Ce travail de thèse avait pour objectif d’élaborer un système vecteur ciblantl’endothélium pathologiquement activé dans les tissus enflammés, infectés ou tumoraux.Ce vecteur est sous forme de nanoparticules décorées de ligands glycosides capablesd’interagir avec l’E-sélectine, un récepteur exprimé sur les cellules endothélialesactivées.Nous avons mis au point une synthèse de copolymère amphiphile avec une architectureà bloc muni sur sa partie hydrophile d’un ligand glucidique. Ce copolymère a été par lasuite utilisé pour la préparation de nanoparticules de type coeur/couronne. La partiehydrophobe centrale est entourée d’une couronne hydrophile dont l'encombrementstérique et la mobilité limitent l'opsonisation de la particule. Le ciblage actif a été assurépar la présence d’un ligand du récepteur de l’E-sélectine aux extrémités des chaînes depolymères hydrophiles à la surface du vecteur.Avec ces nanoparticules dont les propriétés de surface sont prédéfinies, nous avonsmontré in vitro l’association efficace avec les cellules endothéliales activées, ce qui apermis de valider ce concept de ciblage moléculaire actif par l’intermédiaire du couplerécepteur/ ligand. Un tel système permettra d’améliorer l’indice thérapeutique et labiodistribution des principes actifs anti-inflammatoire et/ou anticancéreux. / The objective of this work was to develop a delivery system targeting pathologically activated endothelium within inflamed, infectious, and some tumoral tissues. This system is composed of nanoparticles bearing sugar residues that are able to recognize and interact with E-selectin, a receptor expressed on the activated endothelial cells.We synthesized an amphiphilic block copolymer with the hydrophilic part terminated by a carbohydrate ligand. The construction was achieved by a combination of click chemisty, ring-opening polymerization and atom transfer radical polymerization. This copolymer was used to prepare nanoparticles of the core/shell type where the central hydrophobic body is surrounded with the hydrophilic shell that can stabilize the particles in aqueous media and limit their opsonisation. Active targeting was achieved by coupling an analogue of sialyl Lewis X, the physiological ligand of E-selectin to the end of the hydrophilic polymer chains on the surface of the particles.We were able to demonstrate in vitro the efficient association of these nanoparticles with defined surface properties with activated endothelial cells. This allowed us to validate our concept of active molecular targeting using this couple receptor/ligand couple. Such a system could be used to improve the therapeutically index and the biodistribution of anti-inflammatory and anti-tumor drugs.

Diabetes mellitus und seine schwerwiegenden Folgen im Gefäßsystem stellen ein großes Problem der heutigen Gesellschaft dar. Ein wichtiger Aspekt der Erkrankung sind die Mikro- und Makroangiopathien, die im schlimmsten Fall zum Apoplex oder Tod führen. Es existieren bereits Hinweise, dass proinflammatorische Zytokine wie TNFα an der Entstehung des Diabetes mellitus beteiligt sind. TNFα führt zu einer Aktivierung der DLK und ihrer untergeordneten Kinase JNK, was in Betazellen zur Apoptose führt. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Regulation der DLK in Gefäßzellen untersucht werden. Zusätzlich wurde die Angiogenese bei diät-induzierter Adipositas und Diabetes melitus in einem Mausmodell untersucht. Immunhistochemische Untersuchungen zeigen, dass die DLK in Endothelien und in glatten Muskelzellen der Aorta exprimiert wird. Um die Aktivierung und somit die Phosphorylierung der DLK zu untersuchen, wurde ein spezieller Antikörper, der an S-302 der DLK bindet, bei der Immunoblotanalyse verwendet. Eine Phosphorylierung an S-302 entspricht einer Aktivierung der DLK. Eine Behandlung von humanen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVECs) mit TNFα zeigen eine Phosphorylierung der DLK und ihrer untergeordneten Kinase JNK. Eine Aktivierung durch Leptin oder dem vaskulären Wachstumsfaktor (VEGF) konnte hingegen nicht gezeigt werden. Zusätzlich zeigt eine Behandlung mit dem JNK-Inhibitor SP600125 eine verminderteTNFα-induzierte DLK- und JNK-Phosphorylierung, was zu der Annahme führt, dass in HUVECs die Aktivierung von JNK zu einer Phosphorylierung der DLK führt. Die Untersuchungen im Tiermodell lieferten Hinweise, dass die Regulation von TNFα ein entscheidender therapeutischer Ansatzpunkt bei der Entstehung endothelialer Dysfunktion darstellt. Es wurde gezeigt, dass das Ausschalten nur eines Allels der DLK einen messbaren Unterschied in Zusammenhang mit früher Kollateralbildung nach Ischämie erbringt. In Zusammenschau der vorliegenden Ergebnisse kann festgestellt werden, dass die Regulation der DLK durch TNFα in endothlialen Zellen einen wichtigen Aspekt in der Entwicklung der endothelialen Dysfunktion darstellt und dass die DLK als kollateralfördernde Kinase eine wichtige Rolle in der Revaskularisierung nach Ischämie spielt.

