Orientador: Mario José Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:03:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_TiagoGomes_D.pdf: 9136785 bytes, checksum: 25c68d3dd56714d164986b415f98070d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A resistência à insulina está presente na obesidade e na diabetes tipo 2, e está associada à hiperplasia das ilhotas pancreáticas e hiperinsulinemia como resposta compensatória, entretanto, as forças motrizes por trás desse mecanismo compensatório não são totalmente compreendidos. Dados anteriores sugeriram o envolvimento de um fator circulante desconhecido que na resistência à insulina atua como um fator de crescimento das células ?. Neste contexto, procurando por candidatos a serem este fator circulante, percebemos que o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) é um forte candidato a ser este elo entre a resistência à insulina e o aumento da massa de ilhotas / hiperinsulinemia. Nossa abordagem teve como objetivo mostrar uma possível relação de causa-efeito entre o aumento dos níveis circulantes de HGF e a hiperplasia da ilhota / hiperinsulinemia compensatória, assim mostrando a força da associação. Ainda, se esta associação, apresenta ou não uma resposta dose-dependente, temporalidade, consistência, plausibilidade e reversibilidade. Nesse sentido, os nossos dados mostraram: a) uma correlação forte e consistente entre o HGF e o mecanismo de compensação em três modelos animais de resistência à insulina; b) o HGF aumenta a massa de célula ? de uma forma dose-dependente; c) o bloqueio do HGF interrompe os mecanismos de compensação; d) o aumento nos níveis de HGF precede a resposta compensatória associada com a resistência à insulina, indicando que estes eventos ocorrem em um modo sequencial. Além disso, o bloqueio do receptor de HGF (Met) piorou a já prejudicada sinalização da insulina no fígado de ratos obesos induzidos por dieta. Em geral, os nossos dados indicam que o HGF é um fator de crescimento que desempenha um papel fundamental no aumento da massa de ilhotas e hiperinsulinemia em ratos obesos induzidos por dieta, e sugerem um efeito protetor da interação HGF-Met na sinalização de insulina no fígado / Abstract: Insulin resistance is present in obesity and in type 2 diabetes, and is associated with islet cell hyperplasia and hyperinsulinemia but the driving forces behind this compensatory mechanism are incompletely understood. Previous data have suggested the involvement of an unknown circulating insulin resistance-related ?-cell growth-factor. In this context, looking for candidates to be a circulating factor, we realized that hepatocyte growth factor (HGF) is a strong candidate as a link between insulin resistance and increased mass of islets/hyperinsulinemia. Our approach aimed to show a possible cause-effect relationship between increase in circulating HGF levels and compensatory islet hyperplasia/hyperinsulinemia by showing the strength of the association, whether or not is a dose-dependent response, the temporality, consistency, plausibility and reversibility of the association. In this regard, our data showed: a) a strong and consistent correlation between HGF and the compensatory mechanism in three animal models of insulin resistance; b) HGF increases ?-cell mass in a dose-dependent manner; c) blocking HGF shuts down the compensatory mechanisms; d) an increase in HGF levels seems to precede the compensatory response associated with insulin resistance, indicating that these events occur in a sequential mode. Additionally, blockages of HGF receptor (Met) worsen the impaired insulin-induced insulin signaling in liver of diet-induced obesity rats. Overall, our data indicate that HGF is a growth factor playing a key role in islet mass increase and hyperinsulinemia in diet-induced obesity rats, and suggest a protective effect of the HGF-Met axis on insulin signaling in the liver / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Ciências

