, PABPN1 and PABPC1.We chose to concentrate on PABPC1. The inhibition of PABPC1’s expression reduces viral multiplication, but no specific effect on viral transcription or translation was brought to light. Its interaction with M2-1 was confirmed, and the MLLE domain of PABPC1 was identified as the M2-1 binding site. The interaction between M2-1 and PABPC1 was observed both in the cytoplasm and in IBAGs, substructures of viral inclusion bodies where viral mRNA accumulate. We formulated the hypothesis that M2-1, with PABPC1, stays with viral mRNA after leaving inclusion bodies and during their translation. This suggests a role for M2-1 in the fate of viral mRNA downstream of transcription.

Tesis por compendio / [ES] Los viroides son los patógenos con replicación autónoma más simples y sólo se han encontrado de forma natural infectando plantas superiores. Desde que se descubrieron en los años setenta, se ha adquirido un conocimiento considerable sobre su naturaleza y mecanismos de replicación en las plantas huésped. Sin embargo, aún quedan por descubrir muchos aspectos de la biología de los viroides. Por lo tanto, un conocimiento más profundo de la naturaleza y el modo de acción de los viroides han sido los objetivos principales que engloban esta tesis. Para ello, es esencial contar con procedimientos sencillos y eficientes para la obtención de clones de ADNc infecciosos. Se desarrolló un nuevo método eficiente para construir clones de viroides infecciosos y se probó con un viroide de cada familia: El viroide latente de la berenjena (ELVd, Avsunviroidae) y el viroide del lúpulo (HSVd, Pospiviroidae). Esta aproximación se basó en enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera del sitio de reconocimiento y supone un procedimiento universal para obtener clones infecciosos de un viroide independientemente de su secuencia, con una alta eficiencia. A pesar de que los viroides han sido considerados como ARN no codificantes desde su descubrimiento, nuestro análisis computacional predijo pequeños marcos de lectura abiertos en cada uno de los genomas de HSVd y ELVd. No se encontraron similitudes significativas con las proteínas de la base de datos de plantas superiores, pero algunos de estos péptidos predichos estaban altamente conservados entre todas las variantes de HSVd y ELVd. Curiosamente, la fusión de estas secuencias conservadas con una proteína fluorescente reveló una localización subcelular específica en el correspondiente orgánulo donde tiene lugar la replicación/acumulación para cada viroide: nucleolo y cloroplasto para HSVd y ELVd, respectivamente. Las mutaciones que truncan el dominio nucleolar de HSVd fueron perjudiciales para el viroide, mientras que el truncamiento de cualquiera de los dos ORF de ELVd que contiene una señal de localización al cloroplasto también disminuyó (pero en menor medida) la eficiencia biológica del viroide, tal vez debido a la redundancia funcional. Se encontraron formas circulares de los ARN de HSVd y ELVd en fracciones polisómicas, lo que revela su interacción física con la maquinaria de traducción de la célula vegetal. En conjunto, estas observaciones experimentales indican que no se puede descartar la capacidad de codificación de los viroides, aunque la prueba definitiva (la detección de los péptidos codificados por los circRNAs) es un reto tecnológico que deberá abordarse en futuras líneas de investigación. Finalmente, para estudiar qué cambios se producen en el huésped durante la infección con un viroide sintomático, se realizó un análisis integrador de las alteraciones genómicas de plantas de pepino infectadas con HSVd. Se integraron los transcriptomas, el sRNAnomas y el metilomas para determinar la respuesta temporal a la infección por el viroide. Nuestros resultados apoyan que el HSVd promueve el rediseño de las vías reguladoras del pepino afectando predominantemente a capas reguladoras específicas en diferentes fases de la infección. La respuesta inicial se caracterizó por una reconfiguración del transcriptoma del hospedador mediante el uso diferencial de exones, seguido de una predominante regulación a la baja de la actividad transcripcional modulada por los cambios epigenéticos del hospedador asociados a la infección y caracterizada por un aumento de la hipermetilación. Las alteraciones en el metabolismo de los ARN pequeños y microARNs del huésped fueron marginales y se produjeron principalmente en la fase tardía. En general, estos datos constituyen el primer mapa exhaustivo de las respuestas de la planta a la infección de un viroide. / [CA] Els viroids són els patògenes més simples amb replicació autònoma i només s'han identificat de forma natural infectant a plantes superiors. Des que es descobriren als anys setanta, s'ha adquirit un coneixement considerable sobre la seua natura i els mecanismes de replicació en plantes hoste. No obstant, encara queden per descobrir molts aspectes de la biologia dels viroids. Per tant, un coneixement més profund de la natura i el mode d'acció dels viroids han sigut els objectius principals que engloben aquesta tesi. Per a això, és essencial la disponibilitat de procediments senzills i eficients per a l'obtenció de clones infecciosos. Es va desenvolupar un nou mètode eficient per a construir clones infecciosos y es fa provar amb un viroid de cada família: el viroide latent de la albergínia (ELVd, Avsunviroidae) y el viroid del llúpol (HSVd, Pospiviroidae). Aquesta aproximació es basà en enzims de restricció de tipus IIS que tallen fora del lloc de reconeixement i suposa un procediment universal per obtenir clones infecciosos de un viroid independentment de la seua seqüencia amb una elevada eficiència. Tot i que els viroids s'han considerat com ARNs no codificants des del seu descobriment, el nostre anàlisi computacional va predir xicotets ORF als genomes de HSVd y ELVd. No es trobaren similituds significatives amb proteïnes depositades a les bases de dades, però alguns d'aquest pèptids estaven altament conservats a les variants de HSVd y ELVd. Curiosament, la fusió d'aquestes seqüencies conservades amb una proteïna fluorescent revelà una localització subcel·lular especifica al orgànul on te lloc la replicació/acumulació de cada viroid: nuclèol i cloroplast per a HSVd i ELVd, respectivament. Les mutacions que trunquen el domini nucleolar de HSVd foren perjudicials per al viroid, mentre que el truncament de qualsevol de les dos ORF de ELVd que contenen una senyal de localització al cloroplast també va disminuir (però en menor mesura) l'eficiència biològica del viroid, el que pot ser degut a una redundància funcional. Es detectaren formes d'ARN circular de HSVd i ELVd a les fraccions polisòmiques, el que revela la seua interacció física amb la maquinaria de traducció cel·lular. En conjunt, aquestes observacions experimentals indiquen que no es pot descartar la capacitat codificants dels viroids, encara que la evidencia definitiva (la detecció del pèptids codificats per ARN circulars) es un repte tecnològic que s'haurà d'adreçar en línies d'investigació futures. Finalment, per tal d'estudiar que canvis es produeixen a l'hoste durant la infecció amb un viroid simptomàtic, es va realitzar un anàlisi integrador de les alteracions genòmiques de les plantes de cogombre infectades amb HSVd. S'integraren els transcriptomes, sARNomes i metilomes per determinar la resposta temporal a la infecció per viroid. Els resultats obtinguts suporten que HSVd promou un redisseny de les vies reguladores de cogombre afectant predominantment a nivells reguladors específics a les diferents etapes de la infecció. La resposta inicial es caracteritzà per una reconfiguració del transcriptoma de l'hoste mitjançant l'ús diferencial d'exons, seguit d'una repressió transcripticional modulada per canvis epigenètics de l'hoste caracteritzats per una major hipermetilació. Les alteracions al metabolisme de ARN xicotets i microARNs de l'hoste van ser marginals i es produïren principalment al final de la infecció. En general, aquestes dades constitueixen el primer mapa exhaustiu de les respostes de la planta a la infecció per un viroid. / [EN] Viroids are the simplest pathogens with autonomous replication and have only been found naturally infecting higher plants. Since viroids were discovered in the seventies, we have gained considerable knowledge about their nature and replication mechanisms in host plants. However, many aspects of viroid biology are yet to be discovered. Therefore, a deeper understanding of the nature and mode of action of viroids have been the encompassing main goals of this thesis. For this purpose, simple and efficient procedures for obtaining infectious cDNA clones are essential. A new efficient method for constructing infectious viroid clones was developed and tested with one viroid of each family: eggplant latent viroid (ELVd, Avsunviroidae) and hop stunt viroid (HSVd, Pospiviroidae). This procedure was based on type IIS restrictions enzymes that cut outside of the recognition site and supposes a universal procedure for obtaining infectious clones of a viroid independently of its sequence, with a high efficiency. Despite viroids have been considered as plant-pathogenic non-coding RNAs since their discovery, our computational analysis predicted small open reading frames in each of the HSVd and ELVd genomes. No significant similarities with proteins in the database of higher plants were found, but some of these predicted peptides were highly conserved among all HSVd and ELVd variants. Interestingly, the fusion of these conserved sequences to a fluorescent protein revealed a specific subcellular localization in the corresponding organelle where replication/accumulation takes place for each viroid: nucleolus and chloroplast for HSVd and ELVd, respectively. Mutations that truncate the nucleolar domain of HSVd were detrimental for the viroid while truncating any of the two ELVd ORF that contains a chloroplast transit signal also diminished (but to a lesser extent) viroid biological efficiency, maybe because of functional redundancy. Circular forms of both, HSVd and ELVd RNAs were found in polysome fractions, revealing their physical interaction with the translational machinery of the plant cell. Altogether, these experimental observations indicate that the coding capacity of viroids cannot be ruled out, although the definitive evidence (detection of the circRNA-encoded peptides) is a technological challenge to be addressed in future research lines. Finally, to study the host changes that are produced during a symptomatic viroid infection, an integrative analysis of the timing and intensity of the genome-wide alterations in cucumber plants infected with HSVd was performed. Differential host