Yes / Alterations of Endothelial cells (ECs) play a critical role in different pathogenesis of many serious human diseases, and dysfunction of the vascular endothelium is an indicator for human disorders. Endothelial dysfunction is considered to be an early indicator for atherosclerosis, which is characterised by overexpression of adhesion molecules, including intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1). Hydrogen peroxide (H2O2) released via neutrophils is an important mediator of endothelial cell function. Ambient production of superoxide anion (O2−) and subsequently H2O2 at low levels is critical for regulating endothelial cell functions and proliferation. In this study, we investigated the effects of H2O2 on the expression of adhesion molecules VCAM-1 and ICAM-1 in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Intracellular superoxide anion production was detected by using p-Nitro Blue Tetrazolium (NBT) assay. Our results showed that administration of 100μM of H2O2 on HUVECs for 2, 6, 12 and 24 h induced a time-dependent increase in ICAM-1 and VCAM-1 mRNA and protein expression levels with a significant increase observed from 6 h. HUVECs exposed to H2O2 exhibit increased O2−, suggesting that H2O2 induced oxidative stress may be a reasonable for atherosclerosis. This increase can be reduced by the flavonoid, N-acetyl cysteine (NAC). The modulation of endothelial cell function through this mechanism may underlie the contribution of H2O2 to the development of vascular disease.

Ce travail de thèse avait pour objectif d'élaborer un système vecteur ciblantl'endothélium pathologiquement activé dans les tissus enflammés, infectés ou tumoraux.Ce vecteur est sous forme de nanoparticules décorées de ligands glycosides capablesd'interagir avec l'E-sélectine, un récepteur exprimé sur les cellules endothélialesactivées.Nous avons mis au point une synthèse de copolymère amphiphile avec une architectureà bloc muni sur sa partie hydrophile d'un ligand glucidique. Ce copolymère a été par lasuite utilisé pour la préparation de nanoparticules de type coeur/couronne. La partiehydrophobe centrale est entourée d'une couronne hydrophile dont l'encombrementstérique et la mobilité limitent l'opsonisation de la particule. Le ciblage actif a été assurépar la présence d'un ligand du récepteur de l'E-sélectine aux extrémités des chaînes depolymères hydrophiles à la surface du vecteur.Avec ces nanoparticules dont les propriétés de surface sont prédéfinies, nous avonsmontré in vitro l'association efficace avec les cellules endothéliales activées, ce qui apermis de valider ce concept de ciblage moléculaire actif par l'intermédiaire du couplerécepteur/ ligand. Un tel système permettra d'améliorer l'indice thérapeutique et labiodistribution des principes actifs anti-inflammatoire et/ou anticancéreux.

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Cardiovascular diseases are a broad group of diseases, such as heart attack and heart failureaffecting the cardiovascular system. The primary cause of cardiovascular diseases isatherosclerosis, and its progression is brought about by oxidative stress and a complex chronicinflammation reaction cascade. Of central importance are proinflammatory cytokines, regulatedby multiple factors, including interleukin (IL) 17A. This project aims to investigate the effectof IL-17A on the inflammatory response of human vascular endothelial cells by quantifyingchemokine C-X-C motif ligand-1 (CXCL1) release when exposed or not to otherproinflammatory mediators such as TNF-𝛼, IL-6 and IL-1β. To investigate this, humanumbilical cord endothelial cells were cultured and then stimulated with IL-17A alone or incombination with other cytokines, namely IL-6/sIL6R, IL-1β, or TNF-𝛼. After an appropriateincubation time following the stimulations, the supernatants of the cells were collected, and theamount of CXCL1 was analysed with ELISA or qPCR, respectively. At a lower concentration(10ng/ml), IL-17A failed to induce a significant level of CXCL1 release from endothelial cells.However, IL-17A + TNF-𝛼 (5ng/ml) greatly enhanced, higher than inductions from individualtreatments combined, level of CXCL1 release from endothelial cells. Furthermore, combiningIL-17A with IL-1β or IL-6 induced non-abundant and abundant upregulation in CXCL1 release,respectively. On transcription level, the amount of CXCL1 mRNA induced by IL-17A alonewas non-significant, but stimulation with TNF-𝛼 and IL-17A + TNF-𝛼 induced significantlyupregulated expression of CXCL1. In conclusion, we found that IL-17A induced synergeticrelease of CXCL1 in human vascular endothelial cells with TNF-𝛼. In addition, the synergisticimpact of IL-17A and TNF-𝛼 in terms of CXCL1 induction in vascular endothelial cells wasevident on a transcriptional level. Our data imply that combined blockage of IL-17A and TNF-𝛼 could have an enhanced therapeutic effect on vascular inflammation.