Bien que le rejet humoral en transplantation rénale soit de mieux en mieux caractérisé, des difficultés diagnostiques persistent et son pronostic reste sombre. Objectifs : dans un tel contexte, nous avons privilégié 2 objectifs : (1) préciser les mécanismes physiopathologiques en cause lorsque des signes d’inflammation microvasculaire tels qu’une glomérulite sont observés isolément sur biopsie systématique ; (2) évaluer le rôle de l’autoimmunité au cours de la transplantation dans le but d’identifier d’éventuels marqueurs prédictifs d’une évolution particulière au cours de la greffe. Méthodes : dans un premier temps, nous avons effectué une analyse clinico-pathologique d’une cohorte de 20 patients avec glomérulite isolée sur biopsie systématique à 3 mois de la greffe, couplée à un phénotypage par analyse transcriptomique. Après cette première étape, les distorsions du répertoire B induites par la greffe ont été évaluées de manière séquentielle par technique d’immuno-empreinte chez 43 patients transplantés rénaux dans l’optique de la caractérisation éventuelle de nouveaux biomarqueurs à valeur diagnostique et pronostique. Résultats et conclusion : il n’y avait pas de différence significative à 3 ans de la transplantation entre le groupe de patients avec glomérulite isolée et le groupe témoin.Cependant, la cohorte de patients étudiée est hétérogène puisqu’une évolution péjorative a été observée chez une minorité de patients, pour lesquels des anticorps anti-HLA (non spécifiques du donneur) étaient plus souvent présents et le grade lésionnel plus élevé. L’étude du répertoire B illustre l’importante hétérogénéité interindividuelle des profils de réactivitévis à vis du tissu rénal. Après transplantation, l’apparition de bandes de réactivité additionnelles était notée chez 19/43 patients, et ce dans toutes les catégories anatomocliniques représentées. L’identification des cibles antigéniques est un complément indispensable de cette approche. / X

Le rejet aigu humoral (RAH) est une complication post-transplantation qui peut conduire à la dysfonction puis la perte du greffon. Le RAH est caractérisé, au niveau histologique, par la présence de lésions endothéliales et d’un infiltrat de macrophages intravasculaires. Cette étude avait pour objectif d’identifier les mécanismes et voies de signalisation impliqués dans l’altération des cellules endothéliales (CE) au cours du RAH et de nouvelles molécules régulatrices. Nous montrons que l’induction du ligand de la voie Notch Dll4 dans les CE et les macrophages est caractéristique du RAH dans les greffons cardiaques. L’expression endothéliale de Dll4et la sécrétion de l’IL-6 par les CE induit la polarisation des macrophages vers un profil pro-inflammatoire de type M1. Nous identifions aussi Dll4 comme un régulateur négatif et pro-apoptotique de la différentiation vers un phénotype suppressif de typeM2. Nous montrons que les cellules microvasculaires sont les cibles cellulaires privilégiées des anticorps non HLA préformés associés à certains RAH en transplantation rénale. Enfin, nous avons mis en évidence l’activité d’une famille de coumarines issues de végétaux sur l’expression endothéliale de molécules de l’inflammation et de l’immunité. Pour conclure,notre étude montre l’importance de la voie Notch dansl’inflammation liée au RAH et identifie DLL4 et IL-6comme de nouveaux médiateurs de l’inflammation et d’une interaction spatiale et fonctionnelle des CE et des macrophages. Ces travaux proposent donc DLL4 etl’IL-6 comme des cibles moléculaires et les coumarines comme nouvelles molécules bioactives pour le contrôle de l’inflammation et du RAH en transplantation. / Acute humoral rejection (RAH) is a post-transplantcomplication that can lead to dysfunction and graftloss. RAH is characterized histologically by thepresence of endothelial lesions and of an infiltrate ofintravascular macrophages. This study aimed toidentify the mechanisms, the signaling pathwaysinvolved in the alteration of endothelial cells (EC) upon RAH as well as new regulatory molecules fortherapeutic approaches. Here, we show that theinduction of the Notch ligand DLL4 in both the EC andmacrophages is a feature of RAH in cardiac allografts.The expression of Dll4 and secretion of IL-6 inducedpolarization of macrophages into proinflammatory M1-type. We further identify Dll4 as a negative and pro-apoptoticregulator of macrophage differentiation towards a suppressive phenotype M2-type. We foundthat glomerular microvascular cells are the cell targetsof preformed non HLA antibodies causing RAH inkidney transplantation. Finally, we have demonstratedthe inhibitory activity of a series of coumarins issued from plants on the endothelial expression of a panel of inflammation and immunity molecules. In conclusion,our study shows the importance of the Notch pathwayin inflammation-related RAH and identifies DLL4 and IL-6 as new mediators of inflammation and spatial andfunctional interaction of the EC and macrophages. Thiswork therefore propose DLL4 and IL-6 as moleculartargets and coumarins as new bioactive molecules forthe control of inflammation and RAH.