transcriptome, sRNAnome and methylome were integrated to determine the temporal response to viroid-infection. Our results support that HSVd promotes the redesign of the cucumber regulatory-pathways predominantly affecting specific regulatory layers at different infection-phases. The initial response was characterized by a reconfiguration of the host-transcriptome by differential exon usage, followed by a predominant down-regulation of the transcriptional activity modulated by the host epigenetic changes associated to infection and characterized by increased hypermethylation. The alterations in host sRNA and microRNA metabolism were marginal and mainly occurred at the late stage. Overall, these data constitute the first comprehensive map of the plant responses to a viroid infection. / La Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana) y el Fondo Social Europeo (FSECV 2014-2020) han cofinanciado la contratación del doctorando como personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2017/114) y unas estancias predoctorales fuera de la Comunitat Valenciana (BEFPI/2020). La realización de esta tesis doctoral también se ha realizado en el marco de dos proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, con cofinanciación de fondos FEDER [BIO2017-88321-R y AGL2016-79825-R] . / Márquez Molins, J. (2022). Novel Insights of Viroid Biology and Host Responses to Their Infection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183479 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

Die Epithelzellen des Dünndarms bilden die Hauptinfektionsroute für viele Protozoen wie zum Beispiel Toxoplasma gondii und Giardia duodenalis. Jedoch sind die Mechanismen dieser Infektionswege unbekannt, da geeignete Modelle fehlen, welche das Darmepithel nachbilden. In der folgenden Studie wurde eine in-vitro Plattform mit Darmorganoiden (organoid derived monolayers oder ODMs) etabliert, welche man für vergleichende Studien zu Parasit-Wirt-Interaktionen anwenden kann. Das ODM-System wurde angewendet, um die Anfangsphase einer T. gondii-Infektion zu modellieren, wobei der Schwerpunkt auf die Rolle von Interferon gamma (IFNγ) und immunitätsbezogenen GTPasen (Irgs) lag. Es wurde gezeigt, dass sich die Irg-abhängige Kontrolle virulenter Toxoplasma-Stämme zwischen dem Labormausmodell und anderen wildlebenden Nagetierarten unterscheidet. Aus diesem Grund wurden Vergleiche mit Organoiden verschiedener Labormausstämme und der Rötelmaus Myodes glareolus durchgeführt. Myodes glareolus ist eine Nagetierart, von der angenommen wird, dass sie eine höhere Resistenz gegen T. gondii aufweist. Basierend auf die Resultate der quantitativen Immunofluoreszentests und qPCR dieser These, führt die Stimulation mit IFNγ zu einer tendenziell verringerten Replikation der Parasitenstämme RH und Prugniaus in M. glareolus ODMs im Vergleich zu Mus ODMs. In dieser Studie, wurde zum ersten Mal die Rolle von Irgs bei intestinalen T. gondii-Infektionen identifiziert. Zu diesem Zweck wurden Organoide von M. glareolus mit einem fluoreszierend markierten Irgb10-Protein transfiziert, wodurch gezeigt werden konnte, dass Irgb10 T. gondii-Vakuolen dekoriert, was auf eine Beteiligung des Irg-Systems hindeutet. Schließlich wurde ein Koinfektionsmodell für T. gondii und/oder G. Duodenalis in Maus-ODMs etabliert. In diesem Modell wurde gezeigt, dass T. gondii weder die Induktion der Barrierestörung durch G. duodenalis noch die Replikation von T. gondii durch G. duodenalis beeinflusst. / The small intestinal epithelium is the primary route of infection for many protozoan parasites such as Toxoplasma gondii and Giardia duodenalis. Understanding the mechanisms of infection with such parasites, has been hindered due to the lack of appropriate models mimicking the complexity of the intestinal epithelium. Here, an in vitro platform was established, using intestinal organoids (organoid derived monolayers or ODMs) for comparative studies on parasite-host interactions. The ODM system was used to model the events during the early phase of a T. gondii infection, focusing on the role of Interferon gamma (IFNγ) and Immunity Related GTPases (Irgs). Irg dependent control of virulent Toxoplasma strains has been shown to differ between the laboratory mouse model and other wild-derived rodent strains. How these responses occur in rodent species that do not belong to the murine family, is yet to be determined. For this reason, comparisons were made with organoids from different laboratory mice strains and the bank vole Myodes glareolus, a non-muridae rodent species assumed to be more resistant to T. gondii. Based on this thesis, stimulation with IFNγ leads to a trend of reduced replication in M. glareolus ODMs compared to Mus ODMs for both Type I parasite strain RH and for Type II strain Prugniaud, based on quantitative immunofluorescence assays and qPCR. Analysis of the role of Irgs in intestinal T. gondii infections was performed, by transfecting organoids from M. glareolus with a fluorescently labelled Irgb10 protein, showing that Irgb10 decorates T. gondii vacuoles, suggesting Irg-system involvement. Finally, a co-infection model in murine ODMs was established for T. gondii and/or G. Duodenalis. Here, it could be observed that T. gondii did not influence G. duodenalis induction of barrier breakdown nor did G. duodenalis influence T. gondii replication.