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O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Luiz Fernando de Rezende / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:31:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kurauti_MirianAyumi_M.pdf: 1902413 bytes, checksum: ff555addcb6b815d619a2368635ae4f4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A hiperinsulinemia, frequentemente associada a doenças como obesidade e diabetes tipo 2, decorre do aumento da secreção e redução do clearance de insulina, processo que acontece principalmente no fígado pela ação da IDE ("insulin degrading enzyme"), principal enzima responsável pela degradação da insulina. Sabe-se que o exercício físico reduz a insulinemia, entretanto, seu efeito sobre o clearance de insulina ainda não está totalmente esclarecido. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do exercício físico agudo sobre o clearance de insulina e expressão proteica de IDE, em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica. Camundongos C57BL6 foram distribuídos em 3 grupos: Controle (CTL), Obeso (O) e Obeso Exercitado (OE) e, submetidos a 12 semanas de dieta CHOW (CTL) ou hiperlipídica (O e OE). O exercício físico agudo foi realizado em esteira com duração de 3 horas (intensidade de 60-70% do VO2máx). Após o exercício, tolerância à glicose (ipGTT), à insulina (ipITT) e ao piruvato (ipPTT), bem como o clearance de insulina foram avaliados. Os camundongos foram eutanasiados por decapitação para coleta de sangue e órgãos como: fígado, tecido adiposo perigonadal, músculo esquelético gastrocnêmio e pâncreas, do qual foram isoladas as ilhotas pancreáticas para avaliar a secreção de insulina estimulada por glicose. Proteínas foram extraídas dos tecidos para análise da expressão proteica de IDE, IR, p-Akt e p-AMPK (Western blot). Testes estatísticos ANOVA One-Way seguido de pós-teste Tukey foram empregados para análise dos resultados. Comparado ao grupo CTL, camundongos do grupo O apresentaram aumento da massa corporal e de tecido adiposo perigonadal, hiperglicemia, hiperinsulinemia, intolerância à glicose e à insulina, aumento da glicemia durante o ipPTT, hipersecreção e redução do clearance de insulina, além de redução da expressão proteica de IDE, IR e p-Akt no fígado e, redução de p-AMPK no tecido adiposo perigonadal e também no fígado. Como esperado, o exercício agudo não alterou a massa corporal e a massa do tecido adiposo perigonadal, entretanto reduziu a glicemia e insulinemia, melhorou a tolerância à glicose e à insulina, reverteu o aumento da glicemia durante o ipPTT, reduziu a secreção de insulina e aumentou o clearance de insulina dos camundongos OE. Além disso, aumentou a expressão proteica de IDE, IR e p-Akt no fígado e músculo gastrocnêmio e, aumentou a p-AMPK apenas no músculo gastrocnêmio desses camundongos. Os resultados demonstram que apenas uma sessão de exercício físico pode melhorar significativamente a homeostase glicêmica de camundongos obesos. Em adição, o exercício agudo, além de reduzir a secreção de insulina, aumentou o clearance desse hormônio, justificando a redução da insulinemia nesses obesos. Tal aumento no clearance de insulina ocorre provavelmente via aumento da expressão proteica de IR e IDE no fígado e músculo gastrocnêmio, indicando um possível novo mecanismo pelo qual o exercício físico reduz a insulinemia. Estes resultados mostram a importância do clearance de insulina na regulação desse hormônio em obesos. Portanto, estratégias farmacológicas dirigidas ao aumento do clearance de insulina pode ser uma ferramenta importante na prevenção e/ou tratamento de doenças associadas à hiperinsulinemia, como obesidade e Diabetes tipo 2 / Abstract: Hyperinsulinemia is often associated with pathological conditions such as obesity and type 2 diabetes. It occurs by increase in insulin secretion and decrease in insulin clearance that occurs, mainly, in liver by insulin degrading enzyme (IDE), the main responsible for insulin degradation. It is known that exercise reduces insulinemia, however, its effects on insulin clearance remain unclear. The aim of this study was to investigate the effect of a single bout of acute exercise on insulin clearance and IDE protein expression in mice fed a high-fat diet. C57BL6 male mice were distributed in three groups: Control (CTL), Obese (O) and Exercised obese (OE), fed for 12 weeks with CHOW diet (CTL) or high-fat diet (O and OE). Acute exercise was performed on a treadmill for 3 hours (60 ¿ 70% of VO2 máx). After, glucose tolerance (ipGTT), insulin tolerance (ipITT), piruvate tolerance (ipPTT), and insulin clearance was evaluated. Mice were beheaded to obtain blood and organs samples such as liver, gastrocnemius skeletal