La transplantation cardiaque est aujourd'hui la seule option de traitement à long terme pour les patients souffrant d'insuffisance cardiaque terminale. Malgré des progrès considérables dans les traitements immunosuppresseurs, le rejet d'allogreffe reste une cause majeure de la perte du greffon. Dans ce domaine, des études récentes ont souligné l'importance du rejet humoral (AMR) comme un facteur contributif important à l’évolution, précoce ou tardive, de la maladie vasculaire du greffon et, in fine, à la perte de ce greffon. La pierre angulaire du diagnostic de rejet repose sur la biopsie endomyocardique (BEM) et l'évaluation histopathologique classique. Cependant, les épisodes de rejet observés sont aujourd'hui plus rares et plus complexes qu'auparavant, du fait de la présence de formes tronquées, indolentes et mixtes empêchant un diagnostic précis avec une évaluation conventionnelle. En outre, la BEM est une procédure invasive, entrainant des coûts importants, un inconfort pour le patient et un risque non négligeable de complications graves. Par conséquent, l'évaluation histologique conventionnelle ne reflète pas la complexité du rejet de greffe cardiaque et a besoin d'améliorations en termes de diagnostic. Le travail présenté dans cette thèse explore deux types de biomarqueurs, la voie mTOR, marqueur in situ, et les micro-ARNs, marqueurs circulants, qui permettraient une meilleure classification du rejet et constitueraient une aide diagnostique et/ou prédictive à la pratique clinique quotidienne lors du suivi des patients transplantés. / Cardiac transplantation is currently the only option for long-term treatment for patients with terminal heart failure. Despite considerable advances in immunosuppressive therapy, allograft rejection remains a major cause of graft loss. In this regard, recent studies have highlighted the importance of antibody-mediated rejection (AMR) as an important contributory factor in the evolution of vascular graft disease and, ultimately, graft loss. The cornerstone of the rejection diagnosis is based on endomyocardial biopsy (EMB) and the classical histopathological evaluation. However, rejection episodes observed today are becoming scarce and more complex than before, due to the presence of truncated, indolent and mixed forms preventing an accurate diagnosis with a conventional assessment. In addition, the biopsy is an invasive procedure, resulting in significant costs, discomfort for the patient and a significant risk of serious complications. Therefore, conventional histological assessment does not reflect the complexity of cardiac transplant rejection and needs improvement in terms of diagnosis. The work presented in this thesis explores two types of biomarkers, the mTOR pathway, an in situ marker, and the micro-RNAs, circulating markers that would allow a better classification of rejection and provide diagnosis and/or predictive help to daily clinical practice during the monitoring of transplant patients.

Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune chronique fréquente au cours l'enfance qui résulte de la destruction des cellules ß des îlots de Langerhans produisant l'insuline (seule hormone régulant la glycémie).Contrairement à l'administration d'insuline exogène, la greffe d'îlots pancréatiques restaure une production endogène d'insuline et prévient ainsi plus efficacement la morbi-mortalité résultant du diabète.Malheureusement, la fonction des îlots greffés diminue avec le temps du fait de la réponse alloimmune qui se développe contre les molécules HLA spécifiques du donneur. Le système immunitaire adaptatif du receveur peut détruire les îlots allogéniques par deux mécanismes: le rejet cellulaire impliquant les lymphocytes T cytotoxiques et le rejet humoral (RH) impliquant les anticorps anti-donneur (ASD).Alors qu'en transplantation d'organe, le RH est reconnu comme la principale cause de perte des organes, son rôle dans la greffe d'îlots est encore mal défini.Notre objectif est de: i) caractériser la réponse humorale allo-spécifique après greffe d'îlots, et ii) déterminer l'impact des ASD sur la fonction du greffon.Notre travail confirme que la greffe d'îlots est un évènement immunisant pour les receveurs. Le risque de développer des ASD augmente après réduction/arrêt des immunosuppresseurs. Cependant, à l'inverse de la transplantation d'organe, les ASD n'ont pas d'effet délétère sur la survie du greffon en clinique. En utilisant des modèles murins, nous démontrons que les îlots allogéniques sont résistants au RH alors que les ASD peuvent détruire les cellules ß in vitro. Cette résistance au RH s'explique par la combinaison i) d'une séquestration vasculaire des ASD, qui ne peuvent pas accéder aux cellules ß allogéniques in vivo et ii) le fait que contrairement à la vascularisation des organes transplantés qui provient du donneur, celle des îlots greffés