muscle, perigonadal adipose tissue and pancreas. The islets were isolated by pancreases digestions with collagenase, and used to evaluate the insulin secretion stimulated by glucose. Protein from various tissues was extracted and the expression of IDE, IR, p-Akt and p-AMPK were assessed (Western blot). ANOVA One-Way and Tukey post-test were used for the analysis of the results. Compared to the CTL group, the O group showed increased body and perigonadal adipose tissue masses, hyperglicemia, hyperinsulinemia, glucose and insulin intolerance, higher glycemia during ipPTT, hypersecretion and lower insulin clearance, in addition to reduction of IDE, IR and p-Akt protein expression in liver, and, p-AMPK reduction also in liver and perigonadal adipose tissue. As expected, acute exercise did not alter body and perigonadal adipose tissue masses, however it reduced glycemia and insulinemia, improved glucose and insulin tolerance, reversed higher glycemia during ipPTT, decreased insulin secretion and increased insulin clearance in obese mice. Moreover, acute exercise increased the expression of IDE, IR and p-Akt proteins in liver and gastrocnemius muscle, and p-AMPK only in gastrocnemius muscle in these obese mice. These results show that acute exercise improves glucose homeostasis in obese mice. In addition, besides the reduction in insulin secretion, the increase in insulin clearance, induced by exercise, explain the lower insulinemia in OE group. This increased insulin clearance occurs most likely by the augment in the expression of IDE and IR proteins in liver and gastrocnemius muscle, suggesting a new possible mechanism whereby acute exercise reduces insulinemia. Taken all together, this study demonstrate that insulin clearance is very important to insulin regulation in obese. Therefore, pharmacological strategies targeting to increase insulin clearance may be an important way to prevention and/or treatment of diseases associated with hyperinsulinemia, such as obesity and type 2 diabetes / Mestrado / Fisiologia / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Metformineinnahme scheint reproduktive und metabolische Funktionen bei Frauen mit PCOS zu verbessern. Die zwiespältige aktuelle Studienlage kann bisher keine konkrete Aussage liefern, ob Metformin eine erfolgreiche therapeutische Möglichkeit des Syndroms darstellt. Ziel der vorliegenden randomisierten, placebo-kontrollierten Studie war es, die Auswirkung des antihyperglykämischen Medikaments Metformin in Kombination mit Ernährungsberatung und Sport auf übergewichtige Frauen mit PCOS zu ermitteln. Besondere Aufmerksamkeit galt der Wirkung des Medikaments hinsichtlich Insulin und Glukose-Stoffwechsel, endokrinologischen und biochemischen Parametern, sowie dem Menstruationszyklus. 46 adipöse Frauen mit PCOS im Alter von 22 bis 39 Jahren und mit einem mittleren BMI von 38,1 nahmen an der Studie teil. Die verabreichte Dosis von Metformin betrug 1,5 g (3x500 mg) täglich über einen Zeitraum von 16 Wochen. Gemessen wurden Veränderungen von FSH, LH, Oestradiol, Testosteron, DHEA-S, SHBG, Cholesterol, Triglyzeriden, Insulin, Glukose, HbA1c, Leptin und IGF-I im Serum. Monatlich wurde eine Ernährungsberatung angeboten. Jede Teilnehmerin erhielt darüber hinaus individuelle dietätische Beratung. Signifikante Gewichtsreduktion (P / Use of metformin seems to improve reproductive and metabolic abnormalities in women with PCOS. However, the disparity of results in clinical studies cannot give us a conclusive answer if metformin is a new line therapy of the syndrome. The present randomised, placebo-controlled study was designed to compare the antihyperglycemic drug metformin vs. placebo combined with lifestyle modification in the treatment of polycystic ovary syndrome in obese women. Special attention was paid to the effects of this medication on insulin and glucose metabolism, endocrine and biochemical parameters, and menstrual function. Forty six obese women with PCOS, aged between 22-39 years and mean BMI 38.1 were randomized to receive either metformin (500 mg three times a day for 16 weeks) or placebo. The metformin and placebo groups were matched for age, endocrinological and metabolic parameters. Changes in FSH, LH, estradiol, testosterone, DHEA-S and SHBG, total cholesterol, triglycerides, insulin, glucose, HbA1c, leptin and IGF-I were assessed. Group therapy with aspects in nutrition and physical activity was conducted monthly. Each woman received individual counselling by a dietician. Significant (P

Endometriumkrebs ist eine der häufigsten gynäkologischen Malignomen weltweit und wird in einen Typ I eingeteilt, welcher östrogenabhängig ist, und in eine Typ-II-Östrogen-unabhängige Form. Typ I ist der häufigste Fall und kommt in etwa für 75% bis 85% aller diagnostizierten Fälle in Frage. Erhöhte Östrogenspiegel haben gezeigt, das Risiko von Gebärmutterkrebsentwicklung zu erhöhen, genauso wie Östrogen die Proliferation von Endometriumzellen stimuliert und die Apoptose hemmt. Die Insulinresistenz scheint eine zentrale Rolle in der endometrialen Karzinogenese zu spielen und darüber hinaus werden Erkrankungen mit Insulinresistenz, wie zum Beispiel das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) und Adipositas, sowie Typ II-Diabetes mellitus (DM) als signifikantes Risiko angesehen, Faktoren für die Entwicklung und Progression von Typ-I-Endometrium-Krebs zu sein. Zusätzlich können PCOS-Patienten durch eine Fettleibigkeit in einem normoglykämischen Status eine unabhängige Insulin-Resistenz haben. In diesem Fall scheint die Hyperinsulinämie der fördernde Faktor zu sein, nicht nur für die Entwicklung als auch für die Tumorprogression.Aber auch erhöhte Blutzuckerspiegel tragen zum Wachstum und die Karzinogenese in Endometriumkarzinom bei und dienen als wichtige Verbindung zwischen dem beobachteten erhöhten Krebsrisiko bei Patienten mit Typ-II-DM. Die Behandlung mit einem Anti-Diabetikum, welches den Insulinspiegel senken kann, könnte einen allgemeinen Ansatz bieten gegen die Entwicklung von Krebs und zur Verringerung der Metastasierung. Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung einer 0,1 mM Metformin-Dosis auf das proliferative und metastatische Potential von Endometriumkrebszellen bewerten zu können, sowie die Analyse der Auswirkungen von kurz- und langfristigen Behandlungen auf intrazelluläre Signalwege der Endometriumkrebszellen.(Fortsetzung) (Fortsetzung)Ebenso soll der Zusammenhang der Entwicklung und der Progression von Krebszellen untersucht werden, wenn sie einer Umgebung mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen und hohen Insulinspiegeln ausgesetzt werden. Darüber hinaus ist eine endometriale dreidimensionale (3D) Cokultur zu standardisieren, für eine viabele Kultur bei 20 Tagen Kultivierung. Das proliferative Potential wurde unter Verwendung des CellTitle-Glo-Tests durchgeführt, und das metastatische Potential wurde unter Verwendung von Transwell-Migration und Invasion untersucht. Die mRNAExpression von MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 und JAG1 Gene wurden durch real-time PCR gemessen. Die kumulative Populationsverdopplungsrate wurde durch das Replikationsverhalten einer Endometriumkrebszelllinie durchgehend von 20 Tagen nach einer Behandlungsdauer bestimmt. In allen Assays wurden die Zellen durch Medien mit normaler (5,5 mM) oder hoher (17 mM) Glucosekonzentration, sowie in verschiedenen Gruppen behandelt: Kontrolle, Insulin, Metformin und Insulin+Metformin. Das 3D-Kokulturmodell wurde unter Verwendung von endometrialen Primärzellen und einer Endometriumkrebszelllinie hergestellt, wobei die Modellkonstruktion durch Matrigel® als extrazelluläre Matrix verwendet wurde. In dieser Studie hemmte die 0,1 mM Metformin-Dosis die Insulinwirkung stark und verringerte die Fähigkeit der endometrialen Krebszelllinie, in einer hohen und normalen Glukoseumgebung zu migrieren und einzudringen.(Fortsetzung) (Fortsetzung) Auf das proliferative Potential wurde dieser Effekt nicht beobachtet, allerdings reagierte die relative Zellproliferation empfindlich auf Metformin im Bereich zwischen 1 und 5 mM, unabhängig von der vorliegenden Glucosekonzentration. In den intrazellulären molekularen Mechanismen wurde beobachtet, dass die hohe Glukosekonzentration eine optimale Umgebung für endometriale Krebszellen schafft, um einen aggressiveren Genotyp und eine Resistenz gegenüber Metformin während einer Langzeitbehandlung zu zeigen. Darüber hinaus blieb das endometriale 3DKokulturmodell über 20 Kulturtage lebensfähig. Daher zeigte sich, trotz der Endometriumkrebszellen, eine Resistenz gegenüber dem Metformin-Effekt, wenn sie einer hohen Glucoseumgebung ausgesetzt waren. Die 0,1 mM Metformin-Dosis war in der Lage, die Insulinwirkung zu hemmen und das metastatische Potential der Zellen zu verringern, was darauf hindeutet, dass Metformin klinisch in Verbindung mit Insulin wirkt, sowie die indirekten und direkten Effekte als potentieller Wirkstoff in der Krebstherapie eingesetzt werden könnten. / O câncer de endométrio é uma das neoplasias ginecológicas com maior incidência, classificado como tipo I, estrógeno dependente, e tipo II, estrógeno nãodependente. O tipo I é a forma mais comum, ocorrendo em torno de 75 – 85 % dos casos de câncer de endométrio. Altos níveis de estrogênio têm sido relacionados ao aumento do risco de desenvolvimento do câncer de endométrio, pois estimula a proliferação celular e inibe a apoptose. A resistência à insulina parece desempenhar um papel central nesta neoplasia, e as doenças associadas à resistência à insulina como obesidade, Diabetes Mellitus (DM) tipo II e Síndrome dos Ovários Policísticos (PCOS) também são consideradas fatores de risco significantes para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio tipo I. Adicionalmente, pacientes com PCOS podem apresentar um quadro de resistência à insulina independente de obesidade, permanecendo em um estado glicêmico normal. Neste caso, a hiperinsulinemia isolada seria um fator tanto para a promoção, como também para a progressão do câncer. Entretanto, o aumento de níveis séricos de glicose, a hiperglicemia, também é considerada um fator independente para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio sendo um elo crítico entre o aumento do risco do desenvolvimento de câncer observado em pacientes com DM tipo II Dessa forma, tratamento utilizando agentes insulino-sensibilizantes, que atuam diminuindo a resistência à insulina e consequentemente reduzindo seus níveis pode ser uma estratégia interessante para prevenir o câncer e reduzir a disseminação metastática. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o efeito da dose de 0,1 mM de metformina sobre o potencial proliferativo e metastático das células de câncer de endométrio, assim como, avaliar o efeito do tratamento a curto e a longo prazo sobre vias de sinalização intracelular relacionadas ao desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio quando exposta a um ambiente com diferentes concentrações de glicose e níveis elevados de insulina. Por fim, a padronização de um modelo tridimensional (3D) de cocultura de células de endométrio que permanecesse viável ao longo de 20 dias de cultivo. O potencial proliferativo foi determinado pelo método luminescente CellTitle Glo, e o potencial metastático pelo o ensaio transwell de migração e invasão. Análises de expressão do mRNA dos genes MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 e JAG1 foram realizadas a partir da técnica de PCR em tempo real. O índice de duplicação populacional cumulativo das células determinou o comportamento de replicação da linhagem de câncer de endométrio ao longo do período de tratamento de 20 dias. Em todas os ensaios as células foram cultivadas em meio contendo concentrações normais (5,5 mM) ou altas (17 mM) de glicose, e divididas nos diferentes grupos de tratamento: controle, insulina, metformina e metformina associado a insulina. A padronização do modelo 3D de cocultura de células de endométrio foi realizado utilizando células primárias e células de linhagem de câncer de endométrio, a Matrigel® foi a matriz extracelular temporária utilizada para a construção do modelo. Neste estudo, a concentração de 0,1 mM de metformina inibiu a ação da insulina, diminuindo a habilidade de migração e invasão das células de câncer de endométrio independente da concentração de glicose presente no meio. Entretanto, este efeito não foi observado sobre o potencial proliferativo, sendo observada uma redução da proliferação das células de câncer de endométrio ao serem utilizadas concentrações maiores de metformina. Em relação aos mecanismos moleculares intracelulares, foi observado que na presença de altas concentrações de glicose as células de câncer de endométrio adquirem um genótipo mais agressivo e apresentam resistência ao efeito da metformina na dose de 0,1 mM durante o tratamento agudo. Além disso, foi possível a padronização de um modelo 3D de cocultura de células de câncer de endométrio que permanecesse viável ao longo dos 20 dias de cultivo. Contudo, apesar das células de câncer de endométrio apresentarem resistência ao efeito da metformina na presença de altas concentrações de glicose, a dose de 0,1 mM foi capaz de inibir o efeito da insulina e diminuir o potencial metastático dessas células, sugerindo que a metformina ao atuar clinicamente em combinação com seus efeitos indiretos e diretos pode ser um potencial agente adjuvante na terapia contra o câncer. / Endometrial cancer is one of the most common gynecological malignancies worldwide and is classified into a type I, which is estrogen-dependent, and a type II estrogen-independent form. The type I is the most common, accounting to 75%-85% of all cases of endometrial cancer. Elevated estrogen levels have been shown to increase the risk of endometrial cancer development, as estrogen stimulates endometrial cell proliferation and inhibits apoptosis. The insulin resistance seems to play a central role in endometrial carcinogenesis, furthermore, diseases associate with insulin resistance, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS), and obesity, as well as type II diabetes mellitus (DM) are considered as significant risk factors for the development and progression of type I endometrial cancer. Additionally, PCOS patients may have an insulin resistance independent of obesity remaining in a normoglycemic status. At this case, the hypeinsulinemia seems to be the promoter factor not only for the development but also for the cancer progression. However, also increased blood glucose levels are contributing to the growth and carcinogenesis in endometrial cancer and are acting as a critical link between the observed increased cancer risk in patients with type II DM. Therefore, the treatment with insulin-sensitizing agents that act through reducing insulin levels, could offer a general approach to prevent the development of cancer and reduce metastasis The aim of this study was to evaluate the effect of 0.1 mM metformin dose on the proliferative and metastatic potential of endometrial cancer cells, as well as, analyze the effects of short and long-term treatment on intracellular signaling pathways related to endometrial cancer development and progression when exposed to an environment with different glucose concentrations and high insulin levels. Additionally, the endometrial three-dimensional (3D) coculture standardization to remain viable over 20 culture days. The proliferative potential was performed by using CellTitle Glo assay, and the metastatic potential was performed by using transwell migration and invasion assay. The mRNA expression of MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 and JAG1 genes were measured by real time PCR. The cumulative population doubling rate was evaluated to determine the replication behavior of an endometrial cancer cell line throughout 20 days of treatment period. In all assays the cells were cultured in medium containing normal (5.5 mM) or high (17 mM) glucose concentration, and treated in different groups: control, insulin,metformin or combined treatment The 3D coculture model was established by using endometrial primary cells and an endometrium cancer cell line, to the model construction Matrigel® was used as an extracellular matrix. In this study, the 0.1 mM metformin dose potently inhibited the insulin action, decreasing the ability of the endometrial cancer cell line to migrate and invade in a high and normal glucose environment. On the proliferative potential this effect was not observed, however, relative cell proliferation sensitivity to metformin was observed in the range between 1 and 5 mM regardless of the present glucose concentration. In the intracellular molecular mechanisms, it was observed that the high glucose concentration creates an optimal environment for endometrial cancer cells to exhibit a more aggressive genotype and resistance to metformin during a long-term treatment. Moreover, the endometrial 3D coculture model remained viable throughout 20 culture days. Therefore, despite of endometrial cancer cells show resistance to the metformin effect when exposed to high glucose environment, the 0.1 mM metformin dose was able to inhibit the insulin action and decrease the metastatic potential of the cells, suggesting that metformin is acting clinically in combination with indirectly and direct effects could emerge as a potential agent in cancer therapy.