provient du receveur / Type 1 diabetes, the most prevalent chronic diseases of childhood, is caused by an autoimmune-mediated destruction of pancreatic insulin-producing ß cells, the unique cells responsible for glucose level regulation.In contrast to exogenous insulin administration, pancreatic islet grafting restores endogenous secretion, which more efficiently prevents secondary end-organ complications and life-threatening events.Unfortunately, islet graft function decreases over time due to alloimmune response that developed against donor-specific HLA molecules. Recipient’s adaptive immune system can destroy allogeneic islets through two distinct mechanisms: cellular rejection by cytotoxic T-cells and antibody-mediated rejection (AMR). Donor-specific anti-HLA antibodies (DSA) are increasingly recognized as the prime cause of solid organ transplant failure, but the impact of the humoral alloimmune response of recipient on islet graft remains ill defined.Our thesis aimed at: i) characterizing the humoral alloimmune response of islet graft recipients, and ii) determining the impact of DSA on islet graft.Our work confirms that islet grafting is an HLA sensitizing event for recipients. The risk of DSA generation increases with the reduction/discontinuation of immunosuppressive drugs. However, in contrast with solid organ transplantation, DSA did not negatively impact graft survival in the clinic. Using a combination of murine models, we demonstrate that allogeneic islets are indeed resistant to AMR despite the fact that DSA can destroy islet cells in vitro. The resistance of allogeneic islets to AMR is explained by the combination of i) vascular sequestration of DSA, which are unable to access the allogeneic ß cells in vivo and ii) the fact that unlike vascularization of transplanted organs (that comes from the donor), islet graft vascularization develops from the recipient

La transplantation pulmonaire est depuis une vingtaine d’années une option thérapeutique valide pour une grande variété de pathologies pulmonaires au stade terminal. Malgré les progrès réalisés ces dernières années en matière de traitement immunosuppresseur, les rejets restent une cause majeure de la perte du greffon. Plusieurs études ont souligné l'importance du rejet aigu comme un facteur contributif important à l’évolution de la dysfonction chronique du greffon (ou CLAD) et, in fine, à la perte du greffon. Par conséquent, des outils diagnostiques fiables de rejet aigu s’imposent pour mieux prévenir le CLAD. Dans notre première étude, nous avons évalué les marqueurs tissulaires de rejet aigu humoral (RAH) pulmonaire. Nous avons montré ainsi que les lésions histologiques dont l’inflammation microvasculaire ne sont pas spécifiques et le marquage C4d est un marqueur utile pour confirmer le diagnostic de RAH. Dans un second temps, nous avons étudié en cytométrie de flux la polarisation des macrophages obtenus par lavage bronchiolo-alvéolaire (LBA) chez des patients transplantés avec et sans rejet. Nos résultats montrent les limites des marqueurs membranaires (HLA-DR et CD206) dans l’évaluation de l’état de polarisation des macrophages au cours des rejets. Ce travail montre l’intérêt des marqueurs tissulaires, en particulier le marquage C4d, dans le suivi des patients transplantés pulmonaires et souligne la nécessité d’identifier des marqueurs appropriés et utilisables en cytométrie de flux pour avancer sur l’état de polarisation des macrophages alvéolaires. / Lung transplantation is considered as a valid therapeutic option for patients with end-stage lung disease. Despite considerable progress in immunosuppressive therapy, allograft rejection remains a major cause of graft loss. Multiple studies have highlighted the importance of acute rejection as an important risk factor for the development of chronic lung allograft dysfunction (CLAD) leading to graft failure. Therefore, the improvement in the diagnosis of acute rejection represents a major challenge to prevent CLAD. In this study, we evaluated the tissue markers of acute antibody-mediated rejection (AMR) in lung transplantation. In our experience, the histopathologic findings including the microvascular inflammation in pulmonary AMR are not specific and C4d staining is a useful marker to confirm the diagnosis of AMR. Secondly, we investigated by flow cytometry the polarization of alveolar macrophage obtained by bronchoalveolar lavage (BAL) from lung transplant patients with and without acute rejection. Our results show the limits of surface markers (CD206 and HLA-DR) in the evaluation of alveolar macrophage polarization. This study shows the interest of tissue markers, especially the C4d staining, in monitoring of lung transplant patients and highlights the need to identify appropriate and available markers for future studies of alveolar macrophage polarization by flow